孫 燕 饒惠平 李新榮 劉 軍

廣東省中山市南朗醫(yī)院內(nèi)科，廣東中山 528451

核因子-κB在新診斷2型糖尿病肥胖患者中的作用

孫 燕 饒惠平 李新榮 劉 軍

廣東省中山市南朗醫(yī)院內(nèi)科，廣東中山 528451

目的探討核因子-κB在新診斷2型糖尿病肥胖患者中的作用。方法選擇新診斷2型糖尿病患者50例來自內(nèi)科住院（非肥胖者22例，肥胖者28例）。分離血標(biāo)本外周單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)其中NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照。結(jié)果新診斷2型糖尿病肥胖組間血清炎癥因子hsCRP高于非肥胖組（P＜0.01）；2型糖尿病肥胖組間NF-κB p65mRNA水平顯著高于非肥胖組（P＜0.01）。Logistic回歸分析提示NF-κB、hsCRP、TG與肥胖呈正相關(guān)（P＜0.05），HbA1C與肥胖呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論NF-κB在新診斷2型糖尿病肥胖患者的表達(dá)水平升高，提示可能參與2型糖尿病肥胖患者炎癥的發(fā)生。

糖尿?。环逝?；核因子-κB；C反應(yīng)蛋白

肥胖癥是引發(fā)心腦血管事件的高危風(fēng)險(xiǎn)因素及導(dǎo)致人類致死致殘的主要原因之一，其主要病理生理特點(diǎn)是胰島素抵抗以及高胰島素血癥[1]。多數(shù)存在2型糖尿病患者都存在肥胖癥狀以及不同程度的相關(guān)胰島素抵抗情況，多認(rèn)為胰島素抵抗屬于2型糖尿病肥胖患者的重要病理及生理相關(guān)因素[2]。核因子-κB是機(jī)體炎癥有關(guān)的重要核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，NF-κB所介導(dǎo)的有關(guān)炎癥反應(yīng)和肥胖的出現(xiàn)及發(fā)展存在一定相關(guān)關(guān)系[3]。本文對(duì)新診斷的存在2型糖尿病且肥胖的患者PMNC的NF-κB活性變化，有望為防治以胰島素抵抗為基礎(chǔ)的肥胖及相關(guān)性2型糖尿病提供新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇自2015年7～12月南朗醫(yī)院內(nèi)科住院新診斷的2型糖尿病患者50例（根據(jù)1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)和分型標(biāo)準(zhǔn)），分級(jí)2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)建議[5]代謝綜合征中肥胖的標(biāo)準(zhǔn)定義為體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）≥25kg/m2，根據(jù)患者BMI分為肥胖組和非肥胖組，其中肥胖組28例，非肥胖組22例，年齡25～60歲。所有入選者沒有抗高血糖相關(guān)藥物和調(diào)脂相關(guān)藥物應(yīng)用；無維生素A、維生素E、維生素C、阿司匹林和抗氧化相關(guān)藥物應(yīng)用；無ACEI相關(guān)藥物、ARB相關(guān)藥物應(yīng)用；將存在肺、心、肝以及腎等相關(guān)疾病的患者排除；將存在急性感染患者、慢性感染患者排除；將存在惡性的腫瘤相關(guān)疾病的患者排除。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)于受試者的疾病史情況、吸煙史情況、家族史情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)于受試者的血壓數(shù)值、心率數(shù)值、身高數(shù)值、體重?cái)?shù)值、腰圍數(shù)值、臀圍數(shù)值進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其腰臀比（WHR）、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）進(jìn)行計(jì)算。檢測(cè)血尿常規(guī)、肝腎功能。所有對(duì)象均進(jìn)行OGTT（75g無水葡萄糖）。

表1 兩組一般情況的比較

1.2.2 所提取得到的PMNC Ficoll淋巴細(xì)胞分離液使用密度梯度離心法予以PMNC分離，使細(xì)胞數(shù)量保持3.2×106個(gè)。血液標(biāo)本應(yīng)用肝素予以抗凝處理，予以PBS緩沖液的稀釋處理，1∶1比例疊加于Ficoll相關(guān)淋巴細(xì)胞的分離液中，于溫度為20℃的情況下以2000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心共20min，可以看到液體由上至下分成4層，吸取中間的白膜層，將2倍體積的PBS加入，以1000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心共10min，共洗滌2次，將上清棄去后得到所需的細(xì)胞。

