劉小莉，侯承宗，來(lái)涌凱，高 軍，李 潔，尚秋爽，龍 靜，鄧小玉，邱文彬，孫虎山

( 魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025 )

兩種弧菌對(duì)菲律賓蛤仔代謝途徑影響的比較研究

劉小莉，侯承宗，來(lái)涌凱，高 軍，李 潔，尚秋爽，龍 靜，鄧小玉，邱文彬，孫虎山

( 魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025 )

采用基于核磁共振波譜技術(shù)的代謝組學(xué)技術(shù)，探索菲律賓蛤仔在受到鰻弧菌和燦爛弧菌感染的代謝物變化特征，構(gòu)建菲律賓蛤仔對(duì)弧菌感染后的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖譜，并比較兩種弧菌毒性效應(yīng)的差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種代謝物葡萄糖、谷氨酸、蘇氨酸在兩種弧菌感染時(shí)均發(fā)生了變化，表征鰻弧菌感染的代謝物為?；撬?、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；而表征燦爛弧菌污染的代謝物為甜菜堿、二甲基甘氨酸、膽堿、谷氨酸、亞?；撬帷?/p>

鰻弧菌；燦爛弧菌；菲律賓蛤仔；代謝物；核磁共振波譜技術(shù)

隨著我國(guó)海洋高密度養(yǎng)殖技術(shù)的不斷發(fā)展，各種海洋致病菌日益頻繁出現(xiàn)，海水養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌(Vibrio)病的爆發(fā)成為威脅養(yǎng)殖業(yè)的主要瓶頸之一[1]。弧菌病是由弧菌屬細(xì)菌引起的一類細(xì)菌性疾病，弧菌分泌的外毒素等物質(zhì)，可導(dǎo)致多種海洋生物出現(xiàn)出血性敗血癥，并伴隨大面積組織損傷而死亡[2]。其中，鰻弧菌(V.anguillarum)和燦爛弧菌(V.splendidus)是我國(guó)海水養(yǎng)殖動(dòng)物所面臨的重要條件致病菌，由此引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病較為嚴(yán)重，威脅著經(jīng)濟(jì)貝類的養(yǎng)殖安全[3-4]。

鰻弧菌和燦爛弧菌是常見(jiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于海水及近岸河口海區(qū)、沉積物、海洋生物體上等，可感染多種海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)物[5]。無(wú)脊椎動(dòng)物由于缺少真正的淋巴細(xì)胞和功能性抗體，主要依靠非特異性免疫功能來(lái)對(duì)抗病原菌[6-7]。鰻弧菌可引起貝類、蝦類、魚(yú)類等體內(nèi)的免疫功能發(fā)生變化，多種基因表達(dá)異常，引起代謝紊亂[8-11]。燦爛弧菌引起水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生變化，其中33%與免疫反應(yīng)有關(guān)[12-15]。加強(qiáng)海洋貝類(宿主)與弧菌之間相互作用的分子應(yīng)答機(jī)制研究，對(duì)預(yù)防與控制養(yǎng)殖貝類弧菌病的發(fā)生，具有重要的意義。

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)廣泛分布于沿海區(qū)域，在渤海尤其是膠州灣水域分布甚廣[16-17]。在菲律賓蛤仔的生長(zhǎng)過(guò)程中，由于受環(huán)境因素及自身遺傳因素的影響，同一群體中產(chǎn)生了殼色多態(tài)性，經(jīng)過(guò)前期調(diào)研，在渤海地區(qū)菲律賓蛤仔的優(yōu)勢(shì)品系主要包括斑馬蛤、白蛤及兩道紅等。已有的研究表明，不同殼色菲律賓蛤仔的生長(zhǎng)和抗逆性狀差異顯著，免疫指標(biāo)表現(xiàn)出較大差別[18]；不同品系菲律賓蛤仔(白蛤及斑馬蛤)對(duì)致病菌的響應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，白蛤反應(yīng)更為敏感[19]。

