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(1.南京師范大學生命科學學院,江蘇南京 210023;2.南京師范大學中北學院,江蘇南京 210023;3.江蘇天美健大自然生物工程有限公司,江蘇南京 210046)

牛初乳凍干粉和常乳凍干粉的降血糖及抗氧化作用

王小軍1,高睿嘉1,郁樺3,狄怡琳1,李玲3,王藝茗1,丁寧1,魏揚智1,于天陽2,葛文金3,王榮昌3,程光宇1

(1.南京師范大學生命科學學院,江蘇南京 210023;2.南京師范大學中北學院,江蘇南京 210023;3.江蘇天美健大自然生物工程有限公司,江蘇南京 210046)

牛初乳凍干粉,常乳凍干粉,降血糖,類胰島素生長因子,抗氧化作用,小鼠

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳凍干粉 商品名為乃捷爾牌初乳素膠囊(衛(wèi)食健字【1997】第418號),由江蘇天美健大自然生物工程有限公司提供。其中免疫球蛋白含量為22.3%,VC含量為28.6 mg/100 g,VE含量為9.1 mg/100 g。常乳凍干粉 為市售全脂滅菌純牛奶(100%純牛奶,南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司),經(jīng)離心脫脂,采用冷凍干燥工藝加工而成。四氧嘧啶、DPPH、VC美國Sigma公司;四乙氧基丙烷(TEP) Fluka公司;NBT Biosharp公司;降糖靈(國藥準字H37021531) 山東仁和堂藥業(yè)有限公司;TBA、水楊酸、鄰甲苯胺、鄰苯二甲醛、香草醛 國藥集團化學試劑有限公司。IGF-I、IGF-Ⅱ ELISA試劑盒 南京建成生物工程研究所;實驗動物為昆明種90只雄性小鼠(6周齡左右),體重(25±2) g 購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心。

GT1型冷凍干燥機 德國SRK系統(tǒng)技術有限公司;Z36HK型高速冷凍離心機 德國Hermle公司;EV300型紫外可見分光光度計 美國Thermo fisher公司;RT-6000型酶標分析儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司;DK-8D電熱恒溫水浴箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及動物模型制備 小鼠按常規(guī)飼養(yǎng)7 d,測定基礎血糖值,選合格小鼠禁食24 h后,按150 mg/kg.bw劑量腹腔注射用生理鹽水配制的4%的四氧嘧啶溶液,5 d后禁食4 h,測定小鼠空腹血糖值,選取血糖值在10 mmol/L以上、尿糖呈3(+)以上的小鼠作為高血糖模型成功動物作為實驗對象,依血糖值隨機分層分組,每組15只,各組間血糖值無顯著差異。實驗[13]分正常對照組(1組)、模型組(2組)、降糖靈組(3組,100 mg/kg)、常乳凍干粉(LM)組(4組,600 mg/kg)和牛初乳凍干粉(LBC)低劑量組(5組,100 mg/kg)和高劑量組(6組,600 mg/kg)。降糖靈組每天灌胃給藥(0.2 mL/10 g)、LM組和LBC組每天灌胃給予不同劑量受試樣品(0.2 mL/10 g),模型組和對照組給予等量蒸餾水,連續(xù)飼養(yǎng)30 d,期間觀察記錄各組小鼠飲水、飲食量及體重變化等指標,第30 d禁食12 h后進行各項指標測定[13]。

1.2.3 羥自由基(·OH)測定 取LBC和LM加入生理鹽水,超聲提取20 min,于12000 r/min冷凍離心15 min,取上清液配成一定濃度的系列溶液后,按Smirnoff的水楊酸法,并根據(jù)馬曉華等[16]改進方法進行實驗。

