蔣 彬，王國(guó)卿，李紅霞，蔣文平，陳 濤，姜 巖

致心律失常性右室心肌病患者的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系的建立*

蔣 彬，王國(guó)卿，李紅霞，蔣文平，陳 濤△，姜 巖△

（蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州215123）

目的：建立致心律失常性右室心肌病（ARVC）患者特異性的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs），為研究ARVC發(fā)病機(jī)制提供研究模型。方法：培養(yǎng)來(lái)源于ARVC患者皮膚成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行突變位點(diǎn)測(cè)序鑒定。通過(guò)仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入外源性多能轉(zhuǎn)錄因子，將ARVC患者皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs，結(jié)合免疫熒光法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以及體內(nèi)外三胚層形成實(shí)驗(yàn)對(duì)iPS細(xì)胞全能型進(jìn)行鑒定。通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)iPS細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞。結(jié)果：ARVC患者來(lái)源的iPSCs顯示堿性磷酸酶陽(yáng)性，多能性相關(guān)基因高表達(dá)，胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4，SSEA4，TRA-1-81陽(yáng)性。體外懸浮培養(yǎng)形成的擬胚體以及體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)均顯示ARVC-iPSCs具有向3個(gè)胚層分化能力。經(jīng)過(guò)體外心肌定向，ARVC-iPSC可誘導(dǎo)產(chǎn)生自主節(jié)律性搏動(dòng)細(xì)胞團(tuán)，免疫熒光顯示cTnT陽(yáng)性。結(jié)論：本研究使用仙臺(tái)病毒，建立了無(wú)插入型ARVC患者特異的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有多能分化特性，并可定向分化為心肌細(xì)胞，為研究ARVC的致病因素和藥物篩選提供寶貴的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

致心律失常性右室心肌病；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；心肌定向分化

致心律失常性右心室心肌?。╝rrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC），以反復(fù)發(fā)作的右心室起源的室性心律失常、心力衰竭以及心源性猝死為主要表現(xiàn)，世界衛(wèi)生組織（WHO）于1995年將其歸類于原發(fā)性心肌病范疇［1］。本病發(fā)病率受診斷不確切的影響，估計(jì)為1／2500～5000。ARVC對(duì)于青壯年的潛在危害受到越來(lái)越多關(guān)注，發(fā)病一旦確認(rèn)往往是中晚期，部分病人甚至以猝死為本病首發(fā)癥狀。因此，早期診斷和治療干預(yù)具有非常重要的臨床意義。迄今，臨床治療上主要采用植入自動(dòng)復(fù)律除顫器，消融聯(lián)合抗心律失常藥物（如胺碘酮聯(lián)合β受體阻斷劑等）進(jìn)行治療［2］。值得注意是，ARVC區(qū)別于其他心律失常疾病的主要特征是心肌的結(jié)構(gòu)性病變，即明顯的脂肪化浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞凋亡、顯著的代謝途徑變化［3］，因此，針對(duì)該疾病的特殊性，輔以電生理診斷治療，從心肌發(fā)育以及代謝調(diào)控方面研究并揭示其分子致病機(jī)理，將對(duì)ARVC早期預(yù)防以及新的藥物靶向開(kāi)發(fā)提供重要的線索和途徑。

目前，ARVC的模型建立主要局限于橋粒蛋白相關(guān)的基因敲除小鼠，由于人和小鼠種屬差異，心肌發(fā)育時(shí)程和調(diào)控機(jī)制不同，心肌電生理以及藥物干預(yù)敏感性等諸多方面的差異，迫切需要建立與臨床貼近的人ARVC研究模型［4，5］。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是誘導(dǎo)而來(lái)的具有類似胚胎干細(xì)胞特性的一類細(xì)胞，最近發(fā)展起來(lái)的患者特異性的iPSC細(xì)胞鑒于來(lái)源廣泛，無(wú)倫理限制等特點(diǎn)，正越來(lái)越多的應(yīng)用在臨床和科研中［6，7］。本研究旨在將ARVC患者特異性的成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)重編程得到非插入性的iPSC，并進(jìn)行心肌的定向分化，以期用于建立ARVC疾病研究的理想模型。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

經(jīng)蘇州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與ARVC患者進(jìn)行充分溝通，簽署知情同意書后，采用皮膚活檢的方法取材約4 mm2大小的皮膚組織塊，進(jìn)行常規(guī)原代組織塊培養(yǎng)以獲取成纖維細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)所需培養(yǎng)液無(wú)特殊說(shuō)明均來(lái)自Gibco，上海，中國(guó)。

1.2 ARVC患者的確診以及皮膚成纖維細(xì)胞系的建立

原代ARVC患者成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基：內(nèi)含 10%FBS，0.1 mmol／L雙抗（青霉素-鏈霉素溶液），1%MEM NEAA，1%GlutaMAX-1。