1.2.3 提取DNA 采用深圳創(chuàng)益生物科技有限公司人全血基因組DNA提取試劑盒取300μL裂解液至各樣EP管中，取50μL PMNC加至相應(yīng)編號(hào)的EP管中，振蕩搖勻，放置10min，12 000rpm離心3min，棄上清；加入0.4mL洗滌液A，振蕩混勻，離心3min，棄上清；加入0.6mL洗滌液B，振蕩混勻，離心3min，棄上清；加入0.6mL無水乙醇，振蕩混勻，離心3min，棄上清，收集沉淀；加入80μL TE液緩沖，振蕩懸浮沉淀，12 000rpm離心3min，-70℃保存沉淀。

1.2.4 應(yīng)用RT-PCR對(duì)NF-κB p65相關(guān)mRNA的含量予以測(cè)定。

1.2.4.1 引物的設(shè)計(jì)方法 應(yīng)用Primer5.0相關(guān)軟件對(duì)于本研究所使用的引物予以設(shè)計(jì)處理。NF-κB p65相關(guān)的引物序列是：本研究所使用的NF-κB p65上游的引物是：5’-AGTGAGCCCATGGAATTCCAGTACC-3’； 本研究所使用的NF-κB p65下游的引物是：5'-CCACTGCGGACGGGAGGGGTCTCGT -3’，本研究所使用的NF-κB p65擴(kuò)增產(chǎn)物是426bP。β-actin相關(guān)的引物序列是：本研究所使用的β-actin上游 的 引 物 是：5’ -TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3’；本研究所使用的β-actin下游的引物是：5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’，本研究所使用的β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物是302bP。

1.2.4.2 PCR DNA 模板 5μL，10×buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，上、下游引物各 0.25μL，酶混合物0.25μL，如果體積不夠使用滅菌的雙蒸水予以補(bǔ)加處理，保證相關(guān)體積數(shù)值，并使總的體積數(shù)值是25μL。在溫度為94℃的情況下予以預(yù)變性處理共2min。在94℃下進(jìn)行預(yù)變性共30s，在58.6℃下進(jìn)行退火共30s，在72℃下進(jìn)行延伸處理共60s，予以35個(gè)循環(huán)處理，在末次的循環(huán)后于溫度為72℃的情況下進(jìn)行延伸處理共10min。

1.2.4.3 PCR產(chǎn)物的相關(guān)半定量處理方法 PCR的相關(guān)產(chǎn)物一共有8μL，將其和和6×核酸的相關(guān)上樣緩沖液和SYBR GreenⅠ相關(guān)染料一共2μL予以混勻處理，并加入20g/L的瓊脂糖電泳，分析電泳條帶的相關(guān)感光密度數(shù)值，應(yīng)用NF-κB p65和β-actin之比表示NF-κB 相關(guān)mRNA具體表達(dá)量數(shù)值[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)使用SPSS19.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件包上完成。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，予以自然對(duì)數(shù)的轉(zhuǎn)換處理。多元回歸分析用Logistic法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析2型糖尿病肥胖患者的臨床特點(diǎn)

新診斷2型糖尿病肥胖組與非肥胖組間年齡、收縮壓、舒張壓、LDL-C、HDC-C、空腹血糖、OGTT 2h血糖、糖化血紅蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肥胖組腰圍（P＜ 0.01）、臀圍（P＜ 0.01）、總膽固醇（P＜0.01）、三酰甘油（P＜0.01）均高于非肥胖組。

2.2 hs-CRP水平

新診斷2型糖尿病肥胖組間血清炎癥因子hsCRP高于非肥胖組（P＜0.01）。見表2。

2.3 NF-κB p65 mRNA水平

新診斷2型糖尿病肥胖組間NF-κB p65mRNA水平顯著高于非肥胖（P＜0.01）。見圖1、表2。圖1顯示了NF-κB p65 mRNA印跡圖。

表2 兩組hs-CRP 、 NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平

圖1 兩組間NF-κB p65 mRNA的表達(dá)

2.4 肥胖影響因素Logistic回歸性分析

NF-κB與肥胖呈正相關(guān)（OR=5.771,95%CI1.461～22.797，P＜ 0.05），hsCRP與肥胖呈正相 關(guān)（OR=5.260,95%CI2.087～ 13.252，P＜0.05），TG與肥胖呈正相關(guān)（OR=6.210,95%CI1.591～24.243，P＜0.05），HbA1C與肥胖呈負(fù)相關(guān)（OR=0.518,95%CI0.326～ 0.822，P＜ 0.05）。