1.2.4 DPPH自由基的測定 將1.2.3中離心后的上清用生理鹽水配制成一定濃度的系列溶液后,按Dasgupta和Bratati的方法[17]測定DPPH·的清除作用。

1.2.5 丙二醛(MDA)含量測定 小鼠組織MDA含量測定以TEP為標準,按文獻[13]進行。

1.2.6 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和胰島素含量測定 將LBC和LM用生理鹽水配制成150 mg/mL的溶液,于12000×g 離心20 min(4 ℃),取上清液調(diào)pH至4.6,攪拌1 h,離心除酪蛋白得乳清。將乳清pH調(diào)至6.4左右,分別測定游離態(tài)IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和胰島素含量。在測定總IGF-Ⅰ時,將200 μL乳清+800 μL酸/乙醇溶液(12.5 mL濃度為2 mol/L的HCl+87.5 mL無水乙醇)混合,25 ℃靜置30 min,3500×g離心30 min,取500 μL上清液,用200 μL濃度為0.855 mol/L的Tris溶液中和[18],適當稀釋后測定總IGF-Ⅰ。結合態(tài)IGF-Ⅰ=總IGF-Ⅰ-游離態(tài)IGF-Ⅰ。

采取綜合防控措施，減少動物疫病的發(fā)生。堅持“預防為主、治療為輔”的方針，散養(yǎng)戶采取“集中免疫與適時補針”相結合，規(guī)模養(yǎng)殖場按程序進行免疫注射。在抓好春秋兩季強制免疫工作的同時，要嚴格落實防疫工作責任制，切實落實免疫、監(jiān)測、檢疫和應急管理等各項防控措施。另外，要抓好布病、結核病、狂犬病等人畜共患病的防控和小反芻獸等外來動物疫病的防控。要引導養(yǎng)殖場逐步做好動物疫病的凈化工作，如牛羊布病、結核病、豬偽狂犬病的凈化工作。發(fā)現(xiàn)動物疫情嚴格按“早、快、嚴、小”的要求處理，努力確保不發(fā)生區(qū)域性重大動物疫情[2]。

IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ測定采用ELISA法,按說明書進行。胰島素測定采用放射免疫法,按說明書進行。

1.2.7 血脂水平測定 血清總膽固醇(TC)采用鄰苯二甲醛法測定[19],血清總脂采用香草醛微量法測定[19]。

1.2.8 血糖及糖耐量測定 小鼠禁食不禁水12 h后,尾靜脈取血,采用鄰甲苯胺超微量法(O-TB法)[20]測定血糖含量。血糖下降百分率(%)=(實驗前血糖值-實驗后血糖值)/實驗前血糖值×100。糖耐量測定按文獻[13]方法進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果與分析

2.1 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和胰島素含量分析

IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ是LBC中的主要降血糖因子,其中IGF-Ⅰ能通過保護胰島β細胞免受自由基的損傷,保證胰島β細胞的結構和功能,達到對糖尿病的預防效果[31]。LBC的IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ含量分析見圖1。LBC中的總IGF-Ⅰ(1146.5 ng/g)和游離態(tài)IGF-Ⅰ顯著高于LM(p<0.01)。LBC中的IGF-Ⅰ有游離態(tài)和結合態(tài)兩種,其中游離態(tài)IGF-Ⅰ占總IGF-Ⅰ的82.8%,是LBC中的主要IGF-Ⅰ形式,它與結合態(tài)之比為4.64∶1,但在LM中,IGF-Ⅰ主要以結合態(tài)存在,游離態(tài)和結合態(tài)之比為0.48∶1。LBC和LM中的結合態(tài)IGF-Ⅰ含量基本相同,兩者之間無統(tǒng)計學差異。LBC的總IGF-Ⅰ和游離態(tài)IGF-Ⅰ含量分別是LM的3.2倍和7.1倍。LBC的IGF-Ⅱ含量為1303.0 ng/g,極顯著高于LM(p<0.01),是LM的5.1倍。胰島素含量測定采用放射免疫法,LBC中胰島素含量為4.1 mIU/L,相當于128.4 ng/g胰島素含量,LM中未檢測出胰島素。

圖1 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉的IGF-Ⅰ(A)和IGF-Ⅱ(B)含量測定Fig.1 The determination of IGF-Ⅰ(A) and IGF-Ⅱ(B)in LBC and LM注:與常乳凍干粉相比:** p<0.01。

2.2 自由基清除作用

圖2 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉的超氧自由基(A)、羥自由基(B)和DPPH·(C)的清除活性Fig.2 The scavenging activities of LBC and LM on superoxide radical(A),hydroxyl(B)and DPPH(C)radicals

