許 拓，凌宏艷+，龍 佳，何劍琴，楊絲絲，朱責(zé)梅，顏燦群Δ，奉水東

枸杞多糖對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用及機(jī)制研究*

許 拓1，凌宏艷1+，龍 佳2，何劍琴1，楊絲絲1，朱責(zé)梅1，顏燦群2Δ，奉水東3Δ

（1.南華大學(xué)生理學(xué)教研室，2.附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，3.社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室，湖南衡陽421001）

目的：觀察不同濃度的枸杞多糖（LBP）對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響并探討其機(jī)制。方法：采用高糖高胰島素處理HepG2細(xì)胞24 h建立胰島素抵抗細(xì)胞模型后，用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)活力大于95%的HepG2細(xì)胞，以104／孔密度接種于 96孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后以 30μg／ml、100μg／ml、300μg／ml的 LBP培養(yǎng) 48 h，200μl／well，各組均設(shè) 4個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)不同濃度的LBP對(duì)HepG2細(xì)胞活性及胰島素抵抗的影響；細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性；各組細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白（IRS-2、PI3-K、Akt、GLUT2）的表達(dá)。結(jié)果：MTT顯示：與正常對(duì)照組相比，IR模型組MDA含量顯著升高，SOD活力明顯降低，同時(shí)IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白表達(dá)水平明顯下降；與IR模型組相比，中、高濃度LBP組MDA的含量明顯降低，SOD的活力顯著升高，且IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白表達(dá)水平明顯升高；在相同的時(shí)間內(nèi)，隨著LBP濃度的增加，OD值逐漸降低；在同一濃度干預(yù)下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值也逐漸降低；葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)表明中、高濃度的LBP可顯著提高胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量，而低濃度LBP對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量無明顯影響。結(jié)論：中、高濃度枸杞多糖能改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及提高胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

枸杞多糖；HepG2細(xì)胞；胰島素抵抗；氧化應(yīng)激；胰島素信號(hào)通路

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的重要發(fā)病機(jī)制之一，伴隨T2DM發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程［1-2］，另外IR是肥胖、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)［3］。因此，尋找改善IR藥物日益被人們所重視。

枸杞多糖（lyceum barbarum polysaccharide，LBP）是從枸杞中提取出來的具有多種生物活性的大分子物質(zhì)，是枸杞發(fā)揮各種作用的主要成分之一［4］。研究顯示：LBP能提高鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平［5-7］；LBP可以改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗；LBP也能降低2型糖尿病患者血糖、升高胰島素水平［8］。這些研究提示：LBP在降血糖、改善胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激等方面均有較好的效果，但目前尚無對(duì)其分子機(jī)制的研究。為此，本研究觀察不同濃度的LBP對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HepG2細(xì)胞由湖南省南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床研究所饋贈(zèng)，枸杞多糖購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，MTT粉購(gòu)于美國(guó)Sigma。SOD和MDA測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物研究所；兔抗GLUT2多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)stant，兔抗PI3-K多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)CST，兔抗Akt多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)proteintech，兔抗IRS2多克隆抗體購(gòu)于Abcam。

1.2 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，1 000 r／min離心5 min收集細(xì)胞，加新鮮培養(yǎng)液吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為106cells／ml，均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為含高糖高胰島素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，通過葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)判斷胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立。

1.3 MTT比色法

用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)活力大于95%的HepG2細(xì)胞，以104／孔密度接種于96孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后加入0、100、300、500、1 000、3 000、5 000μg／ml 7個(gè)濃度的LBP，每孔200μl，各組均設(shè) 4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng) 24、48、72 h后，每孔加入 5 mg／ml MTT 20μl，37℃，5%CO2繼續(xù)孵育4 h，將每孔里面的上清小心吸棄，然后加入二甲基亞砜，每孔加入150μl，混勻后用 Bio-Tek酶標(biāo)儀分析在490 nm處的吸光度（OD）值，取均值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分5組：正常對(duì)照組（C）、IR模型組、300μg／ml高濃度 LBP組（H-LBP）、100μg／ml中濃度LBP組（M-LBP）、30μg／ml低濃度 LBP組（L-LBP）。將96孔板中的HepG2細(xì)胞棄去舊培養(yǎng)基，換上含高糖高胰島素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。藥物干預(yù)組分別給予200μl／well相應(yīng)濃度的藥物處理48 h。上述各組再分別用含和不含胰島素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法（GOD-POD法）測(cè)定每孔細(xì)胞的培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，通過與未接種細(xì)胞的空白孔的葡萄糖含量均值相減，計(jì)算每孔細(xì)胞葡萄糖的消耗量。

