崔 蔚 陳 波 蔣 偉 曾慶源

(武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

亨廷頓病模型小鼠脂質(zhì)代謝和氧化應激特點

崔 蔚 陳 波 蔣 偉1曾慶源

(武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

目的探討亨廷頓病(HD)模型小鼠在正常飼料喂養(yǎng)和高脂飼料(HFD)喂養(yǎng)下脂質(zhì)代謝和抗氧化應激能力的改變。方法建立HD模型小鼠，與對照組小鼠各自分為2組給予普通飼料和HFD喂養(yǎng)，測定4組小鼠血脂指標和氧化應激指標，分析HD小鼠脂質(zhì)代謝和對抗氧化應激能力的變化趨勢。結(jié)果但給予HFD喂養(yǎng)時，兩類小鼠血脂指標存在顯著差異(P<0.05)。另外，HD組與對照組無論是普通飼料還是HFD喂養(yǎng)，其氧化應激指標均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結(jié)論HD小鼠抵御氧應激能力有所減弱，尤其在受到外界不良干預時，抗氧化應激能力的下降尤為明顯。因為抗氧化應激水平下降，導致線粒體功能損傷，可能是HD發(fā)病機制關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

亨廷頓病；脂代謝；氧化應激；線粒體損傷；谷胱甘肽；丙二醛

神經(jīng)退行性疾病常見有亨廷頓病(HD)、脊小腦共濟失調(diào)(SCA)、帕金森病(PD)等〔1〕。HD是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)變性疾病，多為中老年發(fā)病,以影響運動功能為主，表現(xiàn)為舞蹈樣非自主運動、認知功能障礙和情感障礙〔2〕。氧化應激可能是HD發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)，提高對抗氧化應激的能力可能是治療HD的重要策略〔3〕。因為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)和降解產(chǎn)物如丙二醛(MDA)等，導致線粒體功能失調(diào)，能量平衡紊亂，引起細胞興奮毒性和凋亡〔4〕。而在這一系列環(huán)節(jié)中，抗氧化應激能力是關(guān)鍵研究部分〔5〕。本研究采用高脂飲食進行誘導，探索HD小鼠脂質(zhì)代謝及在外界不良干預下抗氧化應激能力的變化。

1 資料與方法

1.1動物 8周齡雄性小鼠，購自北京大學醫(yī)學部動物實驗中心，基礎(chǔ)飼料適應性喂養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)條件溫度(22±5)℃，濕度(50±10)%，明暗周期比12∶12，自由飲水和喂食。所有的動物分為：對照組為健康小鼠給予標準飼料；HD組為HD模型小鼠給予標準飼料；高脂飼料(HFD)組為健康小鼠予以HFD喂養(yǎng)(HFD配方：基礎(chǔ)飼料70.00 g、豬油15.00 g、蛋黃粉10.00 g、酪蛋白4.00 g、膽固醇0.11 g。HFD供能比：蛋白質(zhì)18.33%，脂肪54.22%，碳水化合物27.45%)；HD+HFD組為HD模型小鼠予以HFD喂養(yǎng)。

1.2血脂指標檢測 測定脂肪合成分布：建模成功并開始干預后，喂養(yǎng)4個月將小鼠眼眶取血后處死，精確分離并分別稱取腹壁脂肪、腎周脂肪及睪周脂肪的重量，并將脂肪濕重除以小鼠體重計算得到脂肪系數(shù)。采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，操作過程嚴格按照說明書進行。TC、TG試劑盒生產(chǎn)商均為中生北控生物科技股份有限公司。

