王樹林 王曉茹 曹欣欣 王書華

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

葒草苷和木犀草素對人紅細(xì)胞自然老化的保護(hù)作用

王樹林1王曉茹 曹欣欣 王書華

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

目的探討葒草苷和木犀草素對人紅細(xì)胞自然老化的保護(hù)作用及構(gòu)效關(guān)系。方法采用健康成年人去白細(xì)胞抗凝血制成紅細(xì)胞懸浮液，建立自然老化模型。測定紅細(xì)胞溶血度，抗氧化酶系及腺苷三磷酸酶(ATPase)活性，丙二醛(MDA)濃度。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析損傷紅細(xì)胞膜蛋白變化，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察紅細(xì)胞形態(tài)及紅細(xì)胞膜骨架超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果葒草苷、木犀草素均能較顯著抑制紅細(xì)胞溶血，保護(hù)抗氧化酶活性及ATPase活性，同時葒草苷、木犀草素還能顯著降低MDA含量(P<0.05,P<0.01)，對紅細(xì)胞膜蛋白具有保護(hù)作用，明顯改善紅細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。結(jié)論葒草苷和木犀草素對人紅細(xì)胞自然老化的保護(hù)作用是通過直接對抗氧自由基損傷和保護(hù)抗氧化酶系活性及紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的完整性而實現(xiàn)的。

葒草苷；木犀草素；紅細(xì)胞；自然老化

紅細(xì)胞膜富含不飽和脂類及鐵，最易遭受氧自由基氧化損傷〔1〕。葒草苷屬黃酮碳苷類〔2〕，其體外具有清除羥基自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼能力及對紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用〔3〕，體內(nèi)對D-半乳糖致衰老小鼠組織細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運能力的改善是通過抗氧化活性來實現(xiàn)的〔4〕。木犀草素屬黃酮苷元類〔5〕，具有保護(hù)心血管、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用〔6～8〕。葒草苷和木犀草素結(jié)構(gòu)相似，僅在葒草苷A環(huán)C-8位上相差一個葡萄糖基，那么這一結(jié)構(gòu)差異對葒草苷和木犀草素抗氧化活性又有何影響呢？本研究以人紅細(xì)胞為研究對象，采用自然老化紅細(xì)胞模型，以維生素C(VC)為陽性對照，比較葒草苷和木犀草素對人紅細(xì)胞的保護(hù)作用并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 UV-9100紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；S-3400N掃描電鏡、H-7500透射電鏡、E-1010離子濺射裝置：日本日立；新鮮去白細(xì)胞抗凝血，張家口市中心血站提供；葒草苷，自制，純度達(dá)到98%以上；木犀草素，天津一方科技有限公司；VC，天津市化學(xué)試劑一廠；丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、三磷酸腺苷(ATP)、過氧化氫酶(CAT)、甘谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、唾液酸(SA)測定試劑盒均購買自南京建成生物工程研究所，批號分別為：20120417、20120417、20120420、20120419、20120417、20120419。

1.2紅細(xì)胞懸液的配制 紅細(xì)胞取自健康人靜脈血，離心除去血漿和白細(xì)胞。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，配制2%的紅細(xì)胞懸液。

1.3自然老化模型建立〔9〕4 ml 2%的紅細(xì)胞懸液于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中孵育0，12，24，48，72 h，取反應(yīng)液，分別用生理鹽水和蒸餾水稀釋10倍，離心(4℃，2 500 r/min，10 min)，412 nm處測定吸光度值，檢測溶血率，確定最佳老化時間。

1.4分組與給藥 葒草苷和木犀草素溶液的配制：葒草苷和木犀草素用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，再加甲醇(CH3OH)稀釋。實驗分為模型組、正常組、VC組(20 μg/ml)、葒草苷和木犀草素(40，20，10 μg/ml)各三個劑量組，給藥組給藥后37℃孵育48 h。

1.5測定指標(biāo)

1.5.1溶血率 取試管紅細(xì)胞反應(yīng)液，分別用生理鹽水和蒸餾水稀釋5倍，412 nm處測定吸光度值，檢測溶血率。

1.5.2抗氧化酶系及腺苷三磷酸酶(ATPase)活性、MDA濃度 測定SOD、CAT、GSH-Px、ATPase、唾液酸(SA)和MDA；測定方法根據(jù)試劑盒說明操作。

1.5.3膜蛋白變化觀察 紅細(xì)胞膜的制備：紅細(xì)胞反應(yīng)液離心(2 500 r/min，10 min)，按1∶30的體積比與預(yù)冷的低滲磷酸鹽緩沖液(5 mmol/L Na2HPO4，0.1 mmol/L PMSF，pH8.0)混合，置于4℃冰箱中溶血1 h。然后離心(4℃，15 000 r/min，20 min)棄上清后用低滲磷酸鹽緩沖液洗3次，離心(4℃，19 000 r/min，20 min)，即可得到乳白色的紅細(xì)胞膜蛋白樣品。將所得紅細(xì)胞膜蛋白定量，然后與等滲PBS混合，使蛋白終濃度為1 mg/ml，放在-80℃冰箱。將紅細(xì)胞膜進(jìn)行SDS-PAGE分離后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。

