楊 暢 馮 燕 王新衛(wèi) 劉新年

(湖北省第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430033)

吉非替尼誘導(dǎo)p27核轉(zhuǎn)位并激活半胱天冬酶8促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡的機(jī)制

楊 暢 馮 燕1王新衛(wèi) 劉新年

(湖北省第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430033)

目的探討吉非替尼誘導(dǎo)的p27蛋白表達(dá)改變和核轉(zhuǎn)位及半胱天冬酶(Caspase)8的激活對表皮生長因子受體(EGFR)突變的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。方法選取存在19號外顯子缺失突變的對吉非替尼敏感的NSCLC細(xì)胞系HCC827，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測吉非替尼在不同濃度和時間下對細(xì)胞活性的影響。利用Western印跡檢測p27蛋白和Caspase及其他相關(guān)蛋白的相對含量。通過免疫熒光法觀察p27蛋白的亞細(xì)胞定位。采用蛋白免疫共沉淀驗證p27蛋白和Caspase8之間的相互作用。結(jié)果吉非替尼濃度-時間依賴性促進(jìn)了HCC827細(xì)胞凋亡。當(dāng)吉非替尼干預(yù)18 h后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制因子p27蛋白表達(dá)開始出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，且p27蛋白在此過程中伴隨從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，而促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)x蛋白(Bax)和Bad及抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl/白血病-x基因長片段(Bcl-xl)在吉非替尼干預(yù)后表達(dá)并未發(fā)生顯著改變。此外，細(xì)胞質(zhì)中p27蛋白與Caspase8的降解中間體p43/p41結(jié)合從而抑制其自身細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核易位。結(jié)論推斷吉非替尼通過調(diào)節(jié)p27蛋白的亞細(xì)胞定位及Caspase8之間的相互作用，從而達(dá)到促EGFR突變的NSCLC細(xì)胞凋亡的效果。

吉非替尼；表皮生長因子受體；p27蛋白；半胱天冬酶8；凋亡；非小細(xì)胞肺癌

吉非替尼是一種可逆的、高選擇性的酪氨酸激酶抑制劑，能與三磷酸腺苷競爭性結(jié)合表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶活性區(qū)，從而抑制EGFR自身磷酸化并阻斷其下游信號級聯(lián)放大〔1，2〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系HCC827廣泛存在19號外顯子缺失和21號外顯子點突變，已知這種激活突變能增強(qiáng)細(xì)胞對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的敏感性〔3〕。吉非替尼對EGFR突變的NSCLC細(xì)胞可產(chǎn)生顯著的促凋亡效果〔4〕，抑制NSCLC細(xì)胞的EGFR激酶活性能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期抑制在G1期〔5〕。細(xì)胞周期進(jìn)展受到細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDKs)的調(diào)控，而且細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期受到負(fù)性細(xì)胞周期調(diào)控因子——CDK抑制因子家族的調(diào)控。p27蛋白是主要靶向細(xì)胞周期蛋白E/CDK2復(fù)合體的CDK抑制因子。抑制CDK2活性可以將周期蛋白E/CDK2驅(qū)動的G1期向S期進(jìn)展阻滯。此外，應(yīng)用EGFR抑制劑干預(yù)后，腫瘤細(xì)胞中CDK抑制因子p27蛋白的表達(dá)水平顯著升高〔6〕。細(xì)胞質(zhì)p27蛋白在凋亡過程中與半胱天冬酶(Caspase)8裂解中間體p43/p41結(jié)合，可能是p27蛋白促細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵〔7〕。本研究旨在探討吉非替尼誘導(dǎo)的p27蛋白表達(dá)改變和核轉(zhuǎn)位及Caspase8的激活對EGFR突變的NSCLC細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) HCC827細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)和1%鏈霉素青霉素(北京索萊寶科技有限公司)的杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司371型)培養(yǎng)。

1.2試劑 吉非替尼原料藥，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購于美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白(V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；高靈敏度化學(xué)發(fā)光(eECL)檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；抗Caspase8、9小鼠單克隆抗體，抗Caspase3兔多克隆抗體，抗p-EGFR和抗磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)兔多克隆抗體均購于英國Abcam公司；抗p27和抗p21蛋白兔多克隆抗體，抗β-Actin兔多克隆抗體，抗(GAPDH)及抗核纖層蛋白(Lamin)B兔多克隆抗體購于美國ABGENT公司?？笲細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、抗Bcl/白血病-x基因長片段(Bcl-xl)、抗Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)及抗Bad兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)共軛的抗兔和抗小鼠抗體購于美國BD公司；蛋白免疫共沉淀(蛋白A樹脂)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)NE-PER 胞質(zhì)和核蛋白抽提試劑盒(美國pierce公司)。

