李超紅 賈祥磊 黃 璐 劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 河南省神經(jīng)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省神經(jīng)病學(xué)研究所，河南 衛(wèi)輝 453100)

基礎(chǔ)研究·

慢性間歇性低氧對頸動(dòng)脈體缺氧誘導(dǎo)因子-α亞型的影響

李超紅 賈祥磊 黃 璐 劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 河南省神經(jīng)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省神經(jīng)病學(xué)研究所，河南 衛(wèi)輝 453100)

目的探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-α亞型在頸動(dòng)脈體可塑性中的作用。方法給SD大鼠慢性間歇性低氧每天8 h，處理3 w后，收獲頸動(dòng)脈體，提取RAN，用RT-PCR方法檢測HIF-α亞型在頸動(dòng)脈體的表達(dá)。結(jié)果大鼠頸動(dòng)脈體表達(dá)HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α mRNA。慢性間歇性低氧處理后，大鼠頸動(dòng)脈體HIF-2α和HIF-3α mRNA表達(dá)量增高，但是HIF-1α mRNA表達(dá)量無變化。結(jié)論大鼠頸動(dòng)脈體表達(dá)三種HIF-α亞型，即HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF-2α和HIF-3α參與慢性間歇性低氧引起的頸動(dòng)脈體化學(xué)感受性反射的可塑性。

慢性間歇性低氧；低氧誘導(dǎo)因子；頸動(dòng)脈體

頸動(dòng)脈體(CB)在慢性低氧環(huán)境中能自發(fā)性適應(yīng)和調(diào)節(jié)〔1～3〕。不論是循環(huán)間歇性低氧還是持續(xù)性低氧均可通過調(diào)控CB內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)調(diào)質(zhì)信號(hào)通路分子水平，引起CB化學(xué)感受性反射的可塑性，然而其機(jī)制尚未明確。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-α是一種細(xì)胞低氧條件下誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子〔4〕，與其靶基因啟動(dòng)子特異序列結(jié)合，調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-α包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α三種亞型，不同HIF-α亞型對急慢性低氧的反應(yīng)不同。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種高度保守的同源二聚體糖蛋白，是血管內(nèi)皮特異性的肝素結(jié)合生長因子，可通過多種方式誘導(dǎo)血管生成〔5〕。HIF-α與VEGF基因啟動(dòng)子的特定序列結(jié)合促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄。Sondell等〔6〕發(fā)現(xiàn)，在VEGF高表達(dá)的膠質(zhì)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有HIF-1α的表達(dá)，且二者的分布位置一致。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，低氧可使VEGF的表達(dá)量明顯增高，可能參與低氧的代償作用。本研究檢測三種HIF-α亞型mRNA在CB的表達(dá)以及慢性間歇性低氧(CIH)對其在CB表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(編號(hào)：41003100001855)。實(shí)驗(yàn)起始大鼠體重240～250 g(8周齡)，每天自由進(jìn)食、水。

1.1.2試劑 Trizol購自Ambion公司；引物購自華大基因科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；PCR試劑盒購自QIAGEN公司；其他試劑購自天津恒興化學(xué)試劑廠。

1.2方法

1.2.1循環(huán)間歇性低氧模型制備 利用美國Biospherix公司的Oxycycler A84，制備循環(huán)CIH大鼠模型。SD大鼠隨機(jī)分為對照組和CIH組，分別置于特制低氧室，按照設(shè)定的程序，計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制注入氧氣或氮?dú)?。每個(gè)周期6 min。CIH前2 min充入100% N2，氧濃度分?jǐn)?shù)逐漸降低至最低點(diǎn)10%，并在10%維持3 min。最后1 min充入21%氧氣，氧濃度分?jǐn)?shù)逐漸恢復(fù)至21%。對照組充入空氣代替氮?dú)狻Ｃ刻? h，持續(xù)14 d。

1.2.2收集CB組織 大鼠用異氟烷麻醉，迅速斷頭，并置于冰冷的生理鹽水中。外科顯微鏡下迅速游離雙側(cè)頸動(dòng)脈分叉，進(jìn)一步于體視顯微鏡下小心仔細(xì)游離CB，并置于RNA later,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物設(shè)計(jì) 根據(jù)大鼠基因組序列設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。見表1。

表1 引物序列

1.2.4RNA提取和RT-PCR 由于CB組織非常小，把來源于10只大鼠的CB混合在一起提取RNA。根據(jù)說明書，應(yīng)用Trizol法提取總RNA。取500 ng RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，總體積20 μl，37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s。用2 μl cDNA和1個(gè)單位Hotstartaq DNA聚合酶進(jìn)行PCR，總體積20 μl。PCR程序：初始15 min、95℃的初始活化激活Hotstartaq DNA聚合酶，其次是94℃、1 min變性，50 s退火(根據(jù)不同引物的退火溫度)和72℃ 50 s延伸獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分析，溴乙錠染色，在紫外光下顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS16.0軟件行方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1HIF-α亞基在大鼠CB組織中的表達(dá)情況 大鼠CB HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α表達(dá)豐度均低于陽性對照大鼠大腦皮質(zhì)。見圖1。

圖1 大鼠CB表達(dá)三種HIF-α亞基

2.2CIH對大鼠CB各HIF-α亞基表達(dá)的影響 大鼠循環(huán)間歇性低氧處理2 w后，HIF-2α、HIF-3α mRNA水平均比對照組增加(P<0.05)，而HIF-1α mRNA水平無明顯改變。見圖2。