2.3 對糖尿病小鼠飲水飲食、體重及免疫器官的影響

造模后的糖尿病小鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿和體重減輕,即“三多一少”癥狀,與對照組差異顯著(p<0.01)。同時,模型組免疫器官受到一定程度損傷,其臟器指數(shù)較對照組顯著降低(p<0.05或p<0.01)。服用LBC后,高劑量組的飲食、飲水量明顯減少,體重有所增加,胸腺指數(shù)明顯增加,與模型組相比差異有顯著性(p<0.05或p<0.01),低劑量組雖然有減輕糖尿病癥狀趨勢,但與模型組相比,其差異無顯著性意義。LM對糖尿病癥狀和臟器指數(shù)增加有緩解趨勢,但無明顯改善作用(見表1)。說明LBC對糖尿病小鼠“三多一少”病癥的改善和恢復被損傷的免疫器官功能有積極的預防作用。

表1 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉對小鼠飲水飲食、體重及免疫器官的影響Table 1 The effect of LBC and LM on drinking,eating,weight body and immune organ in mice(±s,n=15)

注:與模型組相比:* p<0.05;** p<0.01;與對照組比:#p<0.05;##p<0.01,表2、表3同。

表2 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉對糖尿病小鼠血糖、血脂的影響Table 2 The effect of LBC and LM on blood sugar and blood fat in diabetic mice

2.4 對糖尿病小鼠血糖、血脂水平的影響

結果見表2。造模后的小鼠的血糖值維持在一個較高水平,給予LM和LBC低劑量后,血糖值有所降低,血糖下降百分率有所提高,但無統(tǒng)計學意義。給予LBC高劑量(600 mg/kg)30 d后,能顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平,與模型組相比有顯著性差異(p<0.05),其血糖下降百分率為43.4%,與陽性藥物降糖靈的降血糖效果基本相當(44.6%),而模型組小鼠的血糖值僅降低16.7%。血脂測定結果表明,造模后模型組的總脂和TC水平比對照組顯著升高(p<0.01),在給予LM(600 mg/kg)和LBC(100 mg/kg和600 mg/kg)后,對總脂水平未見明顯的影響;對TC水平而言,在給予LBC低(100 mg/kg)、高劑量(600 mg/kg)后,LBC低劑量組的TC水平雖有所降低,但與模型組相比,無顯著性差異。LBC高劑量組能顯著降低TC水平(p<0.05),其TC水平(比模型組降低了36.2%)與降糖靈的TC水平(比模型組降低了34.5%)一致,并已經(jīng)接近對照組的TC水平。以上結果表明,LBC能降低糖尿病小鼠的血糖水平,對因糖代謝失調(diào)而引起的膽固醇升高有一定改善作用。

2.5 對糖尿病小鼠糖耐量的影響

結果見圖3。糖尿病小鼠在給予LM30 d后,在0 h的血糖值與模型組相比顯示了明顯的降低,但在0.5 h、1 h和2 h的血糖值與模型組相比均無顯著性統(tǒng)計學差異。糖尿病小鼠在給予LBC(低劑量和高劑量)30 d后,在0 h的血糖值都明顯低于模型組,LBC低劑量在2 h的血糖值,LBC高劑量在1 h和2 h的血糖值均明顯低于模型組,分別與相應的模型組相比均有顯著性統(tǒng)計學差異((p<0.05或p<0.01),其中,LBC組低劑量和高劑量在2 h的血糖值比相應的模型組降低了26.7%和32.5%(降糖靈的這一數(shù)值為40.6%)。血糖曲線下面積(AUC)測定表明,低、高劑量LBC的AUC都比模型組降低了18.7%和23.5%,與模型組相比均有顯著性差異(p<0.05或p<0.01)。提示LBC具有增加糖尿病小鼠糖耐量的作用。