1.3細(xì)胞活力試驗 采用MTT法檢測細(xì)胞增殖和活力。取處于對數(shù)生長期的HCC827細(xì)胞，用血球計數(shù)板計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基將其稀釋成1×104個/ml鋪于96孔板，每孔100 μl。加入不同濃度(0.00、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 μmol/L)的吉非替尼處理72 h后，將MTT溶液加入使終濃度達(dá)到0.5 mg/ml，37℃培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基后，每孔加入50 μl二甲基亞砜。利用590 nm波長酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司imark型)檢測每孔光密度值。不同濃度加藥組與對照組吸光度的比值作為各組細(xì)胞相對活力，代表細(xì)胞死亡情況。

1.4流式細(xì)胞術(shù) 分別收集1 μmol/L吉非替尼處理不同時間(0、3、6、12、18、24 h)的HCC827細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，每組約1×106個細(xì)胞。洗滌，與Annexin V-FITC結(jié)合，冰浴30 min，隨后加入1 μg/ml碘化丙啶(PI)，置暗處10 min后采用流式細(xì)胞儀(美國BD公司FACSCalibur型)上機(jī)檢測。Annexin V-FITC對凋亡細(xì)胞翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸具有較高親和力，DNA染料PI進(jìn)入凋亡細(xì)胞結(jié)合其DNA。根據(jù)二者所發(fā)熒光，儀器會自動分析出各組細(xì)胞的凋亡率。

1.5Western印跡 利用放射免疫沉淀法(RIPA)將細(xì)胞裂解進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后將裂解蛋白電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜。將此膜用含5%脫脂奶粉和0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(T-PBS)室溫封閉1 h，然后將一抗用T-PBS混合液以1∶1 000稀釋比例4℃孵育過夜。待將硝酸纖維素膜用T-PBS沖洗3遍后用含辣根過氧化物酶標(biāo)的1∶2 000稀釋倍數(shù)的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。再次將硝酸纖維素膜洗滌數(shù)次后，滴加eECL化學(xué)發(fā)光試劑并進(jìn)行暗室曝光。條帶的灰度值用 Image J軟件檢測分析。

1.6免疫熒光分析 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗后，將其置于含2%多聚甲醛的PBS 37℃下固定20 min。采用含0.2% Triton X-100的PBS室溫通透30 min后，將細(xì)胞用PBS沖洗3次后于37℃進(jìn)行一抗(抗p27，抗Caspase8)孵育1 h，一抗用PBS混合液(3%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20，0.08%疊氮化鈉)稀釋至1∶100的比例。細(xì)胞沖洗3次，每次5 min。細(xì)胞用1∶400稀釋的共軛有FITC或德克薩斯紅(Texas Red)的二抗于37℃下孵育30 min。將玻片置于含0.1 μg/ml Hoechst H33342熒光染料的PBS中浸泡。沖洗2遍后，細(xì)胞用共聚焦顯微鏡(德國NanoFocus公司μsurf explorer型)進(jìn)行直接觀察。

1.7蛋白免疫共沉淀 利用細(xì)胞質(zhì)提取液進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)(IP)。待細(xì)胞生長融合至90%左右時將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于冰上，加入細(xì)胞質(zhì)裂解液孵育1 h。4℃，1 000 r/min離心10 min，分離抽取上清液。取1 mg細(xì)胞裂解產(chǎn)物加入一抗于4℃過夜孵育。然后加入蛋白A-瓊脂糖4℃振搖24 h。用洗滌緩沖液將沉淀洗滌5次，2倍SDS樣品緩沖液將沉淀重懸后上樣進(jìn)行SDS-PAGE免疫印跡分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析、HSD-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1吉非替尼對HCC827細(xì)胞凋亡的影響 吉非替尼濃度依賴性對HCC827細(xì)胞的活力產(chǎn)生了顯著抑制，其中0.00 μmol/L相對細(xì)胞活性為(100.0±5.4)%，0.01 μmol/L為(87.2±5.3)%，0.10 μmol/L為(49.0±4.9)%，1.00 μmol/L為(34.1±5.8)%，5.00 μmol/L為(32.7±5.9)%，10.00 μmol/L為(14.9±5.0)%(F=115.908,P=0.000)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)吉非替尼時間依賴性促進(jìn)了HCC827細(xì)胞凋亡，其中0 h細(xì)胞凋亡率為1.0%，3 h為6.4%，6 h為12.7%，12 h為20.6%，18 h為33.9%，24 h為65.8%。

