王丹 阮妙華 周愛華 錢燕 陳亦明

●論著

同型半胱氨酸對(duì)C17.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的影響及作用機(jī)制

王丹 阮妙華 周愛華 錢燕 陳亦明

目的探討同型半胱氨酸（Hcy）對(duì)C17.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的影響及可能的分子機(jī)制。方法培養(yǎng)C17.2小鼠NSCs，分為對(duì)照組、0.25mM Hcy組、0.25mM Hcy+5mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）組；加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)24h后，采用CCK-8法檢測(cè)各組NSCs生長(zhǎng)活力，流式細(xì)胞術(shù)和Caspase-3法檢測(cè)Hcy對(duì)NSCs凋亡的影響，彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hcy對(duì)NSCs DNA的損傷程度，H2DCF-DA染色檢測(cè)NSCs的氧自由基（ROS）水平。結(jié)果Hcy能誘導(dǎo)細(xì)胞ROS產(chǎn)生和DNA損傷，從而導(dǎo)致NSCs凋亡增加。相反，NAC可降低Hcy誘發(fā)的ROS產(chǎn)生，明顯改善DNA損傷，提高細(xì)胞存活率。結(jié)論Hcy能誘導(dǎo)NSCs ROS產(chǎn)生和DNA損傷，并導(dǎo)致NSCs凋亡；而減少Hcy引發(fā)的ROS產(chǎn)生可以明顯改善DNA損傷并提高細(xì)胞存活率。

同型半胱氨酸DNA損傷氧化應(yīng)激神經(jīng)干細(xì)胞

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種蛋氨酸代謝過程中產(chǎn)生的非蛋白氨基酸，在兒童和成人神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1-2]。有研究表明母體血漿中的高Hcy水平與胎兒神經(jīng)管畸形有關(guān)[1]。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)血漿Hcy水平與神經(jīng)退行性疾病（如認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病和中風(fēng)等）相關(guān)[2]。體外實(shí)驗(yàn)和小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hcy對(duì)人和鼠神經(jīng)元細(xì)胞有毒害作用[3]。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）能夠分化成神經(jīng)元細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，在胚胎神經(jīng)發(fā)生和成人大腦的損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。相關(guān)研究表明NSCs對(duì)細(xì)胞外Hcy非常敏感，Hcy能抑制NSCs的增殖和分化能力[4-5]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究檢測(cè)并觀察經(jīng)Hcy處理后C17.2小鼠NSCs的氧自由基（ROS）水平和DNA損傷程度，以探討Hcy對(duì)NSCs的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑C17.2小鼠NSCs購(gòu)自英國(guó)歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心；Dullbecco改良的Eagle培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；D，L-Hcy、N-乙酰半胱氨酸（NAC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)B.D.Biosciences Pharmingen公司；Caspase-3試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；彗星測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Trevigen公司；H2DCF-DA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fluka公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將C17.2小鼠NSCs置于含10%FBS、5%馬血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dullbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，在37°C、5%CO2、相對(duì)濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后將C17.2小鼠NSCs分為3組，分別為對(duì)照組、0.25mM Hcy組和0.25mM Hcy＋5mM NAC組（后兩組稱為實(shí)驗(yàn)組），上述藥物用雙蒸水稀釋至工作濃度后加入培養(yǎng)基中作用24h。

1.2.2 NSCs生長(zhǎng)活力的檢測(cè)采用CCK-8法。將C17.2小鼠NSCs以4 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加Eagle培養(yǎng)基，平行6孔為復(fù)孔，培養(yǎng)24h后分成以上3組，置于培養(yǎng)箱中。接種1、2、3d后，每孔依次加入CCK-8試劑10μl，置37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，并設(shè)不加NSCs的空白組；在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD值）。取每天6孔平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞生長(zhǎng)活力用細(xì)胞存活率進(jìn)行評(píng)估，細(xì)胞存活率=（OD值實(shí)驗(yàn)組-OD值空白組）/（OD值對(duì)照組-OD值空白組）×100%。

1.2.3 Hcy對(duì)NSCs凋亡影響的檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)和Caspase-3法。（1）流式細(xì)胞術(shù)：C17.2小鼠NSCs經(jīng)Hcy或Hcy＋NAC處理24h后，用胰酶消化并收集各組細(xì)胞，再以1×106個(gè)/ml的濃度將細(xì)胞重懸于1×緩沖液（0.01M 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.14M NaCl，2.5mM CaCl2，pH7.4）中，5μl Annexin-V和5μl propidium iodide（PI）室溫避光孵育15min后，再加入400μl緩沖液，使用Accurri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，Annexin-V和/或PI染色陽性細(xì)胞均為凋亡細(xì)胞，Annexin-V和PI染色陰性細(xì)胞為正常細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用FlowJo 7.6.2軟件進(jìn)行分析。凋亡細(xì)胞百分比=[凋亡細(xì)胞/（凋亡細(xì)胞＋正常細(xì)胞）]×100%。（2）Caspase-3法：使用冷PBS洗滌并收集各組C17.2小鼠NSCs；隨后加入細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞裂解物稀釋至約3mg/ml；再按照Caspase-3試劑盒說明書進(jìn)行處理。使用VeritasTM發(fā)光檢測(cè)儀在380、460nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每個(gè)樣品的熒光值。將對(duì)照組的熒光值設(shè)定為1，其他組的熒光值均為對(duì)照組的相對(duì)值，即相對(duì)Caspase-3活性。

