肖建華 董自強(qiáng) 游 艷

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科 三峽大學(xué)泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體及其與5-Fu聯(lián)合用藥對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

肖建華 董自強(qiáng) 游 艷1

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科 三峽大學(xué)泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

目的研究腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)單獨(dú)應(yīng)用及其與傳統(tǒng)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)體外培養(yǎng)人膀胱腫瘤T-24細(xì)胞生物學(xué)行為影響及可能機(jī)制。方法倒置顯微鏡下觀察不同濃度TRAIL作用不同時(shí)間后T-24細(xì)胞形態(tài)變化；MTT法檢測(cè)不同濃度TRAIL單獨(dú)或10 ng/ml TRAIL聯(lián)合不同濃度5-Fu不同時(shí)間后T-24細(xì)胞生存率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)T-24細(xì)胞凋亡率。結(jié)果TRAIL單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用有限，顯微鏡下部分細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，作用72 h后1、300、1 000 ng/ml組細(xì)胞生存率分別(92.52±3.60)%，(84.63±5.93)%和(79.45±2.04)%；單用200、400、600、800及1 000 μmol/ml 5-Fu時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(10.76±1.78)%、(14.17±2.75)%、(28.01±1.66)%、(20.17±1.68)%和(32.53±3.65)%，聯(lián)合10 ng/ml TRAIL處理后0、200、400、600、800及1 000 μmol/ml 5-Fu組細(xì)胞抑制率分別為分別為(3.85±0.88)%、(8.41±0.74)%、(16.39±2.72)%、(26.27±1.72)%、(28.99±3.36)%和(30.18±1.34)%；10、100、1 000 ng/ml TRAIL處理48 h后的細(xì)胞平均凋亡率為(3.75±0.31)%、(7.82±1.07)%、(7.78±3.15)%。結(jié)論TRAIL單用或聯(lián)合其他化療藥物對(duì)T24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用有限，同5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時(shí)不能明顯增加T-24細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。

TRAIL；T-24；聯(lián)合用藥；生長(zhǎng)抑制

目前以手術(shù)治療為主的綜合治療是膀胱癌的主要治療方法。任何保留膀胱的膀胱癌手術(shù)均存在復(fù)發(fā)可能，所以術(shù)后需定期做膀胱鏡復(fù)查，化療以預(yù)防膀胱癌的復(fù)發(fā)。而化療藥物常為一些毒性較高的藥物，灌注后會(huì)出現(xiàn)諸如尿路刺激癥狀、血尿等藥物毒副作用及厭食、惡心等胃腸道并發(fā)癥，而即使早期膀胱腫瘤經(jīng)尿道行腫瘤電切術(shù)后常規(guī)灌注化療其復(fù)發(fā)率依然高達(dá)50%以上〔1〕。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)為腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，參與身體自然防御，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生而對(duì)正常組織細(xì)胞的生長(zhǎng)分化沒(méi)有影響。同時(shí)，其還能增加多種腫瘤細(xì)胞對(duì)常用傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，或逆轉(zhuǎn)部分腫瘤細(xì)胞的耐藥性〔2〕，本文探討TRAIL及其同5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)體外培養(yǎng)人膀胱癌T-24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1主要材料與試劑 TRAIL為美國(guó)Peprotech公司產(chǎn)品(貨號(hào)：310-04，規(guī)格：50 μg/瓶)，5-Fu(上海浩然生物技術(shù)有限公司)、RPMI1640干粉、胰蛋白酶(武漢谷歌生物科技有限公司)、胎牛血清(杭州四季青)、抗生素(青霉素、鏈霉素，華北制藥)、碳酸氫鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、醫(yī)用級(jí)酒精(武漢市雪環(huán)醫(yī)用消毒用品有限公司)、臺(tái)盼藍(lán)(北京市華美公司)，二甲基亞砜(DMSO)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，ANNEXIN V-FITC/PI 雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，人膀胱癌T-24細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)T-24細(xì)胞所用培養(yǎng)基采用其推薦的RPMI1640干粉溶于雙蒸水配制，具體方法參照說(shuō)明書(shū)完成。細(xì)胞用25 ml玻璃培養(yǎng)瓶置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液，待顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，必要時(shí)行細(xì)胞傳代、凍存或收取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有過(guò)程確保為無(wú)菌操作。

1.3藥物及試劑準(zhǔn)備 不同濃度的TRAIL藥液：用去離子水將TRAIL藥物粉末溶解，然后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至1、3、10、30、100、300、1 000 ng/ml及其他所需工作濃度；不同濃度的5-Fu藥液：用高壓滅菌后的雙蒸水將藥物粉末溶解，然后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將其稀釋至200、400、600、800和1 000 μmol/ml。