與對照組相比：1)P<0.05圖2 CIH對大鼠CB中HIF-α mRNA水平的影響

2.3CIH對大鼠CB中VEGF表達(dá)情況的影響 CIH處理2 w后，CIH組大鼠CB的VEGF水平明顯高于對照組(P<0.05，n=6)。見圖3。

圖3 CIH對大鼠CB中VEGF表達(dá)水平的影響

3 討 論

CB是體內(nèi)重要的氧感受器官〔2〕，缺氧可導(dǎo)致其發(fā)生可塑性改變，但具體機(jī)制尚未完全闡明。根據(jù)本研究結(jié)果推測，HIF-α引起的VEGF表達(dá)水平升高可能參與循環(huán)間歇性低氧所致CB可塑性。

HIF-α是一種細(xì)胞低氧條件下誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子〔4〕，缺氧條件下其降解受到限制，轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，在細(xì)胞核中與HIF-α形成異二聚體，通過HIF-α與其靶基因啟動(dòng)子特異序列結(jié)合，調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮一系列生物學(xué)活性；VEGF是其靶基因之一。近年來，HIF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用被廣泛關(guān)注〔8〕，研究發(fā)現(xiàn)，HIF-α在腦缺血缺氧損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用。推測其機(jī)制之一可能與缺氧后HIF-α調(diào)控其靶基因VEGF表達(dá)增加相關(guān)，從而促進(jìn)新生血管形成，改善腦組織的血流供應(yīng)，使腦缺血得到恢復(fù)。CB作為神經(jīng)源性組織，是機(jī)體重要的氧感受器官。阻塞性睡眠呼吸暫停的病理特征之一是循環(huán)間歇性低氧。循環(huán)間歇性低氧通過改變CB可塑性，使得交感神經(jīng)活性增強(qiáng)。 CIH誘發(fā)的CB可塑性變化是阻塞性睡眠呼吸暫停繼發(fā)高血壓的發(fā)病機(jī)制之一，然而這種CB可塑性變化的機(jī)制尚未完全闡明〔9〕。本結(jié)果證實(shí)，CB表達(dá)三種HIF-α亞基，并CIH增加HIF-2α及HIF-3α mRNA表達(dá)量,但不影響HIF-1α mRNA的表達(dá)。推測不同HIF-α亞型對低氧具有時(shí)效性反應(yīng)。并且CIH明顯增加HIF-α 靶基因VEGF mRNA表達(dá)量。

1Conde SV,Sacramento JF,Guarino MP,etal.Carotid body,insulin,and metabolic diseases:unraveling the links〔J〕.Front Physiol,2014；5(4):418.

2Mifflin S,Cunningham JT,Toney GM.Neurogenic mechanisms underlying the rapid onset of sympathetic responses to intermittent hypoxia〔J〕.J Appl Physiol (1985),2015；119(12):1441-8.

3Basaran KE,Villongco M,Ho B,etal.Ibuprofen Blunts Ventilatory Acclimatization to Sustained Hypoxia in Humans〔J〕.PLoS One,2016；11(1):e0146087.

4Hu YY,Fu LA,Li SZ,etal.Hif-1α and Hif-2α differentially regulate Notch signaling through competitive interaction with the intracellular domain of Notch receptors in glioma stem cells〔J〕.Cancer Lett,2014；349(1):67-76.

5Dzietko M,Derugin N,Wendland MF,etal.Delayed VEGF treatment enhances angiogenesis and recovery after neonatal focal rodent stroke〔J〕.Transl Stroke Res,2013；4(2):189-200.

6Sondell M,Sundler F,Kanje M.Vascular endothelial growth factor is a neurotrophic factor which stimulates axonal outgrowth through the flk-1 receptor〔J〕.Eur J Neurosci,2000；12(12):4243-54.

7Marti HJ,Bernaudin M,Bellail A,etal.Hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression precedes neovascularization after cerebral ischemia〔J〕.Am J Pathol,2000；156(3):965-76.

8Lin D,Zhou L,Wang B,etal.Overexpression of HIF-1α in mesenchymal stem cells contributes to repairing hypoxic-ischemic brain damage in rats〔J〕.C R Biol,2017；340(1):18-24.

9Iturriaga R,Andrade DC,Del Rio R.Enhanced carotid body chemosensory activity and the cardiovascular alterations induced by intermittent hypoxia〔J〕.Front Physiol,2014；5:468.

TheeffectofchronicintermittenthypoxiaonHIF-αsubunitexpressionintheratcarotidbody

LIChao-Hong,JIAXiang-Lei,HUANGLu,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,HenanKeyLaboratoryofNeuralRegenerationandRepairment,Weihui453100,Henan,China

ObjectiveTo investigate the effect of chronic intermittent hypoxia on the HIF-α subtype expression in rat carotid body.MethodsSD male rats were treated with chronic intermittent hypoxia for 8 hours a day, total 2 weeks. Then the carotid bodies were collected and total RNA were extracted. HIF-α subtypes were examined by RT-PCR.ResultsThe rat carotid body expressed HIF-1α, HIF-2α and HIF-3α mRNA. Chronic intermittent hypoxia increased HIF-2α and HIF-3α mRNA levels, but not influenced HIF-1α mRNA level. VEGF mRNA in rat carotid body was upregulated by chronic intermittent hypoxia.ConclusionsThe rat carotid body expresses three HIF-α subtypes, HIF-2α and HIF-3α but not HIF-1α might be involved in the VEGF upregulation which is considered to be associated with carotid body chemoreflex plasticity induced by chronic intermittent hypoxia.

Chronic intermittent hypoxia; HIF-α; Carotid body

R339.17+2

A

1005-9202(2017)23-5745-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.001

國家自然科學(xué)基金(81470271)

劉玉珍(1964-)，女，教授，主要從事阻塞性睡眠呼吸暫停相關(guān)研究。

李超紅(1988-)，女，助理實(shí)驗(yàn)員，主要從事阻塞性睡眠呼吸暫停相關(guān)研究。

〔2017-09-11修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)