2.2吉非替尼通過激活Caspase8和促進(jìn)p27蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 吉非替尼處理HCC827細(xì)胞24 h后檢測到有活性的裂解Caspase8(p18)和Caspase3的18片段，與PARP降解的時間進(jìn)程相似。緊接著有活性的Caspase8和Caspase8的中間降解產(chǎn)物p43及p41在吉非替尼處理18 h后同樣被明顯的檢測出來。與此相反，能夠啟動細(xì)胞凋亡通路的Caspase9在這個過程中并未發(fā)現(xiàn)顯著活化現(xiàn)象。促凋亡蛋白Bax和Bad及抗凋亡蛋白Bal-2和Bcl-xl的表達(dá)在吉非替尼干預(yù)后同樣未發(fā)現(xiàn)有顯著改變。當(dāng)HCC827細(xì)胞分別接受吉非替尼處理0、3、6、18和24 h后，有效抑制了EGFR和Akt的磷酸化狀態(tài)，同時在吉非替尼干預(yù)18 h后p27蛋白的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)(F=123.019，P=0.000)。其中0 h時p27蛋白灰度值為5.8±2.3，3 h為2.2±2.1，6 h為4.5±2.4，18 h為32.3±2.6，24 h為35.1±2.6。但是在同樣情況下并未發(fā)現(xiàn)p21蛋白的表達(dá)增加，見圖1。

2.3吉非替尼促進(jìn)p27蛋白由胞核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位 見圖2，圖3。隨著處理時間的增加，p27蛋白含量在細(xì)胞質(zhì)顯著升高(0 h:52.5±4.7,3 h:53.5±6.3,6 h:48.3±6.1,18 h:80.5±6.8,24 h:105.2±8.6;P<0.05)，但在細(xì)胞核中卻隨之降低(0 h:59.5±8.0,3 h:74.4±9.2,6 h:73.7±10.5,18 h:65.1±8.8,24 h:46.2±7.5)。隨著吉非替尼處理時間的增加，p27蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中亞細(xì)胞定位與Western印跡分析結(jié)果均一一對應(yīng)。

圖1 吉非替尼通過激活Caspase8和提高p27蛋白表達(dá)水平誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡

圖2 Western印跡檢測細(xì)胞質(zhì)(C)和細(xì)胞核(N)裂解物中p27蛋白相對含量

2.4吉非替尼對細(xì)胞質(zhì)中p27與Caspase8中間體p43/p41結(jié)合的影響 吉非替尼促進(jìn)了細(xì)胞質(zhì)中p27蛋白的表達(dá)和Caspase8的活化。吉非替尼處理24 h后，用抗p27蛋白抗體和抗Caspase8抗體對胞質(zhì)蛋白進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)。吉非替尼處理后檢測到Caspase8的裂解中間體p43/p41。利用抗p27蛋白抗體進(jìn)行免疫沉淀并未檢測到總長度為57 kD的Caspase8。吉非替尼處理18 h和24 h后細(xì)胞質(zhì)中p27蛋白和Caspase8的信號增強(qiáng)且結(jié)合在一起，見圖4。

圖3 吉非替尼處理不同時間共聚焦顯微鏡下p27蛋白表達(dá)(比例尺=20 μm)

a、b：抗p27蛋白抗體(a)、抗Caspase8抗體(b)對細(xì)胞質(zhì)溶解產(chǎn)物孵育的IP結(jié)果；c：免疫細(xì)胞化學(xué)染色(比例尺= 20μm)圖4 吉非替尼誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中p27與Caspase8降解中間體p43/p41結(jié)合

