趙 琳，丁 敏，賈鯤鵬，王 璐，劉伯鋒，楊彥玲

（1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西延安716000）

腹腔注射2-DG對(duì)大鼠下丘腦orexin-A神經(jīng)元表達(dá)的影響*

趙 琳1，丁 敏1，賈鯤鵬2△，王 璐1，劉伯鋒1，楊彥玲1

（1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西延安716000）

目的：探討腹腔注射2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）對(duì)大鼠下丘腦增食欲素-A（orexin-A）神經(jīng)元的影響。方法：12只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（3只）、生理鹽水對(duì)照組（3只）及腹腔注射2-DG組（6只），2-DG劑量400 mg／kg，動(dòng)物存活2 h，抽取腦脊液后灌注固定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用免疫組織化學(xué)方法觀察下丘腦orexin-A的表達(dá)、以及orexin-A與Fos的雙標(biāo)情況，采用ELISA方法檢測orexin-A在腦脊液中的含量。結(jié)果：2-DG組的orexin-A陽性神經(jīng)元數(shù)量和雙標(biāo)細(xì)胞陽性率（雙標(biāo)細(xì)胞占o(jì)rexin-A陽性細(xì)胞的百分率）均高于對(duì)照組和生理鹽水組（p＜0.05）；并且2-DG組動(dòng)物腦脊液中的orexin-A含量也明顯高于其他兩組（p＜0.05）。結(jié)論：腹腔注射2-DG可激活大鼠下丘腦orexin-A神經(jīng)元，orexin-A可能參與其誘導(dǎo)的急性應(yīng)激反應(yīng)。

2-脫氧-D-葡萄糖；大鼠；下丘腦；增食欲素-A

2-deoxy-D-glucose； rat； hypothalamus； orexin-A

2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）是葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，可以抑制糖酵解途徑，模擬動(dòng)物饑餓時(shí)的低血糖狀態(tài)，是有效的“細(xì)胞饑餓”應(yīng)激刺激方式。下丘腦是重要的應(yīng)激反應(yīng)整合中樞，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)，并維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡。增食欲素-A（orexin-A）是一種具有神經(jīng)興奮作用的多肽，由下丘腦合成和分泌，參與調(diào)節(jié)能量代謝、攝食、睡眠-覺醒等生理活動(dòng)，也通過下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA）參與調(diào)節(jié)機(jī)體的各種應(yīng)激反應(yīng)［1，2］。但 2-DG能否有效激活下丘腦 orexin-A，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)尚不清楚。Fos是一種核內(nèi)磷酸化蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下其表達(dá)能被瞬時(shí)快速地誘導(dǎo)，常被作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志。本項(xiàng)目首先通過腹腔注射2-DG建立大鼠“細(xì)胞饑餓”應(yīng)激模型，通過免疫組織化學(xué)方法，觀察下丘腦orexin-A神經(jīng)元，以及orexin-A與Fos的雙標(biāo)情況，并且采用ELISA方法檢測腦脊液中orexin-A的含量。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠抗orexin-A和兔抗Fos抗體購自英國Abcam公司；生物素標(biāo)記的驢抗小鼠血清、羊抗兔血清購自美國Chemicon公司；AB復(fù)合物購自美國Vector公司；大鼠orexin-A ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

12只健康成年雄性 SD大鼠，體重250～300 g，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組3只，不做任何處理；生理鹽水對(duì)照組3只，腹腔注射與2-DG組等劑量生理鹽水；腹腔注射2-DG組6只，腹腔注射2-DG 400 mg／kg，大鼠自由進(jìn)食飲水。

1.3 收集腦脊液

各組大鼠處理 2 h后，腹腔注射2%異戊巴比妥鈉40 mg／kg麻醉，把大鼠固定在立體定位儀上，暴露小腦與延髓之間的小腦延髓池，用微量注射器依次穿過硬腦膜和蛛網(wǎng)膜至蛛網(wǎng)膜下腔，抽取腦脊液50～80μl，收集好的腦脊液應(yīng)避免污染并置于冰上，保存于-80℃冰箱待用。

1.4 灌注和取材

抽取腦脊液后，補(bǔ)加麻藥至80 mg／kg深麻大鼠，開胸，經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈，100 ml生理鹽水快速?zèng)_血，再用4%多聚甲醛400 ml固定，持續(xù)灌注約1 h。取出腦組織，置入配好的30%蔗糖溶液，4℃冰箱過夜。待腦組織在蔗糖溶液中下沉后，切取下丘腦部分，包埋行冰凍切片。

