王子珍 楊 堃 鄭穿宜

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570100)

遲發(fā)型腦血管痙攣致腦缺血后神經(jīng)元自噬

王子珍 楊 堃 鄭穿宜

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570100)

目的探討遲發(fā)型腦血管痙攣(DCVS)致腦缺血后神經(jīng)元自噬的現(xiàn)象。方法建立自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后DCVS兔模型，檢測腦組織含水量以確定模型成功程度。在二次注血后的不同時間處死兔，取痙攣血管供血區(qū)域腦組織進行Western印跡、免疫組織化學(xué)等檢測腦組織中神經(jīng)元細胞壞死、凋亡和自噬現(xiàn)象。結(jié)果SAH兔模型腦組織中存在神經(jīng)元細胞壞死、凋亡和自噬現(xiàn)象。梗死后24 h腦組織含水量相比梗死前增多(P<0.05)。Western印跡及免疫組化證實DCVS和神經(jīng)元細胞自噬存在關(guān)聯(lián)。結(jié)論DCVS致腦缺血組織中存在神經(jīng)元自噬現(xiàn)象，腦血管痙攣的程度與神經(jīng)元自噬存在一定的關(guān)聯(lián)性。

遲發(fā)型腦血管痙攣(DCVS)；自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔水血(SAH)；自噬現(xiàn)象

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是發(fā)病率最高的腦血管意外之一，顱內(nèi)動脈瘤破裂出血是最常見的致病原因，遲發(fā)型腦血管痙攣(DCVS)是其最嚴(yán)重且常見的并發(fā)癥之一〔1〕。DCVS與很多因素有關(guān)，如一氧化氮(NO)、炎癥因子等，但機制尚未完全闡明。細胞自噬普遍存在于真核細胞中，是一種高度保守的細胞自我防御機制，是細胞在營養(yǎng)不足時誘發(fā)的適應(yīng)性反應(yīng)，可為各種生物學(xué)行為提供能量原料〔2，3〕。DCVS 后相應(yīng)的供血區(qū)腦組織也處于供血不足狀態(tài)，可能為類似于缺血半暗帶的低灌注區(qū)或者大腦中動脈閉塞(MCAO)后的腦梗死〔4〕。因此設(shè)想，DCVS 后腦缺血組織中神經(jīng)元自噬機制也可能被激活，并且與腦血管痙攣的程度可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。

1 材料和方法

1.1SAH動物模型的建立 參照Bederson等〔5〕的報道采用頸內(nèi)動脈穿刺法建立兔模型。取正常體健兔，腹腔麻醉后固定在硬板上，股動脈插管監(jiān)測兔血壓，手術(shù)前及蛛網(wǎng)膜下腔出血后各測一次動脈血行血氣分析。分離固定右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，吻合支對應(yīng)結(jié)扎，將尼龍線從頸外動脈穿入頸內(nèi)動脈部分，有阻力出現(xiàn)時進一步刺破血管，制作蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，持續(xù)20 s將尼龍線取出，逐步結(jié)扎頸外動脈端，逐步恢復(fù)血流情況，縫合頸部切口。術(shù)中維持兔的正常生命狀態(tài)。假手術(shù)(sham)組除了不刺破血管壁外，其余操作均與實驗組一致。術(shù)后兔單籠飼養(yǎng)，注意保暖。

1.2腦水含量測定 麻醉藥深度麻醉大鼠(每組5只)后迅速處死取出腦組織，放在冰上，去除腦皮質(zhì)表面的腦膜和血凝塊，作冠狀位切片。所有組織用電子天平稱量腦組織濕重，放入恒溫烤箱烘烤2 h至恒重，置于干燥缸冷卻后取出，測干重。腦組織含水量=(濕重-干重)。

1.3Western印跡蛋白免疫印跡 配制10%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋一抗，4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000)稀釋，室溫孵育2 h；電化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測。實驗重復(fù)3次。采用的抗體：抗-LC3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ),抗-酶切Caspase-3,抗-Fodrin，抗-LAMP1，抗-tubulin。