1.5 MDA含量、SOD活力的測(cè)定

按照試劑盒說明書順序加入反應(yīng)液，比色法測(cè)定MDA含量和SOD活力。

1.6 Western blot檢測(cè)各組 IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白的表達(dá)

提取各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行蛋白定量后，取蛋白樣品30μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入抗 IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2抗體孵育，洗滌后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，充分洗滌后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光后掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，多組間比較用ANOVA方差分析。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

在相同的時(shí)間內(nèi)，隨著LBP濃度的增加，OD值逐漸降低；在同一干預(yù)濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值也逐漸降低，呈時(shí)間-量效關(guān)系。但同一濃度在24 h和48 h的OD值間沒有明顯差異，而72 h與24 h、48 h相比，OD值明顯降低（p＜0.05）。從曲線可以看出，當(dāng)濃度為0～300μg／ml的 LBP作用HepG2細(xì)胞48 h，對(duì)細(xì)胞活力無顯著性影響，當(dāng)LBP濃度超過300μg／ml，細(xì)胞 OD值明顯下降（p＜0.05，圖 1）。因此，為了排除LBP對(duì)細(xì)胞活力的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇 30μg／ml、100μg／ml、300μg／ml枸杞多糖處理細(xì)胞48 h。

2.2 枸杞多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

HepG2細(xì)胞用高糖高胰島素培養(yǎng)24 h后，其葡萄糖消耗量較正常組降低45.9%，表明高糖高胰島素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗。與IR模型組相比，無胰島素刺激時(shí)，H-LBP、M-LBP、L-LBP組葡萄糖消耗量皆顯著升高；有胰島素抵抗刺激時(shí)，HLBP、M-LBP組葡萄糖消耗顯著升高，L-LBP組葡萄糖消耗量無顯著性差異（圖2）。

Fig.1 Effects of different concentration and time of LBP on cells proliferation compared with 72 h group（ˉx±s，n＝3）*p＜0.05 vs 24 h group；＃p＜0.05 vs 48 h group

Fig.2 Effects of different concentration LBPon glucose consumption of insulin resistant HepG2 cells（ˉx±s，n＝6）C：Control：IR：Insulin resistance；LBP：Lyceum barbarum polysaccharide*p＜0.05 vs contorl；＃p＜0.05 vs IR group；Δp＜0.05 vs non-insulin group

2.3 枸杞多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞MDA含量和SOD活力的影響

與正常對(duì)照組相比，IR模型組細(xì)胞MDA含量升高61%，SOD活力降低29.9%；與 IR模型組相比，H-LBP、M-LBP組MDA含量顯著降低，而SOD活力顯著升高（p＜0.05，表 1）。

Tab.1 Effects of different concentration of LBPon the content of MDA and the activity of SOD of insulin resistant HepG2 cells（ˉx±s，n＝6）

2.4 枸杞多糖對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞 IRS-2、Akt、PI-3K、和 GLUT2蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，IR模型組細(xì)胞IRS-2、Akt、PI-3K、和GLUT2蛋白表達(dá)水平顯著降低（p＜0.05）；與 IR模型組相比，H-LBP組、M-LBP組細(xì)胞 IRS-2、Akt、PI-3K、和 GLUT2蛋白表達(dá)水平顯著升高（p＜0.05，圖 3），L-LBP組輕微升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.3 Effects of LBP on protein expression of IRS-2，Akt，PI-3K，and GLUT2 in insulin resistant HepG2 cells（ˉx±s，n＝5）IR：Insulin resistance；LBP：Lyceumbarbarum polysaccharide*p＜0.05 vs contorl group；＃p＜0.05 vs IR group

