陳亦明 王繼生 徐魯白 周斌 范恒偉 高靜 謝君青

磷酸化4E-BP1在結直腸癌中的表達及與臨床病理特征、預后的關系

陳亦明 王繼生 徐魯白 周斌 范恒偉 高靜 謝君青

目的探討磷酸化的真核翻譯起始因子結合蛋白（p-4E-BP1）在結直腸癌組織中的表達及與臨床病理特征、預后的關系。方法采用免疫組化染色檢測164例患者結直腸癌組織中p-4E-BP1表達，采用qRT-PCR、Western bolt法檢測結直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1、p-4E-BP1的mRNA、蛋白表達，應用Kaplan-Meier法和Cox比例風險回歸模型對結直腸癌患者進行生存分析。結果164例結直腸癌患者中p-4E-BP1均有表達，其中低表達69例（42.1%），高表達95例（57.9%）。p-4E-BP1表達與結直腸癌患者的腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期均有關，其中細胞分化較差、浸潤較深、淋巴結轉移、TNM分期較晚的結直腸癌患者p-4E-BP1表達均較高（均P＜0.05）。結直腸癌組織中4E-BP1 mRNA、蛋白表達與癌旁正常組織比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；而p-4E-BP1蛋白表達較癌旁正常組織明顯增高（P＜0.05）。p-4E-BP1高表達組無進展生存期、總生存期均明顯短于低表達組（均P＜0.05）。p-4E-BP1蛋白表達是影響患者術后總生存期、無進展生存期的獨立風險因素（RR=5.414、4.754，均P＜0.05）。結論p-4E-BP1高表達與腫瘤進展以及不良預后相關，p-4E-BP1可作為臨床判斷結直腸癌患者預后的一個新指標。

結腸直腸癌4E-BP1磷酸化臨床病理特征預后

真核翻譯起始因子4E-結合蛋白（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4E-BP1）由118個氨基酸組成，編碼基因定位于染色體8p12，對真核翻譯起始因子4E（eIF4E）活性的調節(jié)起著重要作用。4E-BP1是PI3K/AKT/mTOR和RAS/MAPK信號通路最具代表性的底物。4E-BP1被哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化活化后，參與RNA翻譯和細胞生長的調控[1-3]。近年來研究發(fā)現，磷酸化4E-BP1（p-4E-BP1）的高表達與食管鱗狀細胞癌、肝門膽管癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌和腎癌等惡性程度及預后密切相關[4-8]，提示p-4E-BP1發(fā)揮致癌作用。本研究擬通過檢測p-4E-BP1在結直腸癌中的表達，以探討其與結直腸癌臨床病理特征及預后的關系。

1 對象和方法

1.1 對象選擇2007年3月至2009年10月在本院行根治性或姑息性切除的結直腸癌患者164例為研究對象，其中男75例，女89例；年齡21～91（65.3±14.6）歲。所有患者術前均未接受放、化療等抗腫瘤治療，并具有完整的臨床資料記錄和隨訪記錄。收集手術切除的結直腸癌組織標本及距離腫瘤5cm的正常結直腸組織標本，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑p-4E-BP1（Thr37/46）單克隆抗體和4EBP1單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；En vision免疫組化檢測試劑盒購自丹麥Dako公司；Trizol試劑盒和M-MLV逆轉錄酶均購自美國Invitrogen公司；實時PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司；BCA試劑盒購自美國Thermo公司。所用引物由上海鉑尚生物科技有限公司根據設計合成（4E-BP1上游引物為5′-GGGGACTACAGCACGAC-3′，下游引物為5′-CGCCCG CTTATCTTCT-3′；內參照基因GAPDH上游引物為5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物為5′-CCTGGAAGATGGTGA TGGG-3′）。

