陳亦明 王繼生 徐魯白 周斌 范恒偉 高靜 謝君青

磷酸化4E-BP1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

陳亦明 王繼生 徐魯白 周斌 范恒偉 高靜 謝君青

目的探討磷酸化的真核翻譯起始因子結(jié)合蛋白（p-4E-BP1）在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組化染色檢測(cè)164例患者結(jié)直腸癌組織中p-4E-BP1表達(dá)，采用qRT-PCR、Western bolt法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1、p-4E-BP1的mRNA、蛋白表達(dá)，應(yīng)用Kaplan-Meier法和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行生存分析。結(jié)果164例結(jié)直腸癌患者中p-4E-BP1均有表達(dá)，其中低表達(dá)69例（42.1%），高表達(dá)95例（57.9%）。p-4E-BP1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)，其中細(xì)胞分化較差、浸潤(rùn)較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較晚的結(jié)直腸癌患者p-4E-BP1表達(dá)均較高（均P＜0.05）。結(jié)直腸癌組織中4E-BP1 mRNA、蛋白表達(dá)與癌旁正常組織比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而p-4E-BP1蛋白表達(dá)較癌旁正常組織明顯增高（P＜0.05）。p-4E-BP1高表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期均明顯短于低表達(dá)組（均P＜0.05）。p-4E-BP1蛋白表達(dá)是影響患者術(shù)后總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（RR=5.414、4.754，均P＜0.05）。結(jié)論p-4E-BP1高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展以及不良預(yù)后相關(guān)，p-4E-BP1可作為臨床判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一個(gè)新指標(biāo)。

結(jié)腸直腸癌4E-BP1磷酸化臨床病理特征預(yù)后

真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4E-BP1）由118個(gè)氨基酸組成，編碼基因定位于染色體8p12，對(duì)真核翻譯起始因子4E（eIF4E）活性的調(diào)節(jié)起著重要作用。4E-BP1是PI3K/AKT/mTOR和RAS/MAPK信號(hào)通路最具代表性的底物。4E-BP1被哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化活化后，參與RNA翻譯和細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控[1-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化4E-BP1（p-4E-BP1）的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌、肝門膽管癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌和腎癌等惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)[4-8]，提示p-4E-BP1發(fā)揮致癌作用。本研究擬通過(guò)檢測(cè)p-4E-BP1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，以探討其與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象選擇2007年3月至2009年10月在本院行根治性或姑息性切除的結(jié)直腸癌患者164例為研究對(duì)象，其中男75例，女89例；年齡21～91（65.3±14.6）歲。所有患者術(shù)前均未接受放、化療等抗腫瘤治療，并具有完整的臨床資料記錄和隨訪記錄。收集手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本及距離腫瘤5cm的正常結(jié)直腸組織標(biāo)本，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑p-4E-BP1（Thr37/46）單克隆抗體和4EBP1單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；En vision免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司；Trizol試劑盒和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。所用引物由上海鉑尚生物科技有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成（4E-BP1上游引物為5′-GGGGACTACAGCACGAC-3′，下游引物為5′-CGCCCG CTTATCTTCT-3′；內(nèi)參照基因GAPDH上游引物為5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物為5′-CCTGGAAGATGGTGA TGGG-3′）。

1.3 免疫組化染色及判定標(biāo)準(zhǔn)將手術(shù)中切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本用10%甲醛固定，常規(guī)脫水并石蠟包埋，制成4μm組織切片。將切片置于溫?zé)岬亩妆饺芤褐谐浞置撓灒缓笾糜谔荻纫掖贾薪菟?%過(guò)氧化氫中封閉10min。用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液在95～100℃下抗原修復(fù)10min；用3%BSA封閉后，滴加兔抗p-4EBP1（Thr37/46）單克隆抗體（1∶300）4°C孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，滴加聚合物增強(qiáng)劑并室溫孵育20min；漂洗后加入酶標(biāo)二抗，37°C水浴箱孵育30min；DAB試劑顯影5min，蘇木精復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。用雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。p-4E-BP1蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞呈淡黃、棕黃、黃褐色。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，得出陽(yáng)性細(xì)胞百分比并賦分值：＜10%為0分，10%～為1分，33%～為2分，≥66%為3分；免疫染色強(qiáng)度賦分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；2項(xiàng)評(píng)分的乘積為該例標(biāo)本的最終染色評(píng)分值，按分值高低分級(jí)，即≤6分為低表達(dá)，＞6分為高表達(dá)。1.4qRT-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)根據(jù)TRIZOL試劑說(shuō)明書(shū)裂解結(jié)直腸癌及癌旁正常組織，以分離總RNA；使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，以總RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增條件：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸1min；30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸5min。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)提取結(jié)直腸癌及癌旁正常組織的總蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中總蛋白濃度。各組上樣30μg總蛋白，用10%SDSPAGE分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2h，一抗4E-BP1（1∶1 000）和p-4EBP1（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，10min/次；將膜浸泡到相應(yīng)的二抗中，室溫孵育2h；再次洗滌，化學(xué)發(fā)光顯影。用Image J圖像分析軟件對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行定量分析，以β-Actin為內(nèi)參計(jì)算4E-BP1表達(dá)水平，以4E-BP1為內(nèi)參計(jì)算p-4E-BP1表達(dá)水平；通過(guò)計(jì)算與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值，得到相對(duì)表達(dá)水平。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料呈正態(tài)分布表示，組間比較采用方差分析；若呈偏態(tài)分布用M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析；總生存期是指手術(shù)日至病死或最后隨訪日期的時(shí)間，無(wú)進(jìn)展生存期是指手術(shù)日至疾病進(jìn)展或最后一次隨訪的時(shí)間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果免疫組化染色結(jié)果顯示，p-4E-BP1在結(jié)直腸癌組織中均有表達(dá)，在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色或棕褐色，呈彌漫性分布。其中低表達(dá)69例（42.1%），高表達(dá)95例（57.9%），見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化染色檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中p-4E-BP1的表達(dá)（a：p-4E-BP1在癌組織中低表達(dá)；b：p-4E-BP1在癌組織中高表達(dá)；En vision法，×200）