2.6 對小鼠血液SOD活性、血清MDA的影響

SOD是清除超氧自由基的關鍵酶,它作用于清除自由基的早期起始階段,對防御機體氧化損傷尤為重要。MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物,它作為組織損傷的一種指標,已經(jīng)被廣泛應用于抗氧化的研究中。血液SOD活性和血清MDA含量測定結果見表3。造模后的糖尿病小鼠紅細胞SOD活性在14 d和30 d明顯下降,與對照組相比有顯著性差異(p<0.05或p<0.01),在給予LBC后,低劑量在30 d時SOD活性提高,與模型組相比有顯著性差異(p<0.05);高劑量在14 d和30 d時的SOD活性分別比模型組提高了9.0%和15.5%,與模型組相比均有顯著性意義(p<0.01或p<0.05)。血清MDA含量測定結果顯示,造模后小鼠血清MDA含量明顯升高(p<0.01),在給予LBC高劑量后,MDA含量比模型組降低了48.6%,與模型組相比差異有顯著性(p<0.01)。提示LBC能提高動物體內(nèi)SOD活性,降低MDA含量,能及時清除因糖代謝失調(diào)而產(chǎn)生的過多自由基,有助于降低組織的脂質(zhì)過氧化物水平。

表3 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉對糖尿病小鼠血液SOD活性、血清MDA含量影響Table 3 The effect of LBC and LM on blood SOD activity and serum MDA content in diabetic mice

圖3 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉對糖尿病小鼠糖耐量的影響Fig.3 The effect of LBC and LM on the glucose tolerance of diabetic mice注:1:對照組;2:模型組;3:降糖靈組;4:LM組(600 mg/kg);5:LBC低劑量組(100 mg/kg);6:LBC高劑量組(600 mg/kg)。與對照組比:# p<0.05;## p<0.01;與模型組相比:* p<0.05;** p<0.01。

3 結論與討論

牛初乳中含有許多生物活性物質(zhì),其中胰島素、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ等是調(diào)節(jié)血糖代謝的重要生長因子。胰島素是生物體調(diào)節(jié)糖代謝,控制血糖平衡的最重要激素,胰島素分泌不足及胰島素抵抗是形成糖尿病的主要原因。IGFs是具有胰島素樣活性的生長因子,具有降血糖、降血脂作用,對糖尿病及其并發(fā)癥具有較好的治療效果[18],其中IGF-Ⅰ是牛初乳中含量最高的生長因子,對Ⅰ型糖尿病動物的胰島β細胞具有保護作用[12]。這些生長因子在分娩后幾天的牛初乳中含量是最高的。胰島素在分娩后第一次的奶中含量為327 ng/mL,24 h后含量降了50%,至第7 d時含量為46 ng/mL[21]。IGF-1在第1 d牛初乳中含量最高,Oda Shinnichi等報道值為449 ng/mL[32],Prosser等報道值為176 ng/mL[22],隨后迅速下降,第五天含量為5 ng/mL[22],常乳平均含量為2.6 ng/mL,變化范圍在1.27～8.1 ng/mL[21]。本研究所用LBC是以奶牛分娩3天內(nèi)的牛初乳為原料,經(jīng)冷凍干燥工藝加工而成,它不僅保留了牛初乳中大量的生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì),而且保留了含量豐富的生物活性物質(zhì)(如免疫球蛋白)及生長因子等,同時,合理的加工工藝也避免了它們在干燥過程中因溫度而造成的失活和防止因超濾濃縮而致小分子生長因子含量下降。經(jīng)檢測,LBC的IgG含量為22.7%,胰島素含量為128 ng/g,IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ含量分別為1146.5 ng/g和1303.0 ng/g。LM的這些活性物質(zhì)含量遠低于LBC。牛初乳中這些生物活性物質(zhì),在采用科學合理的加工工藝后得以保留,正是LBC具有降血糖作用的物質(zhì)基礎。俞茂華等[10]用牛初乳提取物治療Ⅱ型糖尿病顯示了降血糖效果。丁紅等[11]觀察到牛初乳粉具有降低STZ糖尿病大鼠血糖及總膽固醇作用。云振宇[24-25]等研究表明,牛初乳IGF-I分離物對大鼠高血糖有一定的治療作用,其機理為保護胰腺β-細胞免受STZ損傷,并在一定程度上促進其增殖,且有持續(xù)、穩(wěn)定的降糖效應。本文研究結果表明,LBC對糖尿病小鼠的高血糖和高血脂水平都有較好的緩解作用,其降血糖機理與IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ等的活性成分密切相關。

