宣國(guó)紅 單平囡 茹金城 陳建江

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)紹興醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 紹興 312030)

G6PC基因在糖尿病患者中的表達(dá)及其與糖尿病腎病發(fā)生的相關(guān)性

宣國(guó)紅 單平囡 茹金城 陳建江

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)紹興醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 紹興 312030)

目的探討糖尿病(DM)患者外周血白細(xì)胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PC)基因的表達(dá)變化及其與糖尿病腎病(DN)發(fā)生的相關(guān)性。方法選取30例DM患者作為實(shí)驗(yàn)組(其中10例DN患者)，20例健康體檢者為對(duì)照組，采用RT-PCR法檢測(cè)DM患者外周血白細(xì)胞G6PC mRNA表達(dá)水平(以β-actin為內(nèi)參)，同時(shí)比較DN患者與腎功能正常DM患者之間G6PC mRNA表達(dá)差異。結(jié)果與對(duì)照組比較，DM組患者G6PC的mRNA表達(dá)明顯降低(0.65±0.19 vs 1.54±0.32，P<0.05)。DN組G6PC mRNA表達(dá)量顯著低于腎功能正常DM組患者(P<0.05)。結(jié)論DM患者外周血白細(xì)胞G6PC基因表達(dá)下降，其可能在DN發(fā)生及進(jìn)展中具有重要作用。

糖尿病;白細(xì)胞；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因

葡萄糖6磷酸酶(G6P)是人體葡糖糖代謝過(guò)程中重要的一種酶，也是糖異生和糖原分解過(guò)程中的限速酶，其活性及表達(dá)量的變化直接影響內(nèi)生糖的輸出，也直接與糖尿病(DM)的發(fā)生有關(guān)〔1，2〕。而G6P脫氫酶(G6PC)作為合成G6P的重要亞基，其表達(dá)能力的變化直接影響G6P的合成，也直接影響DM的發(fā)生。研究表明，可能受到腫瘤壞死因子(TNF)高表達(dá)的調(diào)控，糖尿病腎病(DN)患者白細(xì)胞中代謝酶基因的表達(dá)量下降，導(dǎo)致胰島素刺激時(shí)細(xì)胞攝取葡萄糖能力降低，從而加重胰島素抵抗，最終導(dǎo)致DM及其相關(guān)腎病的發(fā)生〔3〕。本研究探討G6PC基因表達(dá)的變化及其在DM及DN發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集紹興醫(yī)院2013～2014年收治的DN患者30例，均按1999年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)斷：空腹血漿葡萄糖≥7.0 mmol/L或隨機(jī)血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L，符合上述標(biāo)準(zhǔn)之一者，在次日復(fù)診仍符合三條標(biāo)準(zhǔn)之一者確診為DM患者，并排除與DM相關(guān)的其他內(nèi)分泌疾病、肝膽疾病等，其中20例為腎功能正?；颊?，10例為DN患者(24 h尿白蛋白排泄率連續(xù)兩次以上>30 mg/24 h)。20例對(duì)照組來(lái)自同期同年齡段健康體檢人群，均排除DN、腎臟疾病、高脂血癥、高血壓及心腦血管疾病病史，均簽訂知情同意書(shū)，并通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 TRIZOL試劑、無(wú)RNA酶的水(Invitrogen life technologies)；氯仿、異丙醇、100%乙醇、淋巴細(xì)胞分離液(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Invitrogen life technologies)，PCR儀(ABI公司)，高速離心機(jī)(貝克曼公司)。

1.3外周血白細(xì)胞的分離 將2 ml淋巴細(xì)胞分離液加入離心管中，取正常人或患者抗凝血液1 ml，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，混勻后小心加入淋巴細(xì)胞分離液上層，4 000 r/min離心15 min，離心后分為上層的血清，中間層的白細(xì)胞和下層的紅細(xì)胞，吸取白細(xì)胞，加入2 ml PBS，吹打混勻，2 000 r/min離心5 min，去上清，1×107細(xì)胞加入1 ml TRIZOL試劑，反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解，-80℃低溫冰箱保存。

1.4RNA的提取及RT-PCR 分離的白細(xì)胞采用TRIZOL試劑提取RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度，立即按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。G6PC基因序列上游引物5′- CATCGCCTGCGTTATCCTCA -3′,下游引物5′- CTGCAGTAGGTGGTTCTGCATC-3′,擴(kuò)增片段453 bp；同時(shí)以β-actin為內(nèi)參照物,上游引物5′- TGACGTGGACATCCGCAAAG -3′,下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG -3′,擴(kuò)增片段208 bp。以上引物均由大連寶生物工程公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳并與用凝膠成像儀(北京六一公司)成像及Image-Pro Plus軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析(以G6PC基因與β-actin的條帶積分光密度比值表示其mRNA 的表達(dá)水平)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