1.3 免疫組化染色及判定標準將手術中切除的結直腸癌組織標本用10%甲醛固定，常規(guī)脫水并石蠟包埋，制成4μm組織切片。將切片置于溫熱的二甲苯溶液中充分脫蠟，然后置于梯度乙醇中浸泡水化，3%過氧化氫中封閉10min。用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液在95～100℃下抗原修復10min；用3%BSA封閉后，滴加兔抗p-4EBP1（Thr37/46）單克隆抗體（1∶300）4°C孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加聚合物增強劑并室溫孵育20min；漂洗后加入酶標二抗，37°C水浴箱孵育30min；DAB試劑顯影5min，蘇木精復染。PBS代替一抗作為陰性對照。用雙盲法對染色結果進行評估。p-4E-BP1蛋白主要定位于細胞核和細胞質，陽性細胞呈淡黃、棕黃、黃褐色。每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，得出陽性細胞百分比并賦分值：＜10%為0分，10%～為1分，33%～為2分，≥66%為3分；免疫染色強度賦分標準：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；2項評分的乘積為該例標本的最終染色評分值，按分值高低分級，即≤6分為低表達，＞6分為高表達。1.4qRT-PCR法檢測mRNA表達根據TRIZOL試劑說明書裂解結直腸癌及癌旁正常組織，以分離總RNA；使用M-MLV逆轉錄酶，以總RNA為模版逆轉錄成cDNA。PCR擴增條件：95°C預變性3min，94°C變性30s，55°C復性30s，72°C延伸1min；30個循環(huán)后，72°C延伸5min。以GAPDH為內參，根據2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達水平。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達提取結直腸癌及癌旁正常組織的總蛋白，使用BCA試劑盒檢測細胞中總蛋白濃度。各組上樣30μg總蛋白，用10%SDSPAGE分離蛋白質后轉至硝酸纖維素膜，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2h，一抗4E-BP1（1∶1 000）和p-4EBP1（1∶1 000）4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，10min/次；將膜浸泡到相應的二抗中，室溫孵育2h；再次洗滌，化學發(fā)光顯影。用Image J圖像分析軟件對目的條帶灰度值進行定量分析，以β-Actin為內參計算4E-BP1表達水平，以4E-BP1為內參計算p-4E-BP1表達水平；通過計算與相應內參灰度值的比值，得到相對表達水平。1.6統(tǒng)計學處理應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料呈正態(tài)分布表示，組間比較采用方差分析；若呈偏態(tài)分布用M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析；總生存期是指手術日至病死或最后隨訪日期的時間，無進展生存期是指手術日至疾病進展或最后一次隨訪的時間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果免疫組化染色結果顯示，p-4E-BP1在結直腸癌組織中均有表達，在細胞核、細胞質染成棕黃色或棕褐色，呈彌漫性分布。其中低表達69例（42.1%），高表達95例（57.9%），見圖1。

圖1 免疫組化染色檢測結直腸癌組織中p-4E-BP1的表達（a：p-4E-BP1在癌組織中低表達；b：p-4E-BP1在癌組織中高表達；En vision法，×200）

2.2 p-4E-BP1表達與臨床病理特征的關系p-4EBP1表達與結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑和血行轉移均無關（均P＞0.05）；但與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期均有關（均P＜0.05），其中細胞分化較差、浸潤較深、淋巴結轉移、TNM分期較晚的結直腸癌患者p-4E-BP1表達較高，見表1。

表1 164例結直腸癌患者p-4E-BP1表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 p-4E-BP1在結直腸癌組織及其癌旁正常組織的表達比較qRT-PCR檢測發(fā)現結直腸癌組織中4EBP1 mRNA表達與癌旁正常組織比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。Western blot結果顯示結直腸癌組織中4E-BP1蛋白表達與癌旁正常組織比較，差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而結直腸癌組織中p-4EBP1蛋白表達較癌旁正常組織明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3-4。

圖2 164例結直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1 mRNA表達的比較

圖3 Western blot檢測結直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表達的電泳圖（T：結直腸癌組織；N：癌旁正常組織；α-Actin：內參對照）

