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(1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,河南鄭州 450002;2.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,河南鄭州 450004)

幾種香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外抑菌效果

王小慧1,魏法山2,李苗云1,*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,河南鄭州 450002;2.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,河南鄭州 450004)

研究白芷精油、黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens,C.perfringens)的抑制作用,篩選出對產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑菌效果的香辛料精油。采用牛津杯法和兩倍稀釋法分別判定不同香辛料精油對C.perfringens(ATCC13124、CICC22949、C1和C2)的抑菌圈大小和最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。結(jié)果顯示:肉桂精油對C.perfringens的抑菌圈直徑最大,且對產(chǎn)氣莢膜梭菌 ATCC13124、CICC22949、C1和C2的MIC分別為2.75、2.75、5.5、2.75 mg/mL;艾草精油對C.perfringens的MIC分別為11、2.75、11、2.75 mg/mL;黑胡椒精油對C.perfringens的MIC分別為22、11、11、5.5 mg/mL;茴香精油對C.perfringens的MIC分別為11、5.5、11、2.75 mg/mL;姜精油對C.perfringens的MIC分別為88、22、22、22 mg/mL。結(jié)論:除白芷精油以外,其他5種香辛料精油對C.perfringens均有不同程度的抑菌作用,其中肉桂精油對C.perfringens的抑菌效果最佳。

香辛料精油,產(chǎn)氣莢膜梭菌,抑菌圈,最小抑菌濃度

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的人獸共患病的病原體,可引起多種動物壞死性腸炎、腸毒血癥,同時也是人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽以及人類食物中毒的主要病原菌之一[1]。目前,主要使用抗生素及化學合成藥物來防治產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病,這導致產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性菌株不斷出現(xiàn),以致疾病難以控制。近年來,植物精油的殺菌功能越來越引起人們的注意,植物精油類物質(zhì)的殺菌作用較普遍,從中篩選出新型替代物代替抗生素及化學合成藥是解決抗生素濫用問題的有效途徑[2]。研究發(fā)現(xiàn),肉桂精油、薰衣草精油、草果精油和花椒精油對致病菌都有一定的抑制作用[3-4],肉桂精油的主要化學成分為反式肉桂醛、反式鄰甲氧基肉桂醛和乙酸桂酯等[5-7],這些物質(zhì)具有強烈的抑制或殺死微生物的特性。顧仁勇[8]等人的研究表明,丁香、連翹及肉桂等五種香辛料精油均對細菌、霉菌和酵母具有一定的抑制能力。Deans S G[9]對50種植物精油的抑菌活性進行評價,發(fā)現(xiàn)百里香、肉桂、丁香、杏仁、香果和馬郁蘭6種精油對供試的25種菌種抑制效果最好且最全面。LópezP[10]等用肉桂、丁香、羅勒、迷迭香、蒔蘿和姜等6種精油分別對革蘭氏陽性細菌和陰性細菌和真菌進行了抑菌活性實驗,結(jié)果表明這6種精油對所選用的革蘭氏陽性細菌和陰性細菌及真菌都有一定的抑制效果,其中肉桂和丁香兩種精油的抑制效果最好。Tassou[11]等發(fā)現(xiàn)NaCl與薄荷精油對沙門氏菌和李斯特菌的抑制具有協(xié)同作用。Khalfallah[12]等對阿米芹精油的抑菌活性進行研究,發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌有很好的抑制效果。然而,關(guān)于精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑菌效果方面,國內(nèi)外研究較少。

為研究香辛料精油對C.perfringens的抑制效果,本文采用牛津杯法和二倍稀釋法研究白芷精油、黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油對C.perfringens的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124 購于ATCC菌種庫;標準菌株CICC22949 購于CICC菌種庫;產(chǎn)氣莢膜梭菌分離菌株C1和C2真空脹袋熟肉制品中分離得到;白芷精油、黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油(純度均大于99%,密度均為0.88 g/mL) 購自上?；囟鲊H貿(mào)易有限公司;吐溫-80和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA) 購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)和亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SPS) 購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