3 討 論

EGFR家族廣泛表達(dá)的跨膜酪氨酸激酶參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。根據(jù)受體和配體的結(jié)合特點，同源或異源二聚體的受體類型及細(xì)胞質(zhì)中酪氨酸殘基的自身磷酸化產(chǎn)生的信號級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞遷移和凋亡抑制〔8〕。靶向EGFR已經(jīng)成為一種切實可行的針對晚期NSCLC患者的治療策略。吉非替尼作為口服小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑，目前已廣泛應(yīng)用于NSCLC的臨床治療。部分NSCLC患者存在EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變，且這種突變在亞洲不吸煙的患腺癌的女性中尤為常見〔9〕。EGFR突變預(yù)示著其對酪氨酸激酶抑制劑具有極高的反應(yīng)率〔10〕。盡管臨床效果值得肯定，但吉非替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期抑制的機(jī)制迄今仍不明確。

p27蛋白在多種細(xì)胞的增殖、分化和死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔11〕。研究報道，p27蛋白對腫瘤細(xì)胞具有促凋亡作用，通過重組腺病毒對p27過表達(dá)引起了腫瘤相關(guān)細(xì)胞系的凋亡〔12〕。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞系中p27蛋白過表達(dá)引起的細(xì)胞死亡可能受到pRb蛋白的調(diào)控〔13〕。而且，有研究發(fā)現(xiàn)，對比于高表達(dá)p27蛋白，胃癌中p27蛋白的低表達(dá)展現(xiàn)了一個較低水平的細(xì)胞凋亡和較差的不良預(yù)后〔14〕。p27蛋白的亞細(xì)胞定位對于其功能的發(fā)揮至關(guān)重要。前人已在多種人類腫瘤中檢測到p27蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC細(xì)胞系中p27蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位可能是由于吉非替尼誘導(dǎo)的p27蛋白的動態(tài)核轉(zhuǎn)出所引發(fā)。

本文同樣發(fā)現(xiàn)吉非替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與Caspase8的激活相關(guān)。Caspase8的兩條主要凋亡路徑已被確定〔16〕。受體-配體作為外在凋亡路徑需要配體結(jié)合到細(xì)胞表面受體，引起受體寡聚化，激活起始凋亡蛋白酶Caspase8。第二條為從細(xì)胞內(nèi)部激活凋亡蛋白酶的線粒體途徑，這個內(nèi)在路徑受到Bcl-2蛋白家族調(diào)控并通過Caspase9啟動信號級聯(lián)。本研究還發(fā)現(xiàn)數(shù)種Bcl-2家族蛋白，包括促凋亡蛋白Bax、Bad及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl在吉非替尼干預(yù)后表達(dá)并未發(fā)生顯著改變。由于Caspase9在吉非替尼干預(yù)后同樣未檢測到明顯激活現(xiàn)象，因此猜測吉非替尼在HCC827細(xì)胞中并未通過內(nèi)部凋亡路徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究報道，在腫瘤細(xì)胞中Caspase8調(diào)控的細(xì)胞凋亡與p27蛋白有關(guān)〔17〕。在骨肉瘤中，蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中同時檢測到Caspase8的激活增強(qiáng)及p27蛋白表達(dá)增加〔18〕。根據(jù)本研究結(jié)果猜測，吉非替尼干預(yù)NSCLC細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)中p27蛋白的表達(dá)升高和Caspase8的激活增強(qiáng)可能協(xié)同導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同樣還發(fā)現(xiàn)吉非替尼的干預(yù)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中p27蛋白與Caspase8的裂解中間體p43/p41結(jié)合。長度為57 kD的Caspase8已知是被含有前肽結(jié)構(gòu)域和p18亞基的中間體p43/p41催化激活。隨后，中間體p43/p41從功能前區(qū)釋放粘連有p18的活性部位。此外，通過抑制p27蛋白的細(xì)胞質(zhì)易位發(fā)現(xiàn)吉非替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率下降，推斷p27蛋白的核轉(zhuǎn)位與Caspase8的結(jié)合在吉非替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)程中極為關(guān)鍵。

本文結(jié)果表明，大部分HCC827細(xì)胞在吉非替尼處理24 h后凋亡，但與免疫熒光檢測結(jié)果不相符。究其原因發(fā)現(xiàn)，在免疫熒光法中，細(xì)胞必須被固定、透明化處理并在抗體孵育前對細(xì)胞進(jìn)行沖洗。通過這一系列步驟，死亡的懸浮細(xì)胞被洗掉，而只有貼壁的活細(xì)胞被熒光檢測。然而，無論是PARP或Caspase的裂解，還是p27蛋白的表達(dá)升高及其細(xì)胞質(zhì)易位，在吉非替尼處理18 h后才被Western印跡清晰地檢測到。推測這種結(jié)果差異很可能是Western操作中抗體對這些蛋白的敏感性差異所致。

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10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.011

1 武漢市第一醫(yī)院病理科

馮 燕(1977-)，女，主治醫(yī)師，主要從事病理學(xué)研究。

楊 暢(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

〔2017-05-26修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)