3 討論

隨著人們的生活方式發(fā)生改變，全球糖尿病尤其是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)病率逐漸上升，目前全球約3.5億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2050年將會(huì)有5.52億［9］。胰島素抵抗是 T2DM的始發(fā)因素，是T2DM的重要發(fā)病基礎(chǔ)，逐漸成為糖尿病醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)［10］。早期干預(yù)IR的發(fā)生或許可以有效防治2型糖尿病，成為2型糖尿病治療的新方向。IR的形成主要是由于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，或者通路中關(guān)鍵蛋白作用減弱而使胰島素不能發(fā)揮其正常的生理作用［11，12］，是胰島素抵抗發(fā)生的重要機(jī)制，通路中無論哪一個(gè)信號(hào)分子結(jié)構(gòu)或功能的異常均可導(dǎo)致胰島素抵抗。隨著對(duì)IR的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激水平的升高與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)［13，14］。枸杞多糖在抗氧化應(yīng)激、降血糖、改善胰島素抵抗方面均有較好的作用，但其具體機(jī)制尚無報(bào)道。HepG2細(xì)胞來源于肝細(xì)胞，是一種與肝細(xì)胞極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株，保留了肝細(xì)胞許多生物學(xué)特性［15］，故本實(shí)驗(yàn)通過采用高糖高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，采用MTT檢測(cè)不同濃度LBP處理HepG2細(xì)胞24 h、48 h、72 h。48 h與24 h處理組在300μg／ml LBP作用下細(xì)胞活力無顯著差異，故選擇48 h。觀察不同濃度LBP處理對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞SOD活力、MDA含量及IRS-PI3K-Akt胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：在胰島素刺激時(shí)，各組的葡萄糖消耗量較無胰島素時(shí)顯著升高，說明LBP可以促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖消耗。H-LBP、M-LBP組MDA含量顯著降低，SOD活力顯著升高，表明LBP通過升高胰島素抵抗HepG2細(xì)胞SOD的活力，降低MDA的含量提高細(xì)胞的抗氧化、清除氧自由基的能力而改善細(xì)胞胰島素抵抗。H-LBP、M-LBP的 IRS-PI3KAkt胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明LBP能通過增加胰島素信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白水平從而改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗。

綜上所述：枸杞多糖能改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及提高胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中 IRS2、PI3K、Akt、GLUT2的蛋白表達(dá)有關(guān)。

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Ameliorative effects and the mechanism of lyceum barbarum polysaccharide on insulin resistance of Hep G2 cell

XU Tuo1，LING Hong-yan1+，LONGJia2，HE Jian-qin1，YANG Si-si1，ZHU Ze-mei1，YAN Can-qun2Δ，F(xiàn)ENG Shui-dong3Δ
（1.Department of Physiology，2.The Second Hospital of University of South China，3.Department of Social Medicine and Health Service Management，University of South China，Hengyang 421001，China）

Objective：To observe the effects of lyceum barbarum polysaccharide（LBP）on insulin resistance of HepG2 cells and investigate its possible mechanism.Methods：IR-HepG2 cell model was induced with high glucose and high insulin in combination for 24 hours，with 104／vaccination in the96-well plates，hole density after adherent cells（30μg／ml、100μg／ml、300μg／ml）LBPcultivate48 h，200μl／hole，each all had four holes.The effects of LBPat different concentrations on HepG2 cell activity and insulin resistance were tested.Intracellular malondialdehyde（MDA）content and superoxide dismutase（SOD）activity were detected.The expressions of related proteins in insulin signal transduction pathways such as insulin receptor substrate-2（IRS-2），phosphatidylinositol-3-kinase（PI3-K），protein kinase B（Akt）and glucose transport-2（GLUT2）were determined.Results：Compared with normal control group，the content of MDA was increased significantly and the activity of SOD and the expression levels of IRS-2，PI-3K，Akt and GLUT2 were decreased significantly in the IRmodel group.Compared with IR model group，medium and high concentrations of LBPdecreased the content of MDA and increased the activity of SOD and the expression levels of IRS-2，PI-3K，Akt and GLUT2 in insulin-resistant HepG2 cells.MTT showed that at the same time，the OD value gradually decreased with the increase of LBP’s concentration；under the same concentration of LBP，the OD value also gradually decreased with the extension of time，which indicated that LBPinhibited the proliferation of HepG2 cells with time and concentration-dependent manner.Glucose consumption experiment indicated that medium and high concentration of LBP could increase the glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells significantly，but low concentration of LBPhad no significant impacted on glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells.Conclusion：Medium and high concentration of LBPcan improve insulin resistance of HepG2 cell，its mechanisns may be associated with decreasing the level of oxidative stress and increasing the protein expressions of insulin signaling pathway.

lyceum barbarum polysaccharide； HepG2 cell； insulin resistance； oxidative stress； insulin signaling pathway

R587.2；R742

A

1000-6834（2017）06-568-04

10.12047／j.cjap.5524.2017.134

教育部留學(xué)歸國(guó)基金（教外司留［2014］1685號(hào)）；湖南教育廳（16C1411）；衡陽市科技局（2016KJ64）

2016-11-21

2017-06-29

△【通訊作者】Tel：86-0734-8281621；E-mail：shuidong f＠hotmail.com；+：并列第一作者