1.5.4紅細(xì)胞膜表面形態(tài)觀察 將自然老化的紅細(xì)胞分別與2%戊二醛以1∶100的比例混合，固定過夜，用PBS浸洗3遍，脫水干燥后放入E-1010離子濺射裝置噴金，S-3400N掃描電鏡觀察、拍照。

1.5.5膜骨架結(jié)構(gòu)觀察 將自然老化的紅細(xì)胞膜與含2.5%(W/V)TritonX-100的5 mmol/L NaPi(pH7.0)溶液，以1∶4混合，0°C放置1 h。取混合液滴到銅網(wǎng)上，蒸餾水洗滌3次，1%的醋酸雙氧鈾負(fù)染5～10 s，濾紙吸干后用H-7500透射電鏡觀察紅細(xì)胞膜骨架結(jié)構(gòu)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1紅細(xì)胞自然老化模型建立 紅細(xì)胞孵育0，12，24，48，72 h后，隨著孵育時間的延長溶血率逐漸增大〔(6.38±1.02)%、(11.35±2.43)%、(23.69±2.54)%、(37.58±2.44)%、(43.20±3.19)%〕。相鄰孵育時間點溶血率相比，除12、24、48 h之間差異顯著(P<0.01)，其余時間點均無差異。所以選48 h為紅細(xì)胞自然老化模型孵育時間。

2.2藥物對紅細(xì)胞自然老化溶血的影響 紅細(xì)胞自然老化后，出現(xiàn)嚴(yán)重的溶血現(xiàn)象，與正常組〔(6.38±1.02)%〕相比，模型組溶血率有顯著增高〔(37.58±2.44)%，P<0.01〕；與模型組相比，不同給藥組對自然老化引起的溶血有抑制作用且呈劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)；葒草苷10，20 μg/ml濃度組〔(31.46±2.61)%、(26.81±2.18)%〕，抗溶血作用弱于10、20 μg/ml木犀草素組〔(27.11±1.67)%、(20.47±2.09)%，P<0.05，P<0.01〕，紅草苷與木犀草素40 μg/ml濃度組相比無顯著差異〔(13.25±2.25)%、(14.06±1.88)%，P>0.05〕；與VC組〔(12.88±2.37)%〕相比，葒草苷與木犀草素10，20 μg/ml濃度組抗溶血作用較弱，但差異顯著(P<0.05，P<0.01)，40 μg/ml濃度組與VC無顯著差異(P>0.05)。

2.3藥物對紅細(xì)胞自然老化抗氧化酶及ATPase、SA、MDA的影響 紅細(xì)胞自然老化后，抗氧化酶及ATPase活性、SA含量顯著下降，MDA含量明顯升高，與正常組相比有顯著差異(P<0.01)；給予藥物預(yù)處理后，各指標(biāo)均有不同程度恢復(fù)，與模型組相比有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，且在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)；與相同濃度的木犀草素相比，葒草苷10，20 μg/ml濃度組抗氧化能力弱于木犀草素同濃度組(P<0.05，P<0.01)，而40 μg/ml葒草苷和木犀草素濃度組無顯著差異(P>0.05)；與VC相比，葒草苷與木犀草素10，20 μg/ml濃度組抗氧化能力弱于VC 20 μg/ml濃度組(P<0.05，P<0.01)，40 μg/ml濃度組無差異(P>0.05)。見表1。

表1 藥物對紅細(xì)胞自然老化抗氧化酶及ATPase、SA、MDA水平的影響

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與同濃度木犀草素組比較：4)P<0.05，5)P<0.01；與VC組比較：6)P<0.05，7)P<0.01

2.4SDS-PAGE電泳結(jié)果 紅細(xì)胞自然老化后，血影蛋白和錨定蛋白發(fā)生聚集，帶4.1a/帶4.1b增大。給予藥物預(yù)處理后，各給藥組均能抑制血影蛋白、錨定蛋白條帶聚集，并使帶4.1a/帶4.1b降低，見圖1。

2.5掃描電鏡觀察結(jié)果 正常紅細(xì)胞呈同心型雙凹圓盤狀結(jié)構(gòu)，表面光滑、飽滿，基本無異常細(xì)胞。自然老化后，紅細(xì)胞皺縮，體積減少，并發(fā)現(xiàn)有囊泡溢出。給予藥物預(yù)處理后，細(xì)胞表面趨于平滑，皺縮減少，體積逐漸恢復(fù)正常，囊泡明顯減少，以上變化與濃度呈正相關(guān)，見圖2。

2.6透射電鏡觀察結(jié)果 正常紅細(xì)胞膜骨架結(jié)構(gòu)清晰，網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)明顯且網(wǎng)眼均勻、一致。老化后，網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)破壞，SP4和J點模糊難辨，給予藥物預(yù)處理后，可以看到隨藥物濃度升高，對膜骨架的保護(hù)作用逐漸增強，葒草苷40 μg/ml組、木犀草素20 μg/ml組、VC組作用最為顯著，但與正常組相比，仍存在一定差距。見圖3。