1.4免疫組織化學(xué) 取與痙攣血管相應(yīng)的供血區(qū)兔腦組織，采用 ABC 法進行免疫組化染色，然后在共聚焦顯微鏡下觀察。選用的抗體包括抗-LC3(LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ)、抗-酶切Caspase-3、抗-Fodrin、抗-LAMP1及抗-tubulin。

1.5統(tǒng)計與分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般生理情況 在整個實驗過程中，時刻監(jiān)測兔的動脈壓、血壓和心率，建模前和蛛網(wǎng)膜下腔出血后分別測定血pH值、PO2、PCO2和血糖水平，見表1。sham組兔術(shù)后無動物死亡，死亡率為0%；SAH組兔死亡率為41.1%(37/90)。

表1 各組動物一般生理狀況比較

2.2腦組織含水量測定 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織含水量較sham組(0.60±0.09)相比均明顯升高，其中24 h后腦水腫達到高峰(0.85±0.13)，72 h后腦水腫有所下降(0.72±0.08)，但仍高于sham組(P<0.05)，6 h腦組織含水量為0.76±0.11。

2.3Western印跡分析自噬相關(guān)蛋白的表達變化 自噬相關(guān)蛋白在sham組呈現(xiàn)低表達，大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ較sham組明顯升高。與LC3-Ⅰ的變化大致相仿，Beclin1和Atg5的表達在出血24 h后達到最高，與sham組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見圖1，表2。

2.4免疫組織化學(xué)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達 免疫組化結(jié)果見圖2，自噬相關(guān)蛋白在sham組的腦組織中呈低表達，在蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后Atg5、Beclin1和LC3-Ⅰ的表達增高。表明蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后自噬蛋白在腦組織中表達明顯升高。

圖1 Western印跡分析蛛網(wǎng)膜下腔出血后Atg5、Beclin1和LC3-I蛋白表達的變化

表2 Western印跡分析自噬相關(guān)蛋白的表達變化

與sham組比較：1)P<0.05

圖2 免疫組織化學(xué)檢測蛛網(wǎng)膜下腔出血后Atg5、Beclin1和LC3-I在腦組織的表達變化(×40)

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死腦組織中存在神經(jīng)元自噬現(xiàn)象，具有神經(jīng)保護作用。體外和體內(nèi)腦缺血實驗?zāi)Ｐ椭?，無氧狀態(tài)下神經(jīng)元在幾分鐘內(nèi)就會死亡，中風(fēng)后幾分鐘內(nèi)無血區(qū)就發(fā)生神經(jīng)元壞死。

在缺血壞死區(qū)的周圍，神經(jīng)元不能得到足夠的血供的低灌注區(qū)被命名為“缺血半暗帶”，而缺血半暗帶被認(rèn)為與延遲性神經(jīng)元死亡有關(guān)〔5〕。在缺血半暗帶中caspase-3 激活也有Beclin 1、LC3、BNIP3等自噬相關(guān)基因的激活，表明其中可能同時存在凋亡和自噬〔6,7〕。Xue 等〔8〕發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶被阻抑后，細胞內(nèi)的線粒體被選擇性清除，從而缺血后自噬機制被激活，受損的線粒體被清除、凋亡終止，但線粒體的清除能夠被 bafilomycin A1(BFA，一種自噬體和溶酶體融合的阻滯劑)阻斷。目前被較多研究者接受的一個觀點是，腦缺血首先啟動凋亡路徑，缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)自噬體形成并清除受損的線粒體，阻斷凋亡，通過異化能量生成保持細胞穩(wěn)態(tài)，避免細胞壞死。然而如果腦灌注不足長時間得不到糾正，高度的“自噬應(yīng)激”可導(dǎo)致大量溶酶體激活，最后細胞死亡〔9〕。而自噬可以有效地清除受損的細胞器和大分子，將大分子物質(zhì)再循環(huán)以提供 ATP和合成新的大分子，保持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和利于細胞生存。過度的自噬激活就會導(dǎo)致自噬性細胞死亡〔10〕。