3 討論

因?yàn)槿藗兩罘绞降淖兓?，近年來?型糖尿病患者的發(fā)病率得到明顯提升。相關(guān)流行病學(xué)的研究表面，2型糖尿病患者大多數(shù)是比較肥胖以及存在胰島素抵抗的，提示肥胖有可能為2型糖尿病患者的重要危險(xiǎn)因素[5-7]，所以，肥胖在胰島素抵抗以及糖尿病中的相關(guān)作用逐漸得以人們關(guān)注。本文的研究結(jié)果提示新診斷2型糖尿病肥胖組總膽固醇、甘油三酯高于非肥胖組（P＜0.05），說明糖尿病伴存肥胖的患者體內(nèi)的體脂分布存在異常情況。而體脂分布的異常和肥胖有關(guān)的疾病的相關(guān)患病率和病死率均存在相關(guān)關(guān)系。存在肥胖的患者其體內(nèi)游離的脂肪酸水平提升，導(dǎo)致患者體內(nèi)有胰島素抵抗出現(xiàn)，發(fā)生高胰島素相關(guān)血癥以及糖耐量相關(guān)異常狀況，導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病肥胖組間血清炎癥因子hsCRP高于非肥胖組（P＜0.01），肥胖相關(guān)影響因素使用Logistics回歸性分析發(fā)現(xiàn)，hsCRP和肥胖存在正相關(guān)的關(guān)系（OR為5.260，95%CI2.087～13.252，P＜0.05），這就提示了肥胖患者處于炎癥狀態(tài)。肥胖患者的BMI提高，其CRP也提升，且CRP的提升和內(nèi)臟脂肪相關(guān)體積存在關(guān)系[8-10]。

NF-κB介導(dǎo)炎癥相關(guān)反應(yīng)和肥胖的出現(xiàn)具有一定的關(guān)系。本文研究中，2型糖尿病肥胖患者NF-κB p65mRNA表達(dá)高于非肥胖者（P＜0.01），肥胖影響因素Logistics回歸性分析提示NF-κB與肥胖呈正相關(guān)（OR=5.771，95%CI1.461～22.797，P＜0.05），提示新診斷2型糖尿病肥胖患者NF-κB表達(dá)升高，且NF-κB與肥胖相關(guān)。研究顯示控制飲食使肥胖患者體重的減少、PBMC中NF-κB有關(guān)的DNA結(jié)合的相關(guān)活性減少。筆者研究結(jié)果也提示了NF-κB對(duì)于肥胖患者的發(fā)病有可能參與其中[11-15]。

綜上所述，本研究結(jié)果提示糖尿病肥胖患者處于炎癥狀態(tài)，NF-κB與肥胖相關(guān)。NF-κB在肥胖引起胰島素抵抗相關(guān)發(fā)病機(jī)制之中存在介質(zhì)作用，能從不同相關(guān)信號(hào)通路中經(jīng)由不同機(jī)制對(duì)胰島素相關(guān)生理功能進(jìn)行干擾，可能參與了肥胖炎癥的發(fā)生，因此深入研究NF-κB對(duì)肥胖的作用有助于更好地了解肥胖的發(fā)病機(jī)制及為相關(guān)疾病的防治開辟新的途徑。

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Role of nuclear factor-κB in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus

SUN Yan RAO Huiping LI Xinrong LIU Jun
Department of Internal Medicine,Nanlang Hospital of Zhongshan City,Guangdong Province,Zhongshan 528451,China

ObjectiveTo investigate the role of nuclear factor-κB in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus.MethodsFifty patients with newly diagnosed type 2 diabetes were hospitalized from internal medicine（non-obese group 22,obese group 28）.The expression of NF-κB p65 mRNA was detected by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs),and β-actin was used as internal reference.ResultsThe serum levels of hsCRP in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus were higher than non-obese group (P＜0.01).The expression of NF-κB p65mRNA in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus is significantly higher than that of non-obese group (P＜ 0.01). Logistic regression analysis showed that NF-κB, hsCRP and TG were positively correlated with obesity (P＜0.05),and HbA1C was negatively correlated with obesity (P＜0.05).ConclusionThe expression of NF-κB in newly diagnosed type 2 diabetes mellitus High, suggesting that may be involved in type 2 diabetes obesity in patients with inflammation.

Diabetes;Obesity;Nuclear factor-κB;C-reactive protein

R587.1

A

2095-0616（2017）23-185-04

廣東省中山市衛(wèi)計(jì)局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（2015A020191）。

2017-09-26）