1.3 建立ARVC-iPSCs細(xì)胞系

根據(jù)本課題組的前期工作基礎(chǔ)，通過(guò)仙臺(tái)病毒將人OCT4，SOX2，NANOG和c-MYC四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染到患者成纖維細(xì)胞中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，調(diào)整密度，將這些細(xì)胞接種在飼養(yǎng)層細(xì)胞上，約3周后，iPS克隆樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，利用機(jī)械分離法挑出進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建系、鑒定以及冷凍保存。進(jìn)行ARVC-iPSCs擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)體系如下：KO-DMEM內(nèi)含20%血清替代物（knockout serum replacement），0.1 mmol／L雙抗，2 mmol／L L-glutamine，1%（v／v）非必需氨基酸，10 ng／ml b-FGF。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)

常規(guī) TrizolReagent（Invitrogen）提取總 RNA，定量1μg反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，反應(yīng)參數(shù)為 25℃ 5 min，40℃15 min，85℃5 min，后置于-80℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，應(yīng)用引物進(jìn)行擴(kuò)增（引物序列見(jiàn)表1）。PCR反應(yīng)參數(shù)，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共 40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系20μl。于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（美國(guó)ABI）。分別取樣3次重復(fù) n＝3）。

Tab.1Primer sequences

1.5 體內(nèi)外三胚層分化實(shí)驗(yàn)

擬胚體的形成1 mg／ml IV膠原酶在37℃消化5 min，顯微鏡下觀察吹打成小細(xì)胞團(tuán)，而后使用超低粘附培養(yǎng)板懸浮7 d，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液。此后，將擬胚體貼壁培養(yǎng)于0.1%明膠包被的培養(yǎng)板，貼壁培養(yǎng)2周后進(jìn)行免疫組化染色分析。用30%Matrigel重懸浮消化后的ARVC-iPSCs，對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下注射，8周后處死小鼠，分離畸胎瘤進(jìn)行固定切片和染色觀察。

1.6 心肌定向分化

采用擬胚體懸浮培養(yǎng)的方法進(jìn)行心肌特異性誘導(dǎo)，培養(yǎng)液及其誘導(dǎo)因子添加時(shí)間以及濃度如前所述［8］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，運(yùn)用Spss軟件兩組間比較方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行 t檢驗(yàn)，多組間比較方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ARVC患者來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞系原代培養(yǎng)

尚XX，男，53歲，致心律失常性右室心肌病確診患者。以“反復(fù)發(fā)作性心悸兩年”就診于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科。家族中無(wú)類似發(fā)作史。心悸發(fā)作心電圖顯示為室性心動(dòng)過(guò)速（ventricular tachycardia，VT），發(fā)作呈無(wú)休止?fàn)睿栊须姀?fù)律中止。心臟超聲提示右室增大。心臟核磁共振提示符合右室心肌病。行射頻消融術(shù)治療，消融靶點(diǎn)位于右室流入道。術(shù)后隨訪兩年無(wú)VT發(fā)作。患者右下肢皮膚，進(jìn)行體外培養(yǎng)，約1周后，得到ARVC病人來(lái)源的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞增殖正常，狀態(tài)良好（圖1A）。分離DNA進(jìn)行測(cè)序分析（圖1B），結(jié)果顯示編碼橋粒蛋白的PKP2基因第10號(hào)外顯子雜和突變，這是該基因又一新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。

Fig.1 Derivation of the dermal fibroblast from patient with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy（ARVC）A：Dermal fibroblast was isolated from a small skin biopsy from ARVC patient；B：Sequencing of mutated allele of the plakophilin-2 gene in ARVC-fibroblasts

2.2 建立無(wú)插入型ARVC患者特異性iPS細(xì)胞系

選取成功建系的ARVC-iPSCs進(jìn)行檢測(cè)，堿性磷酸酶呈強(qiáng)陽(yáng)性，顯示紫紅色，而飼養(yǎng)層細(xì)胞不著色（圖2A），RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示，ARVC-iPSCs與胚胎干細(xì)胞 H9的多能性標(biāo)志性基因 c-MYC、KLF4、OCT4、SOX2表達(dá)非常相似（圖2B）。對(duì)該克隆進(jìn)行免疫熒光染色觀察，發(fā)現(xiàn)，SSEA4、TRA1-81、OCT4等人胚胎干細(xì)胞標(biāo)志性抗原表達(dá)明顯（圖2C）。

Fig.2 Derivation and characterization of the ARVC-hiPSCs A：Positive staining of the ARVC-hiPSCs colonies for alkaline phosphatase；B：Real-time quantitative PCR evaluating the levels of the pluripotency genes in control H9，fibroblasts，and ARVC-hiPSCs（n＝3）；C：Immunostaining of pluripotent markers SSEA4，TRA1-81，OCT4 with DAPI staining of nuclei

