劉 濤 戴黎明 李曉晶 朱宏濤

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院手足顯微外科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病足患者外周血T細(xì)胞的分化

劉 濤 戴黎明 李曉晶 朱宏濤

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院手足顯微外科，湖北 宜昌 443000)

目的探討糖尿病足(DFU)患者外周血中T細(xì)胞分化情況及其功能。方法采用流式細(xì)胞術(shù)分析DFU患者外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群分布情況，包括初始T細(xì)胞、活化T細(xì)胞及效應(yīng)T細(xì)胞；分析DFU患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞遷移分子CC趨化因子受體(CCR)5、CCR4、CXC趨化因子受體(CXCR)3的表達(dá)情況；分析DFU患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞分泌炎癥因子干擾素(IFN)γ，白細(xì)胞介素(IL)2，腫瘤壞死因子(TNF)-α情況。結(jié)果與對照組比較，DFU患者外周血初始CD4+、CD8+T細(xì)胞比例顯著降低，活化與效應(yīng)T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)；遷移分子受體CCR4表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，CCR5與CXCR3表達(dá)在DFU患者中顯著降低(P<0.05)；DFU患者中，炎癥因子IFNγ在活化T細(xì)胞中高表達(dá)，在效應(yīng)T細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而IFNγ與TNF-α在效應(yīng)T細(xì)胞中高表達(dá)，在初始T細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。結(jié)論DFU患者外周血T細(xì)胞亞群發(fā)生變化，其分泌的炎癥因子影響了T細(xì)胞的免疫功能發(fā)揮。

糖尿病足；CD4+T細(xì)胞；CD8+T細(xì)胞；炎癥

糖尿病足(DFU)引起的損傷與多種因素相關(guān)，包括神經(jīng)損傷、微血管病變及免疫功能受損等〔1，2〕。目前治療方法主要依賴于下肢截肢，加上一些治療效果非常有限的新方法〔3〕。高血糖可以激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB，從而破壞淋巴細(xì)胞激活與遷移〔4〕。相反，促炎因子如白細(xì)胞介素(IL)6，腫瘤壞死因子(TNF)-α被發(fā)現(xiàn)在DFU患者中加重胰島素耐受〔5〕。盡管在DFU患者中發(fā)現(xiàn)有慢性炎癥，然而DFU的免疫系統(tǒng)無法正常驅(qū)動(dòng)有效的免疫應(yīng)答，對抗病菌侵害與組織再生〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，DFU的創(chuàng)面難愈不僅由于體內(nèi)有過量的促炎因子，并且還與抗感染因子的缺陷相關(guān)，如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β，IL10等〔7〕。而在炎癥與病菌耐受的平衡調(diào)控中，T細(xì)胞發(fā)揮重要的作用。在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞敲除對傷口愈合有負(fù)面影響，而CD8+T細(xì)胞的敲除有積極影響〔8〕。在DFU患者中，趨化環(huán)境與免疫細(xì)胞遷移的能力都發(fā)生了變化〔9〕，T細(xì)胞對于維持系統(tǒng)促炎環(huán)境有重要作用〔10〕。本文探究DFU患者免疫系統(tǒng)對傷口愈合的精確調(diào)控機(jī)制及外周血T細(xì)胞亞群的分布情況。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院2016年2～10月就診的DFU患者52例，男28例，女24例，年齡35～78(平均54)歲，自愿參加本研究，研究前均未接受放射性治療、化療或其他治療。年齡相匹配健康正常人為對照組48例，男25例，女23例，平均52歲。均獲得受試者的書面同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。儀器與試劑：細(xì)胞培養(yǎng)基〔RPMI，10%胎牛血清(FBS)，55 μmol/L 2-硫基乙醇，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 μg/ml谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素〕;流式分析儀器：BD公司的Calibure。流式熒光抗體均購自Biolegend公司。

1.2方法

1.2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞提取 取受試者25 ml外周血，采用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)梯度離心。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)分析樣品的制備