牛初乳中IGF-Ⅰ有游離態(tài)和結合態(tài)兩種形式。Prosser[22]指出在分娩和產(chǎn)后2 d的牛初乳中82%的IGF-Ⅰ是游離態(tài)。劉海燕和潘道東[23]研究表明,分娩后兩天內(nèi)的牛初乳中71%以上的IGF-Ⅰ是游離態(tài),第6 d時,IGF-Ⅰ中的游離態(tài)低于結合態(tài),至第14 d時,游離態(tài)占總IGF-Ⅰ的41.4%。本研究表明,LBC中IGF-Ⅰ主要是游離態(tài),它占總IGF-Ⅰ的82.8%,LM中IGF-Ⅰ以結合態(tài)為主,游離態(tài)占總IGF-Ⅰ的36.5%。本實驗測定結果與文獻報道結果基本一致。牛初乳中還存在一種短鏈IGF-Ⅰ,它占總IGF-Ⅰ的50%[22],被認為是牛初乳中的降糖因子。短鏈IGF-Ⅰ與其結合蛋白有較低親和力,與其受體有較高親和力,具有比正常IGF-Ⅰ更高的生物學效應,其活性是正常IGF-Ⅰ活性的10倍[26]。推測在LBC中,大部分游離態(tài)IGF-Ⅰ是短鏈IGF-Ⅰ,這可能是LBC具有降血糖作用的主要原因之一。

本文研究表明,LBC對糖尿病小鼠具有一定的降血糖和抗氧化作用,揭示了它在預防和輔助治療糖尿病及其并發(fā)癥方面的應用潛力。進一步分析LBC的功效因子,在基因分子水平上深入探討它的降血糖和抗氧化的作用機理,開發(fā)具有相應功能的保健食品和藥品,是今后主要研究的方向。

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Hypoglycemicandantioxidationeffectoflyophilizedbovinecolostrumsandlyophilizedmilk

WANGXiao-jun1,GAORui-jia1,YUHua3,DIYi-lin1,LILing3,WANGYi-ming1,DINGNing1,WEIYang-zhi1,YUTian-yang2,GEWen-jin3,WANGRong-chang3,CHENGGuang-yu1

(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China;2.Nanjing Normal University Zhongbei College,Nanjing 210023,China;3.Jiangsu TMG nature Biological Engineering Co.,Ltd;Nanjing 210046,China)

Objective:To study on hypoglycemic effect and antioxidative effects of lyophilized bovine colostrums(LBC)and lyophilized milk(LM). Methods:The free radical scavenging activity,IGFs and insulin content were detected by biochemical analysis. Alloxan diabetes model was induced in mice where rats were treated with Phenformin(100 mg/kg),LM(600 mg/kg)and LBC(100、600 mg/kg)respectively. Besides,normal mice were used as control. The blood glucose,glucose tolerance and antioxidant and other indicators were measured after 30 days.Results:The EC50of scavenging superoxide free radicals and DPPH free radicals were respectively 245.3,167.2 μg/mL in LBC.The content of IGF-I,IGF-Ⅱ and insulin of LBC were 1146.5,1303.0,128.4 ng/g respectively. LM had a part of scavenging effect on hydroxyl free radicals,and the content of IGFs was significantly lower than LBC and insulin was not detected. LBC made significantly improvement on diabetic mice,significantly lower blood glucose levels,reduced the content of MDA and TC in serum,enhanced the tolerance and blood SOD activity. LM had no significant improvement in blood glucose level and antioxidant index. Conclusion:LBC included higher hypoglycemic factors,producted exhibited strong radical-scavenging activityinvivothan LM,which has hypoglycemic and antioxidative effects on diabetic mice.

lyophilized bovine colostrums;lyophilized milk;hypoglycemic effect;insulin-like growth factor;antioxidation;mice

2017-05-08

王小軍(1981-)，男，博士，實驗師，研究方向：生物活性物質(zhì)分離純化及功能食品研究，E-mail:wangxiaojun0910@njnu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31500373)；江蘇省品牌專業(yè)支助(PPZY2015B117)。

TS252.1

A

1002-0306(2017)23-0262-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.048