Wen等〔11〕用MCAO模型研究局灶性缺血，發(fā)現(xiàn)缺血腦組織存在自噬體和自噬溶酶體，自噬抑制劑3-MA、BFA 和組織蛋白酶抑制劑預(yù)先在腦室內(nèi)應(yīng)用可以顯著減少梗死體積、腦水腫及運動障礙。而且有研究顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血后存在自噬現(xiàn)象〔12〕。所以我們可以推測DCVS后可能會出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。

目前關(guān)于細胞死亡的討論有很多，最常見也被公認(rèn)的有細胞壞死、細胞程序性死亡(細胞凋亡)、細胞自噬型死亡。自噬與凋亡不完全相同，他們兩者之間的關(guān)系相對復(fù)雜，功能情況互相調(diào)控，在特定環(huán)境下，如體外應(yīng)激，細胞自噬可以一定程度適應(yīng)應(yīng)激條件，抑制部分細胞凋亡，在其他細胞內(nèi)的背景下，自噬性細胞死亡可以誘導(dǎo)非正常細胞的損傷〔13,14〕。在一般正常條件下，同樣的應(yīng)激條件對細胞凋亡和細胞自噬的誘導(dǎo)是無差別的，但是因為二者敏感閾值不同而導(dǎo)致其性質(zhì)不同，二者的性質(zhì)受胞內(nèi)物質(zhì)分解代謝水平的調(diào)節(jié)，在細胞內(nèi)可同時存在自噬和凋亡，盡管多數(shù)情況下細胞通過適應(yīng)應(yīng)激，但是如果自噬嚴(yán)重，能夠完全導(dǎo)致細胞死亡〔15〕。已有學(xué)者證明自噬可以被凋亡信號誘發(fā)，而且可以在凋亡過程中持續(xù)存在自噬現(xiàn)象，但是自噬能否完全獨立地誘導(dǎo)細胞死亡還需要進一步探討。在果蠅唾液腺中激活類固醇能誘導(dǎo)自噬小體〔16〕，水解caspase降低其活性可以抑制自噬的出現(xiàn)〔17〕，同時Beclin1上調(diào)可以提高caspase活性，進而誘導(dǎo)細胞凋亡〔18〕，這些都證明了自噬與凋亡在細胞死亡程序中扮演相似的重要功能。

細胞死亡是錯綜復(fù)雜的機制作用，本實驗證實SAH后自噬激活存在于DCVS后的腦缺血中，而自噬在SAH發(fā)生過程中的具體機制尚需進一步探討。

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Delayedvasospasminducedneuronalautophagythroughcerebralischemia

WANGZi-Zhen,YANGKun,ZHENGChuan-Yi.

DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo investigate the delayed vasospasm after cerebral ischemia-induced neuronal autophagy phenomenon.MethodsDelayed vasospasm after subarachnoid hemorrhage model rabbit brain was made, brain water content was detected to determine the extent of the success of the model. Neuronal cells in brain tissue necrosis, apoptosis and autophagy were detected by Western blot and immunohistochemistry. The expression of autophagy antibodies in rabbit brain model was detected by Western blot. The expression of autophagy protein in detection of vascular spasm region was detected by immunohistochemistry.ResultsThe model of rabbit was successful. Rabbit brain tissue showed neuronal necrosis, apoptosis and autophagy. Compared with before infarction, A the brain water content was increased fter infarction 24 h. Western blot immunohistochemistry confirmed vasospasm and delayed neuronal cells from an association between macrophages.ConclusionsThe presence of cerebral ischemia and neuron autophagy exist in the DCVS model, the degree of cerebral vasospasm is partly related to neurons autophagy.

DCVS; SAH; Autophagy

國家自然科學(xué)基金項目(No.81260371)；海南省自然科學(xué)基金項目(No.20158300)

楊 堃(1965-)，男，主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

王子珍(1966-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科疾病診治研究。

R734.9

A

1005-9202(2017)23-5749-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.003

〔2017-01-15修回〕

(編輯 李相軍/徐 杰)