1.3氧化應激相關(guān)指標檢測 肝臟谷胱甘肽(GSH)的測定：用移液器移取100 μl樣品(若是肝勻漿，則稱取肝臟濕重0.1 g，加0.9 ml生理鹽水進行勻漿)于1.5 ml EP管中；加10 μl三氯乙酸(TCA)于上管中，離心10 min，3 000 r/min，4℃；仔細吸取90 μl上清液+10 μl 碳酸鉀(K2CO3)于96孔板中，對照組為100 μl 標準系列和100 μl 水；加100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)+50 μl 二硫二硝基苯甲酸(DTNB)于孔板中，室溫下放置30 min后在405 nm下測定光密度(OD)值。肝臟MDA的測定：若是肝勻漿，則制備5%肝勻漿，0.5 g肝組織加1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS，若肝勻漿雜質(zhì)較多時可于3 000 r/min、4℃下離心10 min)；用移液器移取100 μl肝勻漿于1.5 ml EP管中；加50 μl 8.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)于每個管中，渦流，并在室溫下孵育10 min；將375 μl 20%醋酸與375 μl 0.6%硫代巴比妥酸(TBA)加于以上各管中并混勻；95°放90 min；冷水中降溫；離心10 min，5 000 r/min，4℃；仔細吸取300 μl 上清液于96孔板中，并于532 nm波長下測定OD值。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件進行，多組間比較采用One way ANOVA，首先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊則用LSD法進行兩兩比較，如果數(shù)據(jù)方差不齊，則采用Welch法進行方差分析，應用DunnettT3法進行兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1各組脂肪系數(shù)比較 HD+HFD組和HFD組與對照組比較脂肪系數(shù)均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組脂肪系數(shù)及血脂指標比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2各組血脂指標 HD+HFD組和HFD組與對照組比較血清脂質(zhì)含量除HDL-C外均明顯升高(P<0.05，<0.01)。見表1。

2.3各組GSH和MDA濃度 與對照組比較，HD組、HD+HFD組、HFD組GSH均顯著降低，MDA均顯著升高(P<0.05)；HD+HFD組GSH明顯低于HFD組(P<0.01)，MDA則明顯高于HFD組(P<0.01)，說明HD模型組的小鼠無論是正常喂養(yǎng)還是高脂喂養(yǎng)，其抗氧化應激能力都有一定程度的降低。見表2。

表2 各組GSH和MDA濃度

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與HFD組比較：3)P<0.01

3 討 論

HD突變的Htt基因所導致的線粒體功能損傷和能量代謝異常是許多神經(jīng)退行性疾病的共同特點，而氧化應激可能是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔6〕。所以，增強HD患者對抗氧化應激的能力可能起到改善線粒體功能失調(diào)、修復神經(jīng)系統(tǒng)的作用〔7〕。

HD小鼠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗氧化應激能力明顯減弱，提示在對HD患者進行照護時要同時關(guān)注除臨床癥狀外的其他諸如飲食、生活環(huán)境等外界影響因素；對HD患者的治療中抗氧化應激能力的提高可能是一突破口，通過藥物、食物或一些諸如白藜蘆醇等生物化學物〔8〕保健品，可以提高患者抗氧化應激能力，維持線粒體功能，減少ROS生成和增加抗凋亡蛋白和凋亡蛋白的比例以抑制細胞凋亡，進而促進神經(jīng)元存活〔9〕。

肝臟的脂質(zhì)代謝紊亂后，脂質(zhì)在肝臟長期大量的蓄積進而導致發(fā)生脂肪變性，同時誘導生成更多地促氧化物，并且減少抗氧化物的生成，抵御氧化應激能力減弱〔10〕。在這一過程中還會產(chǎn)生過量的ROS，過量的ROS可以損傷核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，產(chǎn)生一系列如MDA等的降解產(chǎn)物〔11〕。氧化應激和脂質(zhì)過氧化，在HD的病變中作用是不可忽視的〔12〕。抑制氧化應激和脂質(zhì)過氧化，增加抗氧化酶的活性，可減少ROS水平和脂質(zhì)過氧化物，減輕因此誘發(fā)的神經(jīng)元細胞的興奮毒性和凋亡，阻斷HD的發(fā)生發(fā)展〔13〕。

ApoE的異常會導致富含TC的物質(zhì)在血液循環(huán)中發(fā)生紊亂，從而引起脂質(zhì)代謝紊亂，同時誘導生成更多的促氧化物，并減少抗氧化物的生成，減弱抗氧應激能力。國外有ApoE基因與HD相關(guān)性的研究,但研究范圍主要在ApoE基因?qū)D發(fā)病年齡的影響，國內(nèi)相關(guān)研究則較少〔14，15〕。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活子(PGC)-1α是線粒體生物合成和呼吸鏈的重要調(diào)節(jié)因子，也可能是HD患者調(diào)控包括脂肪酸β氧化、胰島素敏感性和碳水化合物代謝等在內(nèi)的系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)的重要因子〔16〕。在HD患者中，突變Htt可能抑制肌肉、脂肪、肝臟等組織中PGC-1α及其靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而引起脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝紊亂及周圍組織胰島素敏感性降低〔17〕。

1Sun YM,Zhang YB,Wu ZY.Huntington′s disease:relationship between phenotype and genotype〔J〕.Mol Neurobiol,2017;54(1):342-8.