1.2.2.1細(xì)胞刺激 將分離得到的細(xì)胞重懸在1 ml細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入25 ng/ml佛波酯(PMA)和1 μg/ml離子霉素，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激5 h后收集細(xì)胞分析。

1.2.2.2流式抗體標(biāo)記 將細(xì)胞重懸在100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細(xì)胞標(biāo)3 μl流式抗體。置于4℃冰箱中避光孵育30 min，用1 ml PBS洗2次。后加入200 μl PBS上流式儀器分析。

1.3觀察指標(biāo) (1)分析兩組外周血中初始T細(xì)胞、活化T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞。(2)分析特異的皮膚遷移分子CC趨化因子受體(CCR)4的表達(dá)及早期炎癥性Th1細(xì)胞特異的分子CCR5和CXC趨化因子受體(CXCR)3的表達(dá)情況。(3)分析T細(xì)胞亞群中主要的炎癥性因子IL2，IFNγ，TNF-α表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血中初始、活化與效應(yīng)T細(xì)胞比較 DFU患者外周血中初始CD4+T細(xì)胞〔(19.8±2.2)%〕、CD8+T細(xì)胞〔(11.9±1.3)%〕比例顯著低于對照組〔(42.3±5.5)%、(21.5±2.4)%,P<0.01〕?；罨疌D4+T細(xì)胞的比值〔(53.8±5.7)%〕顯著高于對照組〔(18.4±2.1)%，P<0.05〕，CD8+T細(xì)胞〔(22.1±1.3)%、(21.7±1.8)%〕比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。DFU患者效應(yīng)CD4、CD8T細(xì)胞比例〔(18.6±1.8)%、(38.9±2.5)%〕顯著高于對照組〔(8.4±1.2)%、(20.4±2.7)%，P<0.05〕。

2.2DFU患者T細(xì)胞趨化因子受體表達(dá) CCR4主要表達(dá)于活化T細(xì)胞中，在CD4+T細(xì)胞中表達(dá)水平更高。兩組CCR4表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CCR5與CXCR3主要表達(dá)在活化T細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞中。DFU患者CCR5與CXCR3在CD4+與CD8+的效應(yīng)T細(xì)胞中表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)。見圖1。

與DFU組比較：1)P<0.05圖1 DFU患者T細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)

2.3DFU患者外周血T細(xì)胞炎癥因子分泌的變化 CD4+與CD8+中活化T細(xì)胞分泌的IL2〔(62.1±3.4)%、(54.6±2.7)%〕顯著多于初始T細(xì)胞〔(40.2±2.9)%、(21.6±1.3)%，P<0.01〕。IFNγ與TNF-α在活化細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞中均高表達(dá)，且效應(yīng)細(xì)胞中IFNγ〔(82.8±4.1)%、(81.7±4.6)%〕與TNF-α〔(82.3±6.1)%、(80.7±4.3)%〕表達(dá)均顯著高于活化細(xì)胞〔(43.1±3.8)%、(56.2±4.3)%，(63.1±5.8)%、(59.2±3.3)%，P<0.01〕。