2.4 p-4E-BP1蛋白表達與結直腸癌術后生存期的關系p-4E-BP1高表達組中位無進展生存期為25（17.4，27.2）個月，明顯短于低表達組的38（29.3，44.7）個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；p-4E-BP1高表達組總生存期為67（52.7，73.2）個月，亦明顯短于低表達組的82（68.5，91.3）個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組患者結直腸癌術后Kaplan-Meier生存曲線見圖5。

圖4 164例結直腸癌組織及其癌旁正常組織中4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表達的比較（a：4E-BP1相對α-Actin的表達；b：p-4E-BP1相對4E-BP1的表達）

2.5 影響結直腸癌患者生存因素的Cox比例風險回歸分析將患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移、血行轉移、TNM分期、p-4EBP1蛋白表達等10項臨床病理特征納入Cox比例風險回歸模型進行分析，結果顯示腫瘤直徑、淋巴結轉移、血行轉移、TNM分期與總生存期均存在相關性（均P＜0.05），分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、血行轉移、TNM分期與無進展生存期均有相關性（均P＜0.05）。同時發(fā)現p-4E-BP1蛋白表達是影響患者術后總生存期、無進展生存期的獨立風險因素（RR=5.414、4.754，均P＜0.05），見表2。

圖5 不同p-4E-BP1蛋白表達的結直腸癌患者Kaplan-Meier生存曲線（a：無進展生存；b：總生存）

表2 影響結直腸癌患者生存因素的Cox比例風險回歸分析

3 討論

近年來，結直腸癌發(fā)病率及病死率逐年上升，結直腸癌患者也呈現年輕化趨勢，且術后復發(fā)率高、復發(fā)后易導致預后不良。因此，尋找一種新的預后標志物對預防結直腸癌的復發(fā)、轉移并改善患者預后具有重要意義。近年來研究表明，多個分子標志物與常規(guī)臨床病理因素結合，能更準確地預測結直腸癌患者的預后[9-11]。生長因子受體和細胞信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用。膜生長因子受體被激活后通過PI3K/AKT/mTOR和RAS/MAPK信號通路將信號轉導入細胞內，促進細胞增殖。與細胞增殖、存活、凋亡和代謝相關的MAPK信號通路，參與介導4E-BP1的磷酸化。PI3K/AKT經典的信號通路也經mTOR磷酸化激活下游分子4E-BP1，進而啟動mRNA的翻譯[1-3]。在帽依賴性翻譯期間，eIF4E結合mRNA帽子結構并促進eIF4E起始復合物的形成。非磷酸化的4E-BP1競爭性地結合到eIF4E，并阻礙帽依賴性mRNA翻譯起始復合物的形成，從而抑制蛋白質的翻譯起始。當4E-BP1接受上游信號被磷酸化激活后，4E-BP1與eIF4E解離，促使eIF4E起始復合物的形成，從而啟動帽依賴性翻譯，促進蛋白質的合成[12]。eIF4E能調控翻譯，是腫瘤發(fā)生中起重要作用的關鍵蛋白，如Myc、細胞周期蛋白D1、血管內皮生長因子和成纖維細胞生長因子[13]，4E-BP1抑制eIF4E調節(jié)的蛋白質翻譯；反之，4E-BP1磷酸化使這種抑制作用解除。因此，4E-BP1的磷酸化具有致癌潛力。研究發(fā)現p-4E-BP1和eIF4E協(xié)同促進腎癌的進展[8]。Avdulov等[14]研究表明eIF4E是乳腺癌惡性表型的重要標志，4EBP1磷酸化對乳腺細胞的惡性轉化起著重要作用。此外，4E-BP1磷酸化位點的突變可以抑制乳腺細胞的惡化；但這些4E-BP1磷酸化位點突變恢復后，又重現了它們的惡性表型。上述證據提示4E-BP1磷酸化可能通過釋放eIF4E并增強帽依賴性翻譯，促進腫瘤細胞生長和增殖。