2Picconi B,Passino E,Sgobio C,etal.Plastic and behavioral abnormalities in experimental Huntington′s disease:a crucial role for cholinergic interneurons〔J〕.Neurobiol Dis,2006;22(1):143-52.

3Leavitt BR,van Raamsdonk JM,Shehadeh J,etal.Wild-type huntingtin protects neurons from excitotoxicity〔J〕.J Neurochem,2006;96(4):1121-9.

4Edalatmanehs MA,Matin MM,Neshati Z,etal.Systemic transplantation of mesenchymal stem cells can reduce cognitive and motor deficits in rats with unilateral lesions of the neostriatum〔J〕.Neurol Res,2010;32(2):166-72.

5Hargus G,Cooper O,Deleidi M,etal.Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2010;107(36):15921-6.

6梁 靜，儲毓舜，韓 濤，等.非酒精性脂肪性肝病及其不同合并癥患者的代謝異常比較〔J〕.中華肝臟病雜志，2011；19(11)：865-7.

7Jeon I,Choi C,Lee N,etal.In vivo roles of a patient-derived induced pluripotent stem cell line(HD72-iPSC)in the YAC128 model of Huntington′s disease〔J〕.Int J Stem Cells,2014;7(1):43-7.

8Li Y,Nguyen HV,Tsang SH.Skin biopsy and patient-specific stem cell lines〔J〕.Methods Mol Biol,2016;1353:77-88.

9Stefano JT,de Oliveira CP,Correa-Giannella ML,etal.Decreased immunoexpression of survivin could be a potential marker in human non-alcoholic fatty liver disease progression〔J〕?Liver Int,2011;31(3):377-85.

10Kim JE,Leite JD,De Ogburn R,etal.A lutein-enriched diet prevents cholesterol accumulation and decreases oxidized LDL and inflammatory cytokines in the aorta of guinea pigs〔J〕.J Nutr,2011;141(8):1458-63.

11Volynets V,Machann J,Kuper MA,etal.A moderate weight reduction through dietary intervention decreases hepatic fat content in patients with non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD):a pilot study〔J〕.Eur J Nutr,2013;52(2):527-35.

12Baeza I,Fdez-Tresguerres J,Ariznavarreta C,etal.Effects of growth hormone,melatonin,oestrogens and phytoestrogens on the oxidized glutathione(GSSG)/reduced glutathione(GSH)ratio and lipid peroxidation in aged ovariectomized rats〔J〕.Biogerontology,2010;11(6):687-701.

13Wen S,Liu DF,Liu Z,etal.OxLDL-targeted iron oxide nanoparticles for in vivo MRI detection of perivascular carotid collar induced atherosclerotic lesions in ApoE-deficient mice〔J〕.J Lipid Res,2012;53(5):829-38.

14Panegyres PK,Beilby J,Bulsara M,etal.A study of potential interactive genetic factors in Huntington′s disease〔J〕.J Eur Neurol,2006;55(4):189-92.

15Saft C,Andrich JE,Brune N,etal.Apoli poprotein E geno type do not influence the age of onset in Huntington′s disease〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry,2004;75:1692-6.

16Aziz NA,Pijl H,Frolich M,etal.Systemic energy homeostasis in Huntington′s disease patients〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry,2010;81(11):1233-7.

17Chaturvedi RK,Adhihetty P,Shukla S,etal.Impaired PGC-1α function in muscle in Huntington′s disease〔J〕.Hum Mol Genet,2009;18(16):3048-65.

R741.02

A

1005-9202(2017)23-5790-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.017

湖北省自然科學基金資助項目(面上基金)(2014CFB450)；武漢市衛(wèi)生計生委臨床醫(yī)學科研資助項目(wx15D21)

1 武漢市同濟醫(yī)院

陳 波(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科研究。

崔 蔚(1989-)，男，碩士，營養(yǎng)醫(yī)師，主要從事臨床營養(yǎng)研究。

〔2017-08-23修回〕

(編輯 袁左鳴/王一涵)