2.2 p-4E-BP1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系p-4EBP1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑和血行轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）；但與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)（均P＜0.05），其中細(xì)胞分化較差、浸潤(rùn)較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較晚的結(jié)直腸癌患者p-4E-BP1表達(dá)較高，見(jiàn)表1。

表1 164例結(jié)直腸癌患者p-4E-BP1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 p-4E-BP1在結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織的表達(dá)比較qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中4EBP1 mRNA表達(dá)與癌旁正常組織比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。Western blot結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中4E-BP1蛋白表達(dá)與癌旁正常組織比較，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而結(jié)直腸癌組織中p-4EBP1蛋白表達(dá)較癌旁正常組織明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3-4。

圖2 164例結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1 mRNA表達(dá)的比較

圖3 Western blot檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表達(dá)的電泳圖（T：結(jié)直腸癌組織；N：癌旁正常組織；α-Actin：內(nèi)參對(duì)照）

2.4 p-4E-BP1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌術(shù)后生存期的關(guān)系p-4E-BP1高表達(dá)組中位無(wú)進(jìn)展生存期為25（17.4，27.2）個(gè)月，明顯短于低表達(dá)組的38（29.3，44.7）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；p-4E-BP1高表達(dá)組總生存期為67（52.7，73.2）個(gè)月，亦明顯短于低表達(dá)組的82（68.5，91.3）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者結(jié)直腸癌術(shù)后Kaplan-Meier生存曲線見(jiàn)圖5。

圖4 164例結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表達(dá)的比較（a：4E-BP1相對(duì)α-Actin的表達(dá)；b：p-4E-BP1相對(duì)4E-BP1的表達(dá)）

2.5 影響結(jié)直腸癌患者生存因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析將患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移、TNM分期、p-4EBP1蛋白表達(dá)等10項(xiàng)臨床病理特征納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移、TNM分期與總生存期均存在相關(guān)性（均P＜0.05），分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移、TNM分期與無(wú)進(jìn)展生存期均有相關(guān)性（均P＜0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)p-4E-BP1蛋白表達(dá)是影響患者術(shù)后總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（RR=5.414、4.754，均P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖5 不同p-4E-BP1蛋白表達(dá)的結(jié)直腸癌患者Kaplan-Meier生存曲線（a：無(wú)進(jìn)展生存；b：總生存）