本研究結果發(fā)現，結直腸癌組織中p-4E-BP1表達水平升高。相關研究報道在食管鱗狀細胞癌、肝門膽管癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌和腎癌等惡性腫瘤組織中p-4E-BP1表達亦明顯升高[4-8]，與本研究結果一致。本研究對164例結直腸癌患者分析發(fā)現，p-4E-BP1的表達水平與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期均明顯相關；組織細胞分化差、浸潤深、淋巴結轉移或TNM分期較晚的結直腸癌組織中p-4E-BP1表達水平較高。對6例結直腸癌患者進一步分析發(fā)現，結直腸癌組織中4E-BP1的mRNA、蛋白表達水平與癌旁正常組織比較差異均無統(tǒng)計學意義，而p-4E-BP1蛋白水平明顯增加。根據以上結果，筆者推測4E-BP1磷酸化促進了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，具有潛在的促癌功能。但由于本研究RT-PCR和Western blot的樣本量較少，且組織標本可能存在異質性，故該結論尚需大樣本研究進一步證實。此外，本研究通過生存分析發(fā)現，p-4E-BP1蛋白表達水平與總生存期、無進展生存期密切相關，說明p-4E-BP1蛋白高表達可提示結直腸癌患者預后不良。

綜上所述，p-4E-BP1在結直腸癌中表達增加，且p-4E-BP1高表達與結直腸癌的惡性生物學行為以及不良預后相關。因此，p-4E-BP1可作為結直腸癌預測預后的腫瘤標志物，抑制4E-BP1磷酸化可能成為結直腸癌治療的新靶點。

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Expression of phosphorylated 4E-BP1 and its relationship to prognosis in colorectal cancer

CHEN Yiming,WANG Jisheng,XU Lubai,et al.
Department of Hepatobiliary Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

ObjectiveTo evaluate the expression of phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein(p-4E-BP1)and to assess its relationship with clinicopathological features and prognosis in patients with colorectal cancer.Methods The expression of p-4E-BP1in164specimens of colorectal cancer tissuewasdetected with immunohistochemistry.The expression of 4E-BP1 mRNA and protein in colorectal cancer and adjacent normal tissues were detected with qRT-PCR and Western bolt,respectively.Kaplan-Meier method and Cox proportional hazards regression model were used to analyze the survival of patients with colorectal cancer.Resultsp-4E-BP1 was positive in all colorectal cancer samples,including 95(57.9%)cases with high expression and 69(42.1%)cases with low expression.The expression level of p-4E-BP1 was significantly associated with tumor differentiation,invasive depth,lymph node metastasis and TNM stage.High expression of p-4E-BP1 was observed in colorectal cancer patients with poor differentiation,deeper infiltration,regional lymph node metastasis and later TNM stage(all P＜0.05).Although there were no significant differences in mRNA and protein expression of 4E-BP1 between tumor tissue and adjacent normal colorectal tissue,the phosphorylation level of 4E-BP1 was markedly increased in colorectal cancer tissue(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that the overall survival and progression-free survival of the p-4E-BP1 high expression group was significantly shorter than these of the low expression group(both P＜0.05).Cox proportional hazards model revealed that p-4E-BP1 was an independent adverse prognostic factor for both overall survival(RR=5.414,P＜0.05)and progression-free survival(RR=4.754,P＜0.05)in colorectal cancer patients.Conclusion High p-4E-BP1 expression is associated with tumor progression and adverse prognosis.p-4E-BP1 might serve as a novel biomarker to predict the clinical outcome of patients with colorectal cancer.

Colorectal cancer4E-BP1 Phosphorylation Clinicopathological features Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-223

325027溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科

王繼生，E-mail：wenzhouwjs@163.com

2017-02-07）

（本文編輯：陳丹）