1.4細(xì)胞形態(tài)觀察 不同濃度藥物作用期間定期觀察不同分組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，胞體、胞核形態(tài)，培養(yǎng)液的顏色等，直觀反映細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的各項(xiàng)指標(biāo)以確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行；預(yù)定時(shí)間處理完成后借助光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)抑制狀況，初步判斷其是否具有抑制人膀胱癌T-24細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

1.5MTT法測(cè)定單用及聯(lián)合用藥時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 每96孔培養(yǎng)板上的加樣分調(diào)零孔(等體積培養(yǎng)液)、陰性對(duì)照、不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物三部分。細(xì)胞用胰酶消化，配成細(xì)胞懸液后接種到96孔板(每孔2×104個(gè)細(xì)胞)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后施加處理因素。在不同的培養(yǎng)板中分別加入不同濃度TRAIL和5-Fu藥液，每孔100 μl且每種濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔；調(diào)零孔加入等體積的培養(yǎng)液，分別作用24，48和72 h。另分別配置不同濃度TRAIL和5-Fu混合藥液，使得混合后的藥液中5-Fu濃度分別為200、400、600、800、1 000 μmol/ml，而TRIAL濃度均為10 ng/ml。將混合藥液按上述方法加入培養(yǎng)孔，每種濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，分別作用24，48和72 h。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用胰酶消化并配成細(xì)胞懸液，均勻種植到6孔培養(yǎng)板，設(shè)0、10、100、1 000 ng/ml四組。待其貼壁后進(jìn)行換液，加入對(duì)應(yīng)濃度的TRAIL藥液；將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后棄去藥液，然后用胰酶消化細(xì)胞使其脫離培養(yǎng)板壁，用移液器吹打，轉(zhuǎn)入離心管，800 r/min離心5 min后棄去上清；用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗滌三次，棄上清； 按ANNEXIN V-FITC/PI 雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制緩沖液和染液，并對(duì)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞進(jìn)行染色，染色時(shí)間為15 min；將按預(yù)定程序處理后的細(xì)胞上流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差LSD法Tamhane法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度TRAIL作用后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好，呈梭形，生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)液清亮。而經(jīng)不同濃度TRAIL處理后細(xì)胞的生長(zhǎng)則受到輕度抑制，隨著藥物濃度增加，藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制程度有一定的增加趨勢(shì)，細(xì)胞體積稍變小，部分細(xì)胞的梭形變?yōu)椴灰?guī)則形狀，部分貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓甚至脫落。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度TRAIL處理24 h后T-24細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(×40)

2.2不同濃度TRAIL和5-Fu對(duì)T-24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 不同濃度TRAIL作用24 h后對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制最明顯的為100 ng/ml組，所有濃度組細(xì)胞生存率均在80%以上；作用48 h后以1 000 ng/ml組對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度最大。同一作用時(shí)間內(nèi)，隨著TRAIL 藥物濃度的不斷上升，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)(F=9.997，10.055，11.415；均P<0.01)，即TRAIL對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度呈一定的濃度依賴性；當(dāng)TRAIL藥物濃度為1 ng/ml時(shí)，作用24 h，48 h和72 h后其對(duì)T-24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制程度有一定差異(F=4.244，P<0.05)，其他濃度一定時(shí)(3，10，30，100，300，1 000 ng/ml)，作用不同時(shí)間后TRAIL對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度并無(wú)明顯差異(F=0.346，0.668，1.497，0.074，0.766，1.874；均P>0.05)。見(jiàn)表1。不同濃度5-Fu作用24 h后對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度最大為1 000 μmol/ml組，其次為600 μmol/ml組；作用48 h 600、800和1 000 μmol/ml組細(xì)胞生存率均低于70%；作用72 h 1 000 μmol/ml組細(xì)胞生存率最低，其次為800 μmol/ml組，相同作用時(shí)間下，隨著藥物濃度不斷上升，5-Fu對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，不同濃度組間存在顯著差異(F=44.130，56.379，124.851；均P<0.01)；當(dāng)5-Fu濃度為400 μmol/ml時(shí)，隨著作用時(shí)間不斷延長(zhǎng)，其對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度無(wú)明顯差異(F=1.056，P=0.384)，當(dāng)濃度為200，600，800和1 000 μmol/ml時(shí)，隨著作用時(shí)間不斷延長(zhǎng)，5-Fu對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度呈現(xiàn)出明顯增強(qiáng)趨勢(shì)(F=9.200，11.229，12.945，7.756；均P<0.05)，見(jiàn)表2。聯(lián)合10 ng/ml TRAIL處理48 h后0、200、400、600、800、1 000 μmol/ml 5-Fu組T-24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(3.85±0.88)%、(8.41±0.74)%、(16.39±2.72)%、(26.27±1.72)%、(28.99±3.36)%和(30.18±1.34)%，當(dāng)5-Fu藥物濃度為0(0)和800 μmol/ml〔(20.77±1.68)%〕時(shí)，聯(lián)合10 ng/ml TRAIL細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于單用同濃度5-Fu組(t=75.324，22.024；均P<0.01)。200、400、600和1 000 μmol/ml 5-Fu單藥處理〔(10.76±1.78)%、(14.17±2.75)%、(28.01±1.66)%、(32.53±3.65)%〕和聯(lián)合TRAIL處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度并沒(méi)有明顯差異〔t=5.891，1.310，2.130，1.460；均P<0.05〕。