3 討 論

早期有研究揭示了T細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)中炎癥與增殖的雙重作用，盡管創(chuàng)傷修復(fù)的損傷通常認(rèn)為與CD8+T細(xì)胞的作用相關(guān)，然而關(guān)于T細(xì)胞亞群在創(chuàng)傷修復(fù)中的具體作用還有待被闡明〔11〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DFU患者體內(nèi)存在的促炎環(huán)境導(dǎo)致了初始T細(xì)胞亞群的顯著性減少，同時(shí)伴隨著不同階段活化T細(xì)胞的積累。一些DFU患者在沒有出現(xiàn)足部潰瘍時(shí)，就已經(jīng)出現(xiàn)了效應(yīng)T細(xì)胞比例與數(shù)目的顯著性增加。說明效應(yīng)T細(xì)胞的積累是DFU患者中一個(gè)持續(xù)性的現(xiàn)象。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DFU患者中積累的效應(yīng)T細(xì)胞，是炎癥性因子IFNγ與TNF-α的主要來源，這些細(xì)胞因子反過來增強(qiáng)初始T細(xì)胞的激活與分化〔12〕。而且，活化T細(xì)胞通過產(chǎn)生低水平的IFN-γ與TNF-α也對系統(tǒng)性炎癥環(huán)境的形成有作用。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中，體內(nèi)抑制TNF-α可以顯著促進(jìn)傷口愈合〔13〕。本研究結(jié)果提示，DFU患者持續(xù)積累的CD4+與CD8+效應(yīng)T細(xì)胞可能與異常高表達(dá)INF-γ與TNF-α相關(guān)，可能導(dǎo)致了炎癥性受體表達(dá)的下降，從而影響了T細(xì)胞遷移到發(fā)炎的組織中去。在免疫治療策略上，可以通過降低T細(xì)胞活化與T細(xì)胞在組織中的積累降低DFU的病理性。

1Moura LI，Dias AM，Carvalho E，etal.Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review〔J〕.Acta Biomater,2013；9(7)：7093-114.

2Moura J，Borsheim E，Carvalho E.The role of microRNAs in diabetic complications-special emphasis on wound healing〔J〕.Genes，2014；5(4)：926-56.

3Kavitha KV，Tiwari S，Purandare VB，etal.Choice of wound care in diabetic foot ulcer：a practical approach〔J〕.World J Diabetes，2014；5(4)：546-56.

4Dickinson S，Hancock DP，Petocz P，etal.High-glycemic index carbohydrate increases nuclear factor-kappaB activation in mononuclear cells of young，lean healthy subjects〔J〕.Am J Clin Nutr，2008；87(15)：1188-93.

5Stegenga ME，van der Crabben SN，Dessing MC，etal.Effect of acute hyperglycaemia and/or hyperinsulinaemia on proinflammatory gene expression，cytokine production and neutrophil function in humans〔J〕.Diabet Med，2008；25(2)：157-64.

6Kaser S，Kaser A，Sandhofer A，etal.Resistin messenger-RNA expression is increased by proinflammatory cytokines in vitro〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003；309(2)：286-90.

7Gardner SE，Hillis SL，Heilmann K，etal.The neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors〔J〕.Diabetes，2013；62(3)：923-30.

8Mi Q，Riviere B，Clermont G，etal.Agent-based model of inflammation and wound healing：insights into diabetic foot ulcer pathology and the role of transforming growth factor-beta1〔J〕.Wound Repair Regen，2007；15(5)：671-82.

9Acosta JB，del Barco DG，Vera DC，etal.The pro-inflammatory environment in recalcitrant diabetic foot wounds〔J〕.Int Wound J，2008；5(4)：530-9.

10Bogdanski P，Pupek-Musialik D，Dytfeld J，etal.Influence of insulin therapy on expression of chemokine receptor CCR5 and selected inflammatory markers in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Int J Clin Pharmacol Ther，2007；45(6)：563-7.

11Mirza RE，Koh TJ.Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing〔J〕.Cytokine，2015；71(2)：409-12.

12Watts TH.Staying alive：T cell costimulation，CD28，and Bcl-xL〔J〕.J Immunol，2010；185(17)：3785-7.

13Siqueira MF，Li J，Chehab L，etal.Impaired wound healing in mouse models of diabetes is mediated by TNF-alpha dysregulation and associated with enhanced activation of forkhead box O1(FOXO1)〔J〕.Diabetologia，2010；53(2)：378-88.

R587.2

A

1005-9202(2017)23-5839-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.041

戴黎明(1975-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事手足創(chuàng)傷修復(fù)、整形美容研究。

劉 濤(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事骨科研究。

〔2017-05-27修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)