代謝組學(xué)能在特定時(shí)間及環(huán)境中，對(duì)生物組織細(xì)胞所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，其目的在于定性和定量生物體內(nèi)各種代謝物，闡明代謝物的變化規(guī)律，從本質(zhì)上揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)和過(guò)程[20-21]。代謝組學(xué)分析技術(shù)因能從全局的角度評(píng)價(jià)生物體系對(duì)外界刺激的應(yīng)答，故可應(yīng)用于評(píng)價(jià)生物體對(duì)致病菌響應(yīng)后代謝物及代謝通路的變化。

本試驗(yàn)以渤海區(qū)域常見(jiàn)的海洋養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類菲律賓蛤仔(白蛤品系)為研究對(duì)象，采用基于核磁共振波譜技術(shù)的代謝組學(xué)技術(shù)，探索菲律賓蛤仔在受到鰻弧菌及燦爛弧菌感染后的代謝物變化特征，比較并構(gòu)建菲律賓蛤仔對(duì)弧菌感染后的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖譜，從代謝水平解析菲律賓蛤仔對(duì)弧菌特異性應(yīng)答效應(yīng)及其分子機(jī)制，以期對(duì)菲律賓蛤仔抗弧菌感染的分子機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 染菌試驗(yàn)

菲律賓蛤仔常規(guī)適應(yīng)性養(yǎng)殖9 d后，選取殼長(zhǎng)相近的個(gè)體進(jìn)行正式試驗(yàn)。試驗(yàn)分為正常對(duì)照組、鰻弧菌染菌組、燦爛弧菌染菌組，每組10枚。參照文獻(xiàn)并在充分預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行菌液密度設(shè)定，鰻弧菌和燦爛弧菌的菌液密度皆調(diào)至1×107cfu/mL[22]。染菌24 h后迅速取消化腺組織凍存于液氮中以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)所需主要試劑

重水(D2O，Sigma公司，151882)，3-trimethylsilyl-2,2,3,3-d4-propionate(TSP，NORELL公司，5715)，甲醇(Buidick & Jackson公司，13CG4H)，氯仿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10006828)，乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，40064160)，重水磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L Na2HPO4和NaH2PO4，含0.5 mmol/L TSP，pH 7.0)。

1.3 試驗(yàn)所需主要儀器

核磁共振波譜儀(Bruker BioSpin公司，AV 500型)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，5804型)，顯微鏡成像提升裝置(煙臺(tái)顯微生物科技有限公司，201620092090.6)，干燥器(Thermo公司，UVS 400A型及SPD111V型)。

1.4 代謝物提取

取菲律賓蛤仔消化腺組織約100 mg于低溫條件下研磨成細(xì)粉，加入甲醇/氯仿/水(體積比為1∶2∶1)溶劑體系對(duì)代謝物進(jìn)行提取，充分渦旋混勻，然后離心(10 min，2800 r/min，4 ℃)，離心后轉(zhuǎn)移上層水相至新的1.5 mL離心管中，放入干燥器中充分干燥后以備核磁檢測(cè)。

1.5 核磁共振波譜儀檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析及譜圖解析

將干燥的樣品粉末加入600 μL 100 mmol/L的重水磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)，充分混勻溶解后離心(5 min，2800 r/min，4 ℃)，取出上層550 μL液體轉(zhuǎn)移至5 mm核磁檢測(cè)管中進(jìn)行核磁共振波譜儀檢測(cè)。在Bruker AV 500氫核磁共振波譜儀上對(duì)白蛤消化腺樣品進(jìn)行分析，檢測(cè)的具體參數(shù)如下：一維氫譜觀察頻率：500.18 MHz，測(cè)試溫度：298 K，譜寬：6009.6 Hz，混合時(shí)間：0.1 s，弛豫延遲時(shí)間：0.3 s，在弛豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和方式壓制水峰。累加次數(shù)：128次，每個(gè)樣本核磁掃描均收集到16384個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅里葉變換，獲得氫核磁共振譜圖載入TopSpin 軟件(version 2.1，Bruker BioSpin，Canada)，對(duì)所有的氫核磁共振譜圖進(jìn)行相位校正、基線調(diào)整，并以TSP內(nèi)標(biāo)為化學(xué)位移參考峰(TSP=0.0 ppm)。利用Matlab ProMetab軟件(ver 7.0；MathsWorks，Natick，MA，USA)，將δ 0.2～10.0內(nèi)的譜圖以0.005譜寬進(jìn)行分段并積分，去除水峰所在的化學(xué)位移區(qū)域(4.72～4.96)。歸一化剩余總的譜峰面積以便比較譜峰之間的強(qiáng)度差異。為了增加低強(qiáng)度峰的權(quán)重，在多元統(tǒng)計(jì)分析之前，先將所有的核磁譜進(jìn)行對(duì)數(shù)化處理，進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換(轉(zhuǎn)換因子，λ=6.36×108)。通過(guò)Chenomx Suite軟件(評(píng)估版,Chenomx公司，加拿大)分析代謝物的化學(xué)位移，來(lái)完成主要代謝產(chǎn)物的鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 菲律賓蛤仔代謝圖譜解析