2.3 鑒定ARVC-iPS細(xì)胞系的全能性

ARVC-iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，第二天可見(jiàn)擬胚體形成（圖3A）。懸浮一周后，出現(xiàn)類囊胚擬胚體結(jié)構(gòu)。擬胚體貼壁爬出細(xì)胞中表達(dá)內(nèi)胚層標(biāo)志物甲胎蛋白，中胚層標(biāo)志物肌間結(jié)蛋白和外胚層標(biāo)志物β-微管蛋白。說(shuō)明ARVC-iPS在體外具有多向分化潛能，能夠向三個(gè)胚層進(jìn)行分化（圖3B）。裸鼠注射ARVC-iPSCs 4周左右，在注射部位可見(jiàn)畸胎瘤形成，8周后摘除腫瘤進(jìn)行組織切片染色觀察。熒光倒置顯微鏡記錄免疫熒光（Nikon），鏡下可看到內(nèi)胚層上皮細(xì)胞，中胚層軟骨組織，以及外胚層神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)（圖3C）。因此，ARVC-iPS在體內(nèi)具有形成三胚層分化能力。

Fig.3 Differentiation toward 3 germ layers A：Phase contrast of in vitro differentiation；B：Immunostaining of in vitro differentiating embryoid bodies for AFP（endoderm），DESMIN（mesoderm）and Tuj-1（ectoderm）；C：Teratoma formation in SCIDmice after injection of undifferentiated ARVC-hiPSCs showing the presence of cartilage（mesoderm），epithelium（endoderm）and melanocytes（ectoderm）

2.4 定向誘導(dǎo)ARVC-iPS細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞

將ARVC-iPS細(xì)胞進(jìn)行心肌特異性分化，在分化的第0天，第7天，第14天和第21天對(duì)不同分化狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)心肌分化相關(guān)基因的表達(dá)。隨著擬胚體的分化進(jìn)行，多能性基因SOX2和NANOG表達(dá)下調(diào)，中胚層標(biāo)志性基因T在隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)量先增高后降低。早期心臟發(fā)育胰島因子1（ISL-1）呈現(xiàn)逐漸上調(diào)表達(dá)規(guī)律，誘導(dǎo)后2周達(dá)到最高值并維持至分化后第21天。心肌特異性標(biāo)記NKX2.5和cTNT在誘導(dǎo)2周后顯著上調(diào)，并呈現(xiàn)持續(xù)上升狀態(tài)。分化2周后自主節(jié)律性搏動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始出現(xiàn)（圖4B圖中畫虛線的部位顯示自主搏動(dòng)區(qū)域），每?jī)商爝M(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)出現(xiàn)陽(yáng)性搏動(dòng)的擬胚體占總擬胚體的百分率，在分化后21 d達(dá)到最高值（31%，n＝100）。將陽(yáng)性搏動(dòng)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行消化再次接種于玻片上，進(jìn)行免疫組化染色分析，心肌特異性抗原cTNT呈陽(yáng)性表達(dá)（圖4C）。

Fig.4 Cardiomyocyte differentiation A：Real-time PCR analysis of the related genes expression during cardiac differentiation；B：Sponenous beating embryoid body（n＝3）；C：Immonostaining of cardiomyocytes derived from ARVC-hiPSCs for the cTNT with DAPI staining of nuclei

3 討論

致心律失常性右室心肌病臨床表現(xiàn)為惡性心律失常伴右室功能下降，進(jìn)展到晚期階段，脂肪纖維細(xì)胞侵潤(rùn)導(dǎo)致存活的心肌細(xì)胞部分阻隔形成電傳導(dǎo)障礙，產(chǎn)生持續(xù)性心動(dòng)過(guò)速，導(dǎo)致心室擴(kuò)大和心力衰竭。迄今為止，人ARVC研究仍主要集中在尸檢，但終末期病理不能真實(shí)反映疾病的隱匿期和前期的變化。而臨床右室游離壁活檢，承擔(dān)右室壁穿孔危險(xiǎn)，另外活體取材只局限于形態(tài)學(xué)比較，并不能夠針對(duì)心肌細(xì)胞的具體功能反映（如離子通道表達(dá)、分布、動(dòng)作電位時(shí)程變化和藥物敏感性等問(wèn)題）作進(jìn)一步的研究。因此，建立人體外ARVC疾病模型對(duì)于闡明該疾病機(jī)理以及進(jìn)行早期的干預(yù)治療有重要的臨床意義。

iPSCs經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)可分化為各種類型的細(xì)胞，應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究，這使患者突變體特異性的細(xì)胞模型研究成為可能。我們利用ARVC患者的表皮成纖維細(xì)胞為重編程供體，建立ARVC突變體特異性細(xì)胞模型。多種心臟疾病已建立了iPS，并得到定向分化的心肌細(xì)胞，如長(zhǎng)QT綜合癥1，長(zhǎng)QT綜合癥2，長(zhǎng)QT綜合癥3，長(zhǎng)QT綜合癥8，Brugada綜合癥和兒茶酚胺依賴性多形性VT等，這將有利于深入揭示遺傳性心律失常發(fā)病機(jī)理，推動(dòng)新藥藥理，藥效和藥物毒理等諸方面新進(jìn)展，推動(dòng)實(shí)現(xiàn)患者特異性的藥物篩選成為可能［9-11］，我們研究組一直致力于建立患者特異性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞模型。

