郭　　森，朱　　江

（1.承德醫(yī)學院，河北承德　067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院）

慢性腦缺血對大鼠海馬鈣通道Cav1.3表達的影響

郭森1，朱江2

（1.承德醫(yī)學院，河北承德067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院）

目的:探討慢性腦缺血后大鼠海馬鈣通道Cav1.3蛋白表達的變化。方法：雄性Wistar大鼠36只隨機分為假手術組、缺血7d組和缺血14d組。通過阻斷左側椎動脈和雙側頸總動脈的方法制作慢性腦缺血模型。采用尼氏染色法觀察海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)結構的變化，蛋白質印跡法檢測大鼠海馬鈣通道Cav1.3蛋白的表達情況。結果：與缺血7d組比較，缺血14d組大鼠海馬CA1區(qū)神經元的病理變化明顯加重。隨著缺血時間的延長，海馬鈣通道Cav1.3蛋白的表達明顯降低。結論：慢性腦缺血可能通過降低海馬鈣通道Cav1.3蛋白的表達影響海馬神經元的正常功能。

慢性腦缺血；海馬；L型鈣通道

L型鈣通道是身體內重要的電壓依賴型鈣通道，根據其α1亞單位編碼基因的不同，可進一步分為Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4四個亞型。Cav1.3鈣通道主要分布于中樞神經系統(tǒng)，參與鈣穩(wěn)態(tài)、激素分泌、基因表達和突觸可塑性等多種功能的調控，并在神經元的存活和死亡中有重要作用[1]。近年來，有學者通過對Cav1.3鈣通道在正常中樞神經系統(tǒng)中分布特征的研究深入探討了Cav1.3鈣通道的具體功能及作用機制[2]。本研究對腦海馬組織缺血過程中神經元鈣通道Cav1.3表達的變化進行了探討，以分析鈣通道Cav1.3在腦組織缺血過程中發(fā)揮的作用及可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組SPF級成年雄性Wistar大鼠36只，200-220g，隨機分為3組，假手術組、缺血7d組和缺血14d組。缺血組大鼠阻斷左側椎動脈和雙側頸總動脈；假手術組只暴露相應動脈，不予阻斷。

1.2主要藥品和試劑兔源性抗Cav1.3抗體（Abcam公司），小鼠源性抗β-actin抗體、總蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3大鼠腦缺血模型的制備采用改良的的三血管閉塞法[3]制作大鼠慢性腦缺血模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（350mg/kg）大鼠，仰位固定，暴露右側頸總動脈并結扎切斷；然后俯位固定，沿頸部后正中線切開皮膚，暴露第1頸椎橫突孔，電凝左側椎動脈。1周后結扎左側頸總動脈。

1.4取材缺血7d組和缺血14d組大鼠分別于左側頸總動脈結扎后第7d和第14d取材，每組6只大鼠用于光鏡標本取材，6只用于蛋白印記取材。

1.4.1光鏡標本：10%水合氯醛麻醉大鼠，開胸經主動脈插管后4%多聚甲醛灌流固定，取出腦組織后30%蔗糖浸至組織下沉，行冠狀切面冷凍切片（厚50μm）。

1.4.2Western Blot標本：10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速斷頭取腦，分離海馬、稱重，組織勻漿，提取蛋白，BCA法蛋白定量。

1.5檢測方法

1.5.1尼氏染色：冰凍切片用0.5%明膠貼片，自然干燥，常規(guī)尼氏染色（0.25%硫堇染液）。

1.5.2Western Blot法：采用Western Blot法檢測海馬組織Cav1.3蛋白的表達情況。6% SDS-PAGE凝膠電泳（120V，2.5h），蛋白上樣量100μg，轉膜（300mA，2h），5% BSA封閉2h，Cav1.3一抗（1∶500）4℃孵育過夜，HRP標記山羊抗兔IgG抗體（1∶2000）室溫孵育1h，ECL發(fā)光液顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對顯影條帶進行分析，以目的條帶和β-actin條帶的IOD比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.6統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1海馬神經元尼氏染色結果假手術組大鼠海馬CA1區(qū)神經元分布密集、輪廓清晰，尼氏體著色明顯，多數細胞可見核仁（圖1A）。缺血7d組大鼠海馬CA1區(qū)神經元分布較密集，神經元胞體較假手術組大，染色較淺（圖1B）。缺血14d組大鼠海馬CA1區(qū)神經元分布比較稀疏，胞體輪廓模糊、染色淺（圖1C）。

2.2Western Blot法檢測結果假手術組大鼠海馬Cav1.3蛋白的表達明顯高于缺血7d組和缺血14d組大鼠（P＜0.05）；缺血7d組大鼠海馬Cav1.3蛋白的表達明顯高于缺血14d組大鼠（P＜0.05，見圖2、附表）。