1.5 下丘腦免疫組化雙標(biāo)染色

下丘腦切片經(jīng) 0.01 mol／L PBS漂洗 3次，0.3%H2O2處理30 min，漂洗后用正常山羊血清室溫孵育1 h，依次加入：兔抗Fos IgG；生物素標(biāo)記的羊抗兔血清；AB復(fù)合物。孵育完后，呈色反應(yīng)用DAB加硫酸鎳銨；切片充分漂洗后，再經(jīng)0.3%H2O2、正常山羊血清封閉液處理，進(jìn)行orexin-A雙標(biāo)染色，加入小鼠抗orexin-A IgG；生物素標(biāo)記的驢抗小鼠血清；AB復(fù)合物。DAB呈色反應(yīng)，不加硫酸鎳銨，顯微鏡下掌握顯色程度，漂洗后裱片。乙醇梯度脫水、二甲苯透明、封片。最后顯微鏡觀察，并計(jì)數(shù)和拍照。orexin-A陽性細(xì)胞胞漿呈棕褐色，F(xiàn)os陽性神經(jīng)元的細(xì)胞核呈棕黑色或棕褐色。

1.6 ELISA檢測腦脊液中orexin-A含量

小腦延髓池收集的腦脊液，用包被液進(jìn)行稀釋后，每孔吸取100μl加入酶標(biāo)板中，4℃冰箱過夜。洗滌板子后，每孔加入100μl正常山羊血清孵育30 min；接著加入小鼠抗orexin-A抗體，37℃孵育1 h；HRP標(biāo)記的驢抗小鼠 IgG 100μl，37℃孵育 1 h；顯色液用 100μl OPD+H2O2，37℃孵育 10 min，最后每孔50μl終止液結(jié)束反應(yīng)。每次試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，以空白對(duì)照孔調(diào)零后，用分光光度儀測定各孔光度值。數(shù)據(jù)模式為測試孔與陰性對(duì)照孔光度值之比（P／N）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用ImagePro Plus圖像分析專業(yè)軟件，對(duì)各只動(dòng)物orexin-A及雙標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，行 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 下丘腦免疫組化雙標(biāo)染色檢測orexin-A陽性神經(jīng)元

下丘腦的免疫組化雙標(biāo)染色檢測orexin-A陽性神經(jīng)元的結(jié)果顯示，三組中orexin-A主要散在分布于下丘腦的穹窿周區(qū)、外側(cè)區(qū)和背側(cè)區(qū)，免疫陽性細(xì)胞大多數(shù)呈卵圓形、梭形和三角形。與正常對(duì)照組和生理鹽水組比較，2-DG組orexin-A陽性神經(jīng)元的計(jì)數(shù)明顯增高（p＜0.05）。三組中orexin-A陽性細(xì)胞胞漿呈淺棕色，部分orexin-A神經(jīng)元不同程度呈現(xiàn)Fos陽性細(xì)胞核，核黑而濃染。2-DG組雙標(biāo)陽性率最高，與對(duì)照組和生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，圖1，表1）。

Fig.1 Immunohistochemical staining of orexin-A and Fos in perifornical hypothalamus（A～C，Bar＝200μm；A’～C’，Bar＝20μm）3V：The third ventricle；f：Fornix

Tab.1 Number of orexin-A positive neurons and orexin-A／Fos double-labelled neurons and their rates（ˉx±s）

2.2 ELISA檢測結(jié)果

正常對(duì)照組腦脊液中 orexin-A含量（1.00±0.07）和生理鹽水組腦脊液中 orexin-A含量（1.01±0.08）相當(dāng)，相對(duì)值都在1左右，2-DG組腦脊液中的 orexin-A含量為（1.25±0.10），較正常對(duì)照組和生理鹽水組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，圖 2）。

Fig.2 The relative value of orexin-A in cerebrospinal fluid（CSF）after injection of 2-DG by ELISA assay*p＜0.05 vs control group；＃p＜0.05 vs saline group

3 討論

2-DG是一種葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，它的主要作用是抑制糖酵解途徑、糖基化和細(xì)胞增殖［3］。側(cè)腦室或系統(tǒng)給予2-DG后，可以和葡萄糖競爭性結(jié)合各種催化酶，從而阻斷細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖代謝，通過葡萄糖酵解產(chǎn)生的ATP減少，細(xì)胞能量被“剝奪”，使細(xì)胞處于類似胰島素誘發(fā)的低血糖或血糖過少狀態(tài)［4］，是“細(xì)胞饑餓”的有效應(yīng)激刺激方式。下丘腦是重要的皮質(zhì)下中樞，分泌的神經(jīng)肽可參與機(jī)體能量平衡的調(diào)節(jié)［5］。orexin-A是由下丘腦外側(cè)區(qū)分泌，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，及與應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)等。orexin-A屬于葡萄糖敏感型神經(jīng)元，胰島素誘導(dǎo)的低血糖可以刺激其表達(dá)［4］。中樞注射orexin-A可增加大鼠如挖掘、洗臉等應(yīng)激樣行為反應(yīng)，產(chǎn)生與應(yīng)激相關(guān)的行為驅(qū)動(dòng)［6］。