本實(shí)驗(yàn)成功獲得ARVC患者特異性的iPSCs，具備類似胚胎干細(xì)胞的形態(tài)，以及基因和蛋白表達(dá)水平，在體內(nèi)和體外均具有向3個(gè)胚層進(jìn)行分化的能力，因此，ARVC本身的雜合突變并不影響細(xì)胞重編程的效率。不同于常規(guī)的病毒誘導(dǎo)，我們采用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)，其攜帶的外源基因在穩(wěn)定傳代后可自動(dòng)清除，由此建立無(wú)外源基因整合的iPSCs，染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強(qiáng)，所建立的模型更真實(shí)，也提高其將來(lái)臨床應(yīng)用的安全性。

PKP2基因編碼的Plakophilin2蛋白是最常見(jiàn)的ARVC致病基因，Plakophilin2蛋白是橋粒蛋白的重要組成。有70%的家族性ARVC為PKP2基因突變所致，然而由于突變的位點(diǎn)不同，其表型顯示多樣性［12］。目前國(guó)際范圍內(nèi)，有關(guān) ARVC患者來(lái)源的iPSCs報(bào)道中，所含的突變位點(diǎn)各異［13-15］。

我們確診的此例病人PKP2基因第10號(hào)外顯子雜和突變，為該基因又一新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。ARVC發(fā)病多為青壯年，本研究的皮膚樣品來(lái)源于53歲患者，年齡并未影響體細(xì)胞的原代培養(yǎng)，以及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系建立。新突變位點(diǎn)模型的建立有助于世界范圍內(nèi)ARVC突變個(gè)體多樣性的研究。ARVC-iPSCs可定向誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌細(xì)胞，對(duì)于患者來(lái)源的心肌細(xì)胞我們將進(jìn)一步探討其電生理特征，以期尋求ARVC中由于PKP2雜合突變對(duì)于電生理特征的影響。

綜上所述，ARVC患者來(lái)源的皮膚細(xì)胞可以經(jīng)過(guò)仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染重編程為具有多向分化并可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的無(wú)外源基因插入的干細(xì)胞，為研究ARVC提供了突變細(xì)胞模型；通過(guò)心肌定向誘導(dǎo)可以分化為心肌細(xì)胞，為ARVC致病機(jī)理研究以及臨床基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Generation of induced pluripotent stem cells from arrhythmogenic right ventricular disease patient

JIANG Bin，WANG Guo-qing，LI Hong-xia，JIANGWen-ping，CHEN Tao△，JIANG Yan△
（Soochow University，Suzhou 215123，China）

Objective：To establish the induced pluripotent stem cells（iPSCs）from patients with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy（ARVC）.Methods：The fibroblasts were isolated from ARVCpatient and DNA mutation sites were confirmed.We reprogrammed the patient fibroblasts to pluripotency by sendaiviral transduction with defined pluripotency factors.Then，we evaluated the pluripotency of ARVC-iPSCs by performing the immunofluorescence analysis，real-time PCRand 3 germ layer formation assay.We also induced the ARVC-iPSCs into cardiac specific differentiation by regulating Wnt signaling pathway.Results：Apart from alkaline phosphatase positive staining，iPSCs derived from ARVCpatients expressed pluripotent related genes and embryonic stem cell marker OCT4，SSEA4 and TRA-1-81.Embryonic body formation in vitro and teratoma test in vivo demonstrated that ARVC-iPSCs could differentiate into all three germ layers.After in vitro cardiac differentiation，ARVC-iPSCcould be successfully induced to spontaneously beating mass with cTNTstaining positive.Conclusion：Induced pluripotent stem cell was successfully established by integration free sendai virus from dermal fibroblast of patients with ARVC.It would provide the valuable experimental model to study the molecular mechanism of ARVC.

arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy； induced pluripotent stem cells； cardiac differentiation

R991

A

1000-6834（2017）06-503-05

10.12047／j.cjap.5474.2017.120

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81300143）；中國(guó)博士后基金（2013M541718）

2016-07-13

2017-05-18

△【通訊作者】Tel：15950069815，18260195811；E-mail：Yjiang＠suda.edu.cn，Tchen＠suda.edu.cn