A:模型組;B:正常組;C:40 μg/ml木犀草素組;D:20 μg/ml木犀草素組；E:10 μg/ml木犀草素組;M:Marker;F:20 μg/ml VC組;G:10 μg/ml葒草苷組;H:20 μg/ml葒草苷組;I:40 μg/ml葒草苷組圖1 SDS-PAGE檢測紅細(xì)胞膜變化

圖2 掃描電鏡各組紅細(xì)胞自然老化結(jié)果(×2 500)

圖3 透射電鏡觀察各組紅細(xì)胞自然老化結(jié)果(×30 000)

3 討 論

本研究顯示，紅細(xì)胞孵育48 h后，抗氧化酶、SA、ATPase活性下降，MDA含量升高，其機制可能是因為紅細(xì)胞在人體血液中含量最多，其運動循環(huán)代謝主要通過多種酶完成，但當(dāng)紅細(xì)胞發(fā)生衰老時，抗氧化劑攝入減少導(dǎo)致抗氧化酶類活性降低，使多余自由基不能及時被清除，造成脂質(zhì)過氧化損傷；在老化過程中，ATP生成減少，使能量代謝受阻，最終導(dǎo)致機體的嚴(yán)重?fù)p壞甚至壞死〔10〕。SOD、CAT、GSH-Px是機體內(nèi)主要的抗氧化劑，它們相互保護(hù)、相互協(xié)同保護(hù)了機體免受活性氧的破壞〔11〕。一旦這個防御體系被破壞，機體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡將被打破，導(dǎo)致大量脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，其中最重要的是MDA，過量MDA造成細(xì)胞膜損傷〔12〕，另外，脂質(zhì)過氧化損傷會造成ATPase活性降低，影響細(xì)胞變形性和完整性〔13〕。SA位于紅細(xì)胞膜的糖蛋白與糖脂糖鏈末端，具有抗病毒、抗腫瘤、抗老年癡呆等生理活性，對研究機體老化機制具有重要意義〔14〕。本實驗結(jié)果顯示，葒草苷能夠提高SA含量，并與濃度呈正相關(guān)，與Oldenborg等〔15〕研究結(jié)果一致。

紅細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層及附著于內(nèi)表面的膜骨架構(gòu)成，膜骨架系統(tǒng)(六邊網(wǎng)狀的骨架結(jié)構(gòu))主要由血影蛋白、帶4.1蛋白、肌動蛋白、加合蛋白和錨定蛋白等構(gòu)成，血影蛋白所占比例最大(約55%)，一旦發(fā)生異常，就會使脂質(zhì)雙分子層與膜蛋白形成囊泡，脫離骨架，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能改變，影響紅細(xì)胞正常生理功能〔16〕。本實驗結(jié)果顯示，給予藥物處理后，膜蛋白、表面形態(tài)及骨架結(jié)構(gòu)均得到一定程度的恢復(fù)，且恢復(fù)程度與劑量呈正相關(guān)。李靜〔17〕研究了銀杏葉提取物對人紅細(xì)胞氧化損傷及自然老化的影響，證明銀杏提取物不僅可有效保護(hù)膜蛋白，防止其因發(fā)生聚集，脫落而減少或消失，還對膜骨架及紅細(xì)胞膜表面形態(tài)均有一定的保護(hù)作用，且有一定的劑量關(guān)系，與本實驗結(jié)果相一致。本研究黃酮類化合物上的酚羥基有利于抗氧化，清除自由基〔18〕，研究中葒草苷與木犀草素B環(huán)上均有鄰二酚羥基，有較強的抗氧化能力，但葒草苷10，20 μg/ml濃度組的對老化紅細(xì)胞的保護(hù)弱于木犀草素同濃度組，40 μg/ml濃度組作用相當(dāng)，可能原因是葒草苷A環(huán)8位上的糖基化造成空間位阻，使其抗氧化活性下降，這與文獻(xiàn)〔19〕結(jié)果相一致。

葒草苷和木犀草素對人紅細(xì)胞自然老化的保護(hù)作用是通過直接對抗氧自由基損傷和保護(hù)抗氧化酶系活性以及紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的完整性而實現(xiàn)的。在抗氧化藥物構(gòu)效選擇上，10，20 μg/ml濃度組木犀草素的活性比葒草苷強，葒草苷A環(huán)上空間位阻影響了葒草苷的抗氧化活性。

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R285

A

1005-9202(2017)23-5779-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.013

河北省研究生創(chuàng)新資助項目(2015-203)；張家口市科技局(11110015D)；河北北方學(xué)院重大項目(ZD1314)

1 陽泉煤業(yè)(集團(tuán))有限責(zé)任公司總醫(yī)院藥學(xué)部

王書華(1965-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥有效成分的提取及藥理研究。

王樹林(1989-)，女，碩士，主要從事中藥有效成分的提取及藥理研究。

〔2016-10-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)