Fos是一種代表神經(jīng)元活化狀態(tài)的即刻早期應(yīng)答基因，是研究中樞神經(jīng)功能活動(dòng)狀態(tài)較為理想的的標(biāo)記物，可作為神經(jīng)元接受刺激興奮性啟動(dòng)的標(biāo)志。成熟的Fos常與同家族的Jun組成異源二聚體，從而發(fā)揮核蛋白轉(zhuǎn)錄因子的作用［7］。Fos合成后即刻轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，一般在接受刺激后20～30 min即可檢出，1～1.5 h就可以達(dá)到高峰，持續(xù)約2～5 h。大鼠受到應(yīng)激刺激后數(shù)分鐘會(huì)做出反應(yīng)，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位出現(xiàn)數(shù)量不等的Fos表達(dá)［8］。有研究表明，腹腔注射2-DG可以誘發(fā)約50%的下丘腦外側(cè)區(qū)神經(jīng)元表達(dá)Fos［6］。我們采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)2-DG引發(fā)的orexin-A和Fos雙標(biāo)細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，在下丘腦外側(cè)區(qū)和穹窿周區(qū)表達(dá)較多，2-DG組雙標(biāo)陽性率高于對(duì)照組和生理鹽水組。腦脊液中的orexin-A可以由orexin神經(jīng)元及其突起伸入室腔的室管膜上皮層產(chǎn)生，采用ELISA方法檢測腦脊液中orexin-A的含量發(fā)現(xiàn)，腹腔注射2-DG后腦脊液中orexin-A的含量增高，說明腹腔注射2-DG誘發(fā)的饑餓應(yīng)激在一定程度上促進(jìn)orexin-A神經(jīng)元表達(dá)Fos，下丘腦是orexin-A參與應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵腦區(qū)。

Orexin-A的胞體雖然比較局限，數(shù)量較少，但其受體的分布、纖維的分布幾乎遍及整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與中腦多巴胺系統(tǒng)、腦干孤束核等許多腦區(qū)都存在往返投射聯(lián)系。orexin-A參與能量代謝及機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的綜合調(diào)控，可能是通過這種腦區(qū)之間較為廣泛的協(xié)同關(guān)系發(fā)揮作用。應(yīng)激包括心理和行為上的反應(yīng)，以及免疫系統(tǒng)、神經(jīng)、內(nèi)分泌一系列適應(yīng)性改變。HPA軸的激活是機(jī)體對(duì)于應(yīng)激刺激的的適應(yīng)性反應(yīng)，是應(yīng)激反應(yīng)的最顯著特征［9］。下丘腦是重要的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中樞，腹腔注射2-DG也可能通過HPA軸的激活引起機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)及自主神經(jīng)活動(dòng)的改變，通過下丘腦對(duì)體內(nèi)外應(yīng)激刺激進(jìn)行整合，維持機(jī)體的適應(yīng)性反應(yīng)。腹腔注射2-DG可以激活orexin-A神經(jīng)元表達(dá)Fos，但其激活后下游誘發(fā)的靶基因及HPA軸活動(dòng)的分子信號(hào)機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

［1］ Kalra SP，Dube MG，Pu S，et al.Interacting appetite-regulating pathways in the hypothalamic regulation of body weight［J］.Endocr Rev，1999，20（1）：68-100.

［2］ Goodson JL，Thompson RR.Nonapeptide mechanisms of social cognition，behavior and species-specific social systems［J］.Curr Opin Neurobiol，2010，20（6）：784-794.

［3］ Wu X，Zhao H，Min L，et al.Effects of 2-Deoxyglucose on ischemic brain injuries in rats［J］.Int JNeurosci，2014，124（9）：666-672.

［4］ 趙 琳，賈鯤鵬，王 璐，等.胰島素誘導(dǎo)的低血糖大鼠下丘腦增食欲素-A的表達(dá)［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2014，30（3）：212-213.

［5］ 焦廣發(fā)，高 峰，王海英，等.長期運(yùn)動(dòng)對(duì)幼齡大鼠下丘腦腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2014，30（4）：317-319.

［6］ Briski KP，Sylvester PW.Hypothalamic orexin-A-immunopositive neurons express Fos in response to central glucopenia［J］.Neuroreport，2001，12（3）：531-534.

［7］ Zenz R，Eferl R，Scheinecker C，et al.Activator protein 1（Fos／Jun）functions in inflammatory bone and skin disease［J］.Arthritis Res Ther，2008，10（1）：201-210.

［8］ 涂冬萍，馬小軍，莫長明，等.FOS蛋白的研究進(jìn)展及生物信息學(xué)分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（7）：1537-1542.

［9］ Chang H，Saito T，Ohiwa N，et al.Inhibitory effects of an orexin-2 receptor antagonist on orexin-A and stress-induced ACTH responses in conscious rats［J］.Neurosci Res，2007，57（3）：462-466.

R322.81

A

1000-6834（2017）06-500-03

10.12047／j.cjap.5595.2017.119

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81641048）；延安大學(xué)自然科學(xué)引導(dǎo)項(xiàng)目（YD2015-16）；2015年國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510719279）

2017-04-17

2017-10-24

△【通訊作者】Tel：13809113052；E-mail：jkpzhaolin＠163.com