表2 影響結(jié)直腸癌患者生存因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

近年來(lái)，結(jié)直腸癌發(fā)病率及病死率逐年上升，結(jié)直腸癌患者也呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高、復(fù)發(fā)后易導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，尋找一種新的預(yù)后標(biāo)志物對(duì)預(yù)防結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移并改善患者預(yù)后具有重要意義。近年來(lái)研究表明，多個(gè)分子標(biāo)志物與常規(guī)臨床病理因素結(jié)合，能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后[9-11]。生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。膜生長(zhǎng)因子受體被激活后通過(guò)PI3K/AKT/mTOR和RAS/MAPK信號(hào)通路將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。與細(xì)胞增殖、存活、凋亡和代謝相關(guān)的MAPK信號(hào)通路，參與介導(dǎo)4E-BP1的磷酸化。PI3K/AKT經(jīng)典的信號(hào)通路也經(jīng)mTOR磷酸化激活下游分子4E-BP1，進(jìn)而啟動(dòng)mRNA的翻譯[1-3]。在帽依賴性翻譯期間，eIF4E結(jié)合mRNA帽子結(jié)構(gòu)并促進(jìn)eIF4E起始復(fù)合物的形成。非磷酸化的4E-BP1競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到eIF4E，并阻礙帽依賴性mRNA翻譯起始復(fù)合物的形成，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始。當(dāng)4E-BP1接受上游信號(hào)被磷酸化激活后，4E-BP1與eIF4E解離，促使eIF4E起始復(fù)合物的形成，從而啟動(dòng)帽依賴性翻譯，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[12]。eIF4E能調(diào)控翻譯，是腫瘤發(fā)生中起重要作用的關(guān)鍵蛋白，如Myc、細(xì)胞周期蛋白D1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[13]，4E-BP1抑制eIF4E調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)翻譯；反之，4E-BP1磷酸化使這種抑制作用解除。因此，4E-BP1的磷酸化具有致癌潛力。研究發(fā)現(xiàn)p-4E-BP1和eIF4E協(xié)同促進(jìn)腎癌的進(jìn)展[8]。Avdulov等[14]研究表明eIF4E是乳腺癌惡性表型的重要標(biāo)志，4EBP1磷酸化對(duì)乳腺細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化起著重要作用。此外，4E-BP1磷酸化位點(diǎn)的突變可以抑制乳腺細(xì)胞的惡化；但這些4E-BP1磷酸化位點(diǎn)突變恢復(fù)后，又重現(xiàn)了它們的惡性表型。上述證據(jù)提示4E-BP1磷酸化可能通過(guò)釋放eIF4E并增強(qiáng)帽依賴性翻譯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中p-4E-BP1表達(dá)水平升高。相關(guān)研究報(bào)道在食管鱗狀細(xì)胞癌、肝門膽管癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌和腎癌等惡性腫瘤組織中p-4E-BP1表達(dá)亦明顯升高[4-8]，與本研究結(jié)果一致。本研究對(duì)164例結(jié)直腸癌患者分析發(fā)現(xiàn)，p-4E-BP1的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均明顯相關(guān)；組織細(xì)胞分化差、浸潤(rùn)深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期較晚的結(jié)直腸癌組織中p-4E-BP1表達(dá)水平較高。對(duì)6例結(jié)直腸癌患者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中4E-BP1的mRNA、蛋白表達(dá)水平與癌旁正常組織比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而p-4E-BP1蛋白水平明顯增加。根據(jù)以上結(jié)果，筆者推測(cè)4E-BP1磷酸化促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，具有潛在的促癌功能。但由于本研究RT-PCR和Western blot的樣本量較少，且組織標(biāo)本可能存在異質(zhì)性，故該結(jié)論尚需大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。此外，本研究通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)，p-4E-BP1蛋白表達(dá)水平與總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期密切相關(guān)，說(shuō)明p-4E-BP1蛋白高表達(dá)可提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。

綜上所述，p-4E-BP1在結(jié)直腸癌中表達(dá)增加，且p-4E-BP1高表達(dá)與結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)行為以及不良預(yù)后相關(guān)。因此，p-4E-BP1可作為結(jié)直腸癌預(yù)測(cè)預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，抑制4E-BP1磷酸化可能成為結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)。

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Expression of phosphorylated 4E-BP1 and its relationship to prognosis in colorectal cancer

CHEN Yiming,WANG Jisheng,XU Lubai,et al.
Department of Hepatobiliary Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

ObjectiveTo evaluate the expression of phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein(p-4E-BP1)and to assess its relationship with clinicopathological features and prognosis in patients with colorectal cancer.Methods The expression of p-4E-BP1in164specimens of colorectal cancer tissuewasdetected with immunohistochemistry.The expression of 4E-BP1 mRNA and protein in colorectal cancer and adjacent normal tissues were detected with qRT-PCR and Western bolt,respectively.Kaplan-Meier method and Cox proportional hazards regression model were used to analyze the survival of patients with colorectal cancer.Resultsp-4E-BP1 was positive in all colorectal cancer samples,including 95(57.9%)cases with high expression and 69(42.1%)cases with low expression.The expression level of p-4E-BP1 was significantly associated with tumor differentiation,invasive depth,lymph node metastasis and TNM stage.High expression of p-4E-BP1 was observed in colorectal cancer patients with poor differentiation,deeper infiltration,regional lymph node metastasis and later TNM stage(all P＜0.05).Although there were no significant differences in mRNA and protein expression of 4E-BP1 between tumor tissue and adjacent normal colorectal tissue,the phosphorylation level of 4E-BP1 was markedly increased in colorectal cancer tissue(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that the overall survival and progression-free survival of the p-4E-BP1 high expression group was significantly shorter than these of the low expression group(both P＜0.05).Cox proportional hazards model revealed that p-4E-BP1 was an independent adverse prognostic factor for both overall survival(RR=5.414,P＜0.05)and progression-free survival(RR=4.754,P＜0.05)in colorectal cancer patients.Conclusion High p-4E-BP1 expression is associated with tumor progression and adverse prognosis.p-4E-BP1 might serve as a novel biomarker to predict the clinical outcome of patients with colorectal cancer.

Colorectal cancer4E-BP1 Phosphorylation Clinicopathological features Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-223

325027溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科

王繼生，E-mail：wenzhouwjs@163.com

2017-02-07）

（本文編輯：陳丹）