1.2.4 Hcy對(duì)NSCs DNA損傷程度的檢測(cè)采用彗星實(shí)驗(yàn)。將各組C17.2小鼠NSCs包埋在鋪于載玻片上1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中，再在4°C下用裂解液裂解過夜。DNA在室溫、堿性條件下解鏈20min，然后在300mA、堿性條件下電泳30min。將載玻片用雙蒸水漂洗5min×2次，75%乙醇中脫水5min，再用SYBR Green溶液染色30min，最后在Leica DMI 4 000B熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長(zhǎng)425～500nm）。在400倍鏡下隨機(jī)選取50個(gè)細(xì)胞并拍攝照片用于評(píng)估DNA損傷程度。鏡下表現(xiàn)：（1）未損傷DNA保持球形；（2）受損DNA則產(chǎn)生拖尾，類似“彗星”；損傷愈重，拖尾愈長(zhǎng)。采用彗星陽性細(xì)胞百分比和Olive尾矩（OTM）評(píng)估DNA損傷程度。使用CPAP1.2.3軟件進(jìn)行圖像分析并得出OTM值。OTM值=尾部DNA%×頭部中心到尾部中心的距離。

1.2.5 NSCs ROS水平的檢測(cè)采用H2DCF-DA染色法。C17.2小鼠NSCs經(jīng)Hcy或Hcy＋NAC分別處理1、2、3d后，加入10μmol/L的H2DCF-DA溶液，于37°C孵育30min，PBS漂洗2次后收集細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察并測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm。將對(duì)照組的熒光值設(shè)定為1，其他組的熒光值均為對(duì)照組的相對(duì)值，即ROS水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對(duì)C17.2小鼠NSCs生長(zhǎng)活力的影響CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)Hcy處理1、2、3d后，C17.2小鼠NSCs活力較對(duì)照組分別降低28.34%、38.28%和43.85%（均P＜0.05），呈時(shí)間依賴性；經(jīng)Hcy＋NAC處理1、2、3d后，C17.2小鼠NSCs活力較Hcy組均明顯增加（均P＜0.05），見圖1。

圖1 3組C17.2小鼠NSCs經(jīng)處理1、2、3d后的OD值（與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05）

2.2 Hcy對(duì)C17.2小鼠NSCs凋亡的影響經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Hcy組凋亡細(xì)胞百分比為（43.90±8.00）%，明顯高于對(duì)照組的（16.43±2.68）%（P＜0.01）；Hcy+NAC組凋亡細(xì)胞百分比為（25.11±3.02）%，較Hcy組明顯減少（P＜0.05），見圖2a-b。經(jīng)Caspase-3法測(cè)定，Hcy組Caspase-3活性較對(duì)照組增加2.12倍（P＜0.01）；Hcy+NAC組較Hcy組降低34.92%（P＜0.01），見圖2c。

圖2 3組C17.2小鼠NSCs的凋亡情況比較（a-b：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；c：Caspase-3活性；與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

2.3 Hcy對(duì)C17.2小鼠NSCs DNA損傷的影響彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組中僅檢測(cè)到少量彗星陽性細(xì)胞，為10.05%；與對(duì)照組比較，Hcy組彗星陽性細(xì)胞和OTM值均明顯上升（均P＜0.01）；與Hcy組比較，Hcy+NAC組彗星陽性細(xì)胞和OTM值分別降低43.14%、46.33%（均P＜0.05），見圖3。說明Hcy誘導(dǎo)C17.2細(xì)胞DNA損傷，而NAC能緩解Hcy造成的DNA損傷。

2.4 Hcy對(duì)C17.2小鼠NSCs ROS的影響與對(duì)照組比較，經(jīng)Hcy處理1、2、3d后C17.2小鼠NSCs內(nèi)ROS產(chǎn)生分別增加了1.1、1.7、2.9倍（均P＜0.05），呈時(shí)間依賴性；與Hcy組比較，經(jīng)Hcy+NAC處理1、2、3d后C17.2小鼠NSCs內(nèi)ROS產(chǎn)生均明顯減少（均P＜0.05），見圖4。