DM組G6PC mRNA表達(dá)量(0.65±0.19)顯著低于對(duì)照組(1.54±0.32，t=12.261，P=0.000)。DN組G6PC mRNA表達(dá)量(0.32±0.109)明顯低于腎功能正常的DM患者(0.74±0.22，t=9.962，P=0.003)。見(jiàn)圖1。

M:Marker;1,4:DN組；2，5：腎功能正常DM組；3，6：對(duì)照組圖1 各組G6PC mRNA表達(dá)

3 討 論

DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床主要表現(xiàn)出高血糖的致病特點(diǎn)〔4〕。G6P是調(diào)節(jié)血糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，它是一種結(jié)合膜蛋白系統(tǒng)，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)肝腎糖異生途徑的最后步驟，G6PC的表達(dá)量直接影響G6P的表達(dá)量，從而影響葡萄糖的代謝，或而導(dǎo)致DM的發(fā)生〔5〕。此外，DN是DM患者常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，是引起終末期腎臟疾病的主要病因。研究表明，DM患者近50%發(fā)生微量蛋白尿，近30%患者終末期會(huì)發(fā)生DN〔6〕。已有研究證實(shí)G6PC表達(dá)量降低與DN的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔7〕。DM時(shí)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)所誘發(fā)的機(jī)體代謝及血流動(dòng)力學(xué)改變致使腎臟組織發(fā)生病理改變。主要表現(xiàn)為系膜增生、基底膜增厚、腎小球硬化，進(jìn)而發(fā)展為DN。本研究發(fā)現(xiàn)DN患者外周血白細(xì)胞G6PC基因的表達(dá)量顯著低于正常人DN患者G6PC表達(dá)量顯著低于腎功能正常DM患者。這或許因DN患者微血管病變引起，而微血管病變是長(zhǎng)期及持續(xù)性高血糖作用的結(jié)果。DN發(fā)生時(shí)，腎臟組織以系膜增生為主，而TNF則主要通過(guò)抑制G6PC等葡萄糖代謝酶基因轉(zhuǎn)錄，而導(dǎo)致胰島素刺激細(xì)胞攝取葡萄糖能力降低，而促進(jìn)DM及DN的發(fā)生〔8～10〕。

1李俊燕,譚英姿,馮國(guó)鄞,等.糖尿病腎病遺傳學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.遺傳,2012;34(12):1537-44.

2Resaz R,Vanni C,Segalerba D,etal.Development of hepatocellular adenomas and carcinomas in mice with liver-specific G6Pase-α deficiency〔J〕.Dis Model Mech,2014;7(9):1083-91.

3張 松,朱 琳,郝 軍,等.血清TNF-α升高對(duì)糖尿病腎臟脂質(zhì)積聚的影響研究〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2014;30(8):1161-5.

4方顯鋒,劉德敏,孫 穎,等.葡萄糖和木糖醇對(duì)葡萄糖6磷酸酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用〔J〕.天津醫(yī)藥,2005;33(1):30-2.

5魏寒松,馬春紅,魏殿軍,等.葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基-2基因多態(tài)性及其血糖調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)糖尿病雜志,2014;22(7):664-6.

6王興盛.糖尿病腎病與糖尿病腎病合并非糖尿病腎病的病理及臨床特征分析〔J〕.醫(yī)學(xué)臨床研究,2015;32(1):151-2.

7Abbadi S,Rodarte JJ,Abutaleb A,etal.Glucose-6-phosphatase is a key metabolic regulator of glioblastoma invasion〔J〕.Mol Cancer Res,2014;12(11):1547-59.

8林子桐,張 超,沈雪梅,等.糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2014;28(5):765-73.

9Zheng BX,Lin Q,Li M,etal.Three novel mutations of the G6PC gene identified in Chinese patients with glycogen storage disease type Ⅰa〔J〕.Eur J Pediatr,2015;174(1):59-63.

10劉栩晗,李國(guó)生,朱 華,等.小檗堿對(duì)2型糖尿病中國(guó)地鼠肝臟葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008;18(4):9-13.

R587

A

1005-9202(2017)23-5843-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.043

陳建江(1968-)，男，副主任技師，主要從事糖尿病感染相關(guān)研究。

宣國(guó)紅(1969-)，女，副主任技師，主要從事糖尿病相關(guān)基因研究。

〔2016-09-24修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)