表1 不同濃度TRAIL對(duì)T-24細(xì)胞生存率的影響

與同時(shí)點(diǎn)其他濃度組比較：1)P<0.01；與同濃度前一時(shí)間點(diǎn)比較：2)P<0.05，下表同

表2 不同濃度5-Fu對(duì)T-24細(xì)胞生存率的影響

2.3TRAIL對(duì)T-24細(xì)胞凋亡率的影響 10、100、1 000 ng/ml TRAIL處理T-24細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率分別為(3.75±0.31)%、(7.82±1.07)%和(7.78±3.15)%，較0 ng/ml組稍增高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔(1.41±0.51)%，F(xiàn)=4.399，P=0.067〕。

3 討 論

當(dāng)腫瘤細(xì)胞獲取黏附并穿透脈管的能力后便可以從原發(fā)灶經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)向其他部位發(fā)生轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，同時(shí)循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞不時(shí)會(huì)受到如自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞等發(fā)出的凋亡誘導(dǎo)信號(hào)作用而發(fā)生凋亡，二者激烈競(jìng)爭(zhēng)決定腫瘤細(xì)胞的存活〔3〕。長(zhǎng)期以來(lái)，各種抗腫瘤措施也主要是致力于凋亡誘導(dǎo)因素方面的研究而誕生，但事實(shí)上，盡管有眾多凋亡誘導(dǎo)因素存在，腫瘤細(xì)胞仍然能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，引起高達(dá)90%的致死率，這就使得腫瘤的治療一直成為人類(lèi)難以克服的難題。TRAIL為T(mén)NF超家族的第三個(gè)成員，其基因位于3號(hào)染色體上，含有4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，擁有眾多生物學(xué)功能。研究表明TRAIL具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，卻對(duì)正常組織細(xì)胞毒性極地，同時(shí)還參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、免疫自穩(wěn)及免疫監(jiān)視從而在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，也可以起到一定的抗腫瘤作用〔4〕。本研究顯示單獨(dú)應(yīng)用TRAIL對(duì)T-24細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，但這種抑制作用有限，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性；結(jié)合凋亡率分析其誘導(dǎo)T-24細(xì)胞凋亡發(fā)生的能力有限，同5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時(shí)在抑制T-24細(xì)胞生長(zhǎng)方面同單用TRAIL相比并沒(méi)有顯著差異，但張少華等〔2〕研究證實(shí)TRAIL同順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能明顯提高卵巢癌細(xì)胞株CAOV3對(duì)藥物的敏感性，這就表明TRAIL提高傳統(tǒng)化療藥物敏感性的特點(diǎn)具有一定的細(xì)胞選擇性，期待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選擇其他膀胱癌細(xì)胞株系來(lái)探討TRAIL的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力和傳統(tǒng)化療藥物的增敏性能。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)新型抗腫瘤藥物TRAIL對(duì)體外培養(yǎng)人膀胱癌T-24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和敏化5-Fu對(duì)T24細(xì)胞治療效果的作用有限，其具體的機(jī)制還需要更深入研究予以探索，可能與T-24細(xì)胞表面TRAIL受體的表達(dá)情況有關(guān)〔5〕。但是，TRAIL優(yōu)先誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而不影響正常細(xì)胞的特性使其有望成為經(jīng)典的腫瘤化療藥物。

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R73-3

A

1005-9202(2017)23-5796-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.020

1 三峽大學(xué)仁和醫(yī)院

董自強(qiáng)(1964-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事泌尿外科常見(jiàn)疾病的診治研究。

肖建華(1987-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿外科腫瘤治療研究。

〔2016-07-06修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)