3 討論

Hcy是必需氨基酸甲硫氨酸的代謝產(chǎn)物，具有神經(jīng)毒性。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，在阿爾茨海默病、血管性癡呆、中風(fēng)和認(rèn)知障礙等成年神經(jīng)疾病的患者中，Hcy水平明顯升高[2]。母體血漿Hcy水平的升高與胎兒神經(jīng)管畸形有關(guān)，雞胚模型證實(shí)了過量Hcy能誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形[1，6]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明Hcy能誘導(dǎo)NSCs凋亡[4-5]。但目前關(guān)于Hcy影響NSCs的分子機(jī)制尚未完全清楚。本研究經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hcy能增加C17.2小鼠NSCs ROS的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，導(dǎo)致NSCs凋亡增加。NAC是一種常用的抗氧化劑，可以減少由Hcy誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，改善DNA損傷并提高NSCs存活率。以上結(jié)果表明Hcy通過氧化應(yīng)激引起DNA損傷，從而誘導(dǎo)NSCs凋亡。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hcy誘導(dǎo)C17.2小鼠NSCs DNA損傷，而NAC能緩解Hcy造成的細(xì)胞DNA損傷。在皮層和海馬神經(jīng)元細(xì)胞研究中亦發(fā)現(xiàn)Hcy升高誘導(dǎo)DNA損傷和細(xì)胞凋亡[3，7]。Picerno等[8]發(fā)現(xiàn)人外周血淋巴細(xì)胞中加入Hcy培養(yǎng)后會(huì)導(dǎo)致DNA損傷和微核比例增加；Vanzin等[9]發(fā)現(xiàn)Hcy以濃度依賴性誘導(dǎo)白細(xì)胞DNA損傷，而使用吡哆醇、葉酸、甜菜堿或維生素B12降低Hcy水平后，白細(xì)胞DNA損傷明顯改善。

圖3 3組C17.2小鼠NSCs的DNA損傷情況比較（a：彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果；b：彗星陽性細(xì)胞百分比；C：OTM值；與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

圖4 各組C17.2小鼠NSCs的ROS水平比較（與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

本研究還發(fā)現(xiàn)Hcy誘導(dǎo)C17.2小鼠NSCs ROS生成；而NAC可以通過減少ROS生成，改善DNA損傷和促進(jìn)NSCs存活。既往研究也發(fā)現(xiàn)，Hcy通過產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡，而抗氧化劑NAC能抑制上述作用[10]。此外，在高同型半胱氨酸血癥患者的血漿中也發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷[11]。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)高Hcy水平損害神經(jīng)元細(xì)胞的分子機(jī)制可能是氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy通過增加HL-60細(xì)胞內(nèi)H2O2的生成，介導(dǎo)DNA損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。羅丹紅等[14]研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥患者通過氧化應(yīng)激途徑增加腦梗死發(fā)生率。而本研究結(jié)果表明Hcy可能通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)NSCs的DNA損傷。

綜上所述，Hcy能誘導(dǎo)NSCs ROS產(chǎn)生和DNA損傷，并導(dǎo)致NSCs凋亡；而減少Hcy引發(fā)的ROS產(chǎn)生可以明顯改善DNA損傷并提高細(xì)胞存活率。因此，筆者認(rèn)為Hcy可能通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷，從而促進(jìn)NSCs凋亡；而抗氧化劑可以挽救部分由Hcy導(dǎo)致的NSCs損傷及凋亡，為與Hcy相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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Effects of homocysteine on neural stem cells and its underlying mechanism

WANG Dan,RUAN Miaohua,ZHOU Aihua,et al.
Department of Neonatology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 32500,China

ObjectiveTo investigate the effects of homocysteine(Hcy)on C17.2 mouse neural stem cells(NSCs),and to explore its possible mechanism.MethodsC17.2 mouse NSCs were cultured and divided into blank control group,Hcy group and Hcy+N-acetylcysteine(NAC)group.The growth activity of NSCs was detected by CCK-8 method.The apoptosis of NSCs was assessed by flow cytometry analysis and caspase-3 method.Comet assay was used to evaluate the DNA damage of NSCs.The intracellular reactive oxidative species(ROS)level was detected by H2DCF-DA staining method.Results Hcyevoked ROS production and induced cell DNA damage,leading to an increase in NSCs apoptosis.On contrary,NAC decreased Hcy-evoked ROS production and significantly ameliorated DNA damage and improved NSCs survival.ConclusionHcy may play a negative role in NSCs survival via inducing DNA damage by oxidative stress.

Homocysteine DNA damage Oxidative stress Neural stemcell

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-1547

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81701485）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017KY452）；溫州市科技局項(xiàng)目（2017Y0578）

325000溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科（王丹、阮妙華、周愛華、錢燕）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科（陳亦明）

陳亦明，E-mail：chenyiming209@126.com

2017-07-02）

（本文編輯：陳丹）