HVE-50型蒸汽壓力滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司;VORTEX-2GENIE型渦旋振蕩器 美國ScientificIndustries公司;SPX-1505H-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械公司;SW-CJ-2F型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;C-32型日本三菱瓦斯厭氧培養(yǎng)罐 日本三菱瓦斯化學株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 香辛料精油的配制 將6種香辛料精油分別按照精油4 mL、吐溫-80 1 mL、無菌蒸餾水5 mL的比例混合均勻[2],配制成濃度為352 mg/mL的香辛料精油,搖勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 菌懸液的制備 將用磁珠保存的標準菌株和分離菌株均劃線到TSC平板培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)18～24 h,再將TSC上的單個菌落劃線到TSA平板培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)18～24 h,用接種環(huán)挑取菌落接種到FTG液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)18～24 h,得到初始菌液(107～108CFU/mL)。

1.2.3 不同香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活力研究 牛津杯法[13-16]:吸取200 μL初始菌液至TSA培養(yǎng)基上,用涂布器均勻涂布3次。用無菌鑷子取規(guī)格完全一致的牛津小杯(10 mm×7.8 mm×6 mm)置于含菌的瓊脂平板上,然后用移液槍在牛津杯中加入濃度為352 mg/mL的植物精油懸浮液100 μL,每種植物油做三個平行,另外取三個平板,每個平板放置三個牛津杯涂布菌液,分別吸取100 μL無菌蒸餾水和100 μL吐溫-80加入牛津杯中作為空白對照,正置平板于恒溫(37 ℃)厭氧培養(yǎng)罐中培養(yǎng)24 h,觀察抑菌圈大小并拍照記錄結(jié)果。

抑菌性判定標準[17-18]:抑菌圈直徑大于20 mm為極敏,15～20 mm為高敏,10～15 mm為中敏,7～9 mm為低敏,無抑菌圈者為不敏感。

1.2.4 不同香辛料精油最低抑菌濃度(MIC)的研究 兩倍稀釋法[19-20]:于13支試管中加入FTG液體培養(yǎng)基各1.0 mL,分別標記為試管1～13,試管1中加入1.2.1步驟中配制好的香辛料精油1.0 mL,混合均勻后,吸取1.0 mL加入試管2中,同法稀釋至試管12,從試管12中取出1.0 mL液體至一滅菌空試管中作為空白對照,以便觀察香辛料精油是否被污染(標記為試管14)。試管13為陽性生長對照管。香辛料精油的初始濃度為352 mg/mL,那么1～12試管的濃度分別為176、88、44、22、11、5.5、2.75、1.375、0.6875、0.3438、0.1719和0.0859 mg/mL。試管1～13中分別加入100 μL菌液,另取一支試管加入1.0 mL FTG液體培養(yǎng)基,加入1.0 mL和初始香辛料精油濃度相同的吐溫-80 1.0 mL和100 μL菌液作為對照實驗(助溶劑對照管,標記為試管15),以便觀察助溶劑吐溫-80對C.perfringens生長有無影響。在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)18～24 h,觀察試管內(nèi)液體是否渾濁,來判斷是否有C.perfringens生長。由于某些精油本身具有顏色,試管內(nèi)液體是否渾濁不易觀察清楚,然后分別吸取各試管內(nèi)液體200 μL至TSA培養(yǎng)基上,涂布均勻,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。凡是無菌生長的TSA平板對應的香辛料精油最高稀釋濃度為這種香辛料精油對C.perfringens的最小抑菌濃度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel計算重復實驗所測得的抑菌圈直徑的平均值及標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活力結(jié)果

表1 香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活力Table 1 Inhibitory activity of different spices essential oils on Clostridium perfringens

不同香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌圈直徑大小如表1所示,無論產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株還是分離菌株,6種香辛料精油中,肉桂精油的抑菌圈直徑最大,抑菌效果最好,其次分別是艾草精油、茴香精油、黑胡椒精油和姜精油,而白芷精油的抑菌圈直徑在9 mm左右,表明白芷精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌無明顯的抑制作用。區(qū)敏港[2]等人的研究也表明了黑胡椒精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果比姜精油的抑制效果好,這與香辛料精油所含的化學成分有關(guān)。

2.2 香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC結(jié)果

2.2.1 肉桂精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC 表2為產(chǎn)氣莢膜梭菌在一系列濃度的肉桂精油條件下的生長狀況,凡是無菌生長的TSA平板對應的肉桂精油的最高稀釋濃度為肉桂精油對C.perfringens的最小抑菌濃度,因此,肉桂精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株ATCC13124、CICC22949、分離菌株C1和C2的最小抑菌濃度分別為2.75、2.75、5.5和2.75 mg/mL,表明肉桂精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌不同菌株的MIC沒有明顯差異。