圖1　海馬CA1區(qū)尼氏染色結果

圖2　各組大鼠海馬鈣通道Cav1.3蛋白的表達（Western Blot法）

附表　各組大鼠海馬鈣通道Cav1.3蛋白的表達（n = 6，±s）

附表　各組大鼠海馬鈣通道Cav1.3蛋白的表達（n = 6，±s）

與假手術組比較：*P＜0.05；與缺血7d組比較：△P＜0.05

組別　　鈣通道Cav1.3蛋白（IOD比值）假手術組　1.52±0.14缺血7d組　1.05±0.09＊缺血14d組　0.85±0.05＊△

3　討論

在神經元缺血性損傷的過程中，細胞內Ca2+超載是公認的啟動細胞損傷的關鍵因素。L-型電壓依賴性鈣通道Cav1.3在中樞神經系統(tǒng)有著較為廣泛的分布和重要的生理功能，其在神經系統(tǒng)缺血性損傷Ca2+超載過程中的作用一直廣受關注[4-5]。以往有研究顯示，缺血24h內大鼠大腦皮質中的L-型鈣通道開放明顯增加，提示L-型鈣通道可能是Ca2+內流的主要通道[6]。但是，在慢性缺血性損傷的過程中L-型鈣通道的變化情況目前報道較少。

本研究中尼氏染色結果顯示，隨著缺血時間的延長神經元損傷的程度逐漸加重，但大鼠海馬中L-型鈣通道Cav1.3蛋白的表達（Western Blot法）并未隨缺血損傷的加重而增加，而是表達逐漸降低?？紤]出現這一現象的可能原因是：①Ca2+超載在急性缺血性損傷所致的神經元死亡中起關鍵作用，而慢性缺血性損傷神經元以凋亡為主，Ca2+超載現象不明顯，因此鈣通道Cav1.3表達不增加。②在慢性缺血性損傷中正常生理功能的紊亂可能是造成神經元損傷更重要的機制。鈣通道Cav1.3在正常神經元中參與多種重要的生理功能，其表達的減少更符合慢性缺血時神經元的損傷機制[7-8]。并且已有報道指出，大腦皮質神經元長期接觸L-型鈣通道拮抗劑，使胞內Ca2+降低可誘導神經元凋亡，尤其是在缺血所致遲發(fā)性神經元死亡的過程中， 阻斷L型電壓依賴性鈣通道可致神經細胞凋亡[9]，而L-型鈣通道激動劑Bay K8644可以阻斷缺糖缺氧誘導的細胞凋亡[10]。由此推測，在慢性缺血的過程中，鈣通道Cav1.3表達減少本身可能也是導致遲發(fā)性神經元死亡的重要原因。

[1]Li XM,Li JG,Hu Q,et al.Changes in single L-type calcium channel currents in CA1 pyramidal neurons of rat hippocampus after transient forebrain ischemia[J].Prog Biochem Biophys,2003, 30(5):755-759.

[2]Sukiasyan N,Hultborn H,Zhang ML,et al.Distribution of calcium channel Cav1.3 immunoreactivity in the rat spinal cord and brain stem[J].Neuroscience,2009,159(1):217-235.

[3]劉暉章，軍建，張磊.改良型三血管結扎慢性腦缺血模型大鼠的行為學評價[J].中華行為醫(yī)學與腦科學雜志，2009，11 (18)：966-969.

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[6]王金華，劉佩芳.丹參酮ⅡA對腦缺血再灌注損傷大鼠神經元L-型鈣通道表達的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2008，1（56）：442.

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[8]Nunez-Santana FL, Oh Matthew M, Antion MD, et al. Surface L-type Ca2+channel expression levels are increased in aged hippocampus [J].Aging Cell,2014,13(1):111-120.

[9]Hank S, Kang HJ, Kim EY, et al. 1,2-Bis(2-aminophenoxy) ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid induce caspase mediated apoptosis andreactive oxygen species-mediated necrosis in cultured cortical neurons[J].J Neurochem,2001,78(2):230-239.

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(基礎醫(yī)學欄目編輯：陳志宏)

EFFECTS OF CHRONIC CEREBRAL ISCHEMIA ON CALCIUM CHANNEL CAV1.3 EXPRESSION IN HIPPOCAMPUS OF RATS

GUO Sen, ZHU Jiang
(Chengde Medical College, Hebei Cheng 067000, China)

Objective: To investigate the changes of calcium channel Cav1.3 protein expression in hippocampus of chronic cerebral ischemia rats. Methods:36 male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group, ischemia 7 days group andischemia 14 days group. The chronic cerebral ischemia rats’ model was established by blocking left vertebral artery and common carotid artery on both sides. Nissl’s staining was used to observe the morphology of neurons in hippocampus CA1 region,Western Blot to detect calcium channel Cav1.3 protein expression in hippocampus. Results:Compared with 7 days group, the pathological changes of neurons in hippocampus CA1 region of rats in 14 days group markedly aggravated. With prolongation of ischemic time, the calcium channel Cav1.3 protein expression obviously decreased. Conclusions:Chronic cerebral ischemia may affect the normal function of hippocampal neurons by decreasing the expression of calcium channel Cav1.3 protein in hippocampus.

Chronic cerebral ischemia; Hippocampus; L-type calcium channel

R322.81

A

1004-6879（2017）01-0005-04

（2016-08-01）