表2 肉桂精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的影響Table 2 The effect of cinnamon essential oil on the growth of Clostridium perfringens

注:“-”:被抑制,產(chǎn)氣莢膜梭菌無大量生長;“+”:產(chǎn)氣莢膜梭菌大量生長,表3～表6同。

2.2.2 艾草精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC 由表3可知,艾草精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株ATCC13124、CICC22949、分離菌株C1和C2的最小抑菌濃度分別為11、2.75、11和2.75 mg/mL,表明艾草精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌不同菌株的MIC沒有明顯差異。

2.2.3 黑胡椒精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC 表4為產(chǎn)氣莢膜梭菌在一系列濃度的黑胡椒精油條件下的生長狀況,黑胡椒精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株ATCC13124、CICC22949、分離菌株C1和C2的最低抑菌濃度分別為22、11、11和5.5 mg/mL。

表3 艾草精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的影響Table 3 The effect of wormwood essential oil on the growth of Clostridium perfringens

表4 黑胡椒精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的影響Table 4 The effect of black pepper essential oil on the growth of Clostridium perfringens

2.2.4 茴香精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC 由表5可知,茴香精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株ATCC13124、CICC22949、分離菌株C1和C2的最小抑菌濃度分別為11、5.5、11和2.75 mg/mL,表明茴香精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌不同菌株的MIC存在較大差異。

表5 茴香精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的影響Table 5 The effect of anise essential oil on the growth of Clostridium perfringens

表6 姜精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的影響Table 6 The effect of ginger essential oil on the growth of Clostridium perfringens

2.2.5 姜精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC 由表6可知,姜精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株ATCC13124、CICC22949、分離菌株C1和C2的最小抑菌濃度分別為88、22、22和22 mg/mL,姜精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124的MIC明顯不同于其他菌株。

3 結(jié)論與討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性致病芽孢桿菌,黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油對C.perfringens均有不同程度的抑制作用,其中肉桂精油對C.perfringens的抑制效果最佳,其次為艾草精油、茴香精油、黑胡椒精油和姜精油,而白芷精油對C.perfringens無明顯的抑制作用。不同香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC不同,這與香辛料精油所含的化學成分有關(guān)[3],區(qū)敏港[2]等人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),黑胡椒精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果比姜精油的抑菌效果好。此外,也有研究表明,肉桂精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌也具有抑制作用[21-22],茴香精油對細菌也均有一定的抑制作用[23]。然而,由于香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑菌效果的研究較少,還需進一步研究其他香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果及作用機理。

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BacteriostaticeffectsofdifferentspicesessentialoilsonClostridiumperfringensinvitro

WANGXiao-hui1,WEIFa-shan2,LIMiao-yun1,*

(1.College of Food Science and Technology,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Product Quality Supervision and Inspection Institute of Henan Province,Zhengzhou 450004,China)

The effect of different spices essential oils(angelica essential oil,black-pepper essential oil,anise essential oil,cinnamon essential oil,ginger essential oil and wormwood essential oil)on the growth ofClostridiumperfringen(C.perfringens)was studied to select the spices essential oils which had inhibitory effect onClostridiumperfringens. Oxford cup method and two times dilution method were selected to determine the antibacterial circle and minimum inhibitory concentration(MIC)forC.perfringens(Standard strain ATCC13124 and CICC22949,isolated strain C1and C2). The result showed that the diameter of antibacterial circle of cinnamon essential oil was the largest,and the minimum inhibitory concentration(MIC)of cinnamon essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 2.75,2.75,5.5 and 2.75 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of wormwood essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 11,2.75,11 and 2.75 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of black-pepper essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 22,11,11 and 5.5 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of anise essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 11,5.5,11 and 2.75 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of ginger essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 88,22,22 and 22 mg/mL,respectively. Conclusion:In addition to angelica essential oil,other five spices essential oils had inhibitory effect onC.perfringens,and the inhibition effect of cinnamon essential oil onC.perfringenswas the best.

spices essential oils;Clostridiumperfringens;antibacterial circle;minimum inhibitory concentration(MIC)

2017-03-06

王小慧(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制，E-mail:15136277292@163.com。

*通訊作者:李苗云(1976-)，女，博士，教授，研究方向：肉品加工與安全控制，E-mail:limy7476@126.com。

國家自然科學基金項目(31571856)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0010-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.003