菲律賓蛤仔消化腺代謝物核磁共振一維氫譜見(jiàn)圖1。由圖1可知，共得到32種代謝物。

圖1 正常對(duì)照組、鰻弧菌感染組、燦爛弧菌感染組菲律賓蛤仔消化腺代謝物核磁共振一維氫譜圖

a.正常對(duì)照組圖譜；b. 鰻弧菌感染后圖譜；c. 燦爛弧菌感染后圖譜；解析的代謝物分別為：1. 亮氨酸，2. 異亮氨酸，3. 纈氨酸，4. 未知代謝物(1.12×10-6)，5. 蘇氨酸，6. 丙氨酸，7. 精氨酸，8. 谷氨酸，9. 谷氨酰胺，10. 乙酰乙酸，11. 琥珀酸，12. β-丙氨酸，13. 亞牛磺酸，14. 天冬氨酸，15. 二甲基甘氨酸，16. 賴氨酸，17. 丙二酸，18. 膽堿，19. 磷酸膽堿，20. ?；撬?，21. 甘氨酸，22. 甜菜堿，23. 龍蝦肌堿，24. α-葡萄糖，25. β-葡萄糖，26. 糖原，27. 未知代謝物(5.98×10-6)，28. ATP，29. 延胡索酸，30. 絡(luò)氨酸，31. 組氨酸，32. 苯丙氨酸.

2.2 鰻弧菌和燦爛弧菌刺激后菲律賓蛤仔代謝物變化情況

菲律賓蛤仔感染兩種弧菌后，代謝物變化不同，鰻弧菌脅迫組有11個(gè)代謝物發(fā)生變化，而燦爛弧菌脅迫組有8個(gè)代謝物發(fā)生變化，有3個(gè)代謝物葡萄糖、谷氨酸、蘇氨酸在兩種菌脅迫后都發(fā)生了變化(圖2)。

圖2 菲律賓蛤仔受到鰻弧菌和燦爛弧菌感染后代謝物變化情況

2.3 鰻弧菌刺激后菲律賓蛤仔消化腺代謝途徑變化

菲律賓蛤仔感染鰻弧菌后，代謝圖譜變化見(jiàn)圖3。由圖3可知，降低的代謝物只有?；撬?，升高的代謝物包括精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸。

2.4 燦爛弧菌刺激后菲律賓蛤仔消化腺代謝途徑變化

菲律賓蛤仔感染燦爛弧菌后，代謝圖譜變化見(jiàn)圖4。由圖4可知，升高的代謝物只有甜菜堿，降低的代謝物包括二甲基甘氨酸、甘氨酸、葡萄糖、膽堿、蘇氨酸、谷氨酸、亞?；撬?。

圖3 鰻弧菌刺激后菲律賓蛤仔消化腺代謝圖譜變化

圖4 燦爛弧菌刺激后菲律賓蛤仔消化腺代謝圖譜變化

3 討 論

從正常對(duì)照組、鰻弧菌感染組、燦爛弧菌感染組菲律賓蛤仔消化腺代謝物核磁共振一維氫譜圖解析的代謝圖譜可以看出，甜菜堿豐度最高(圖1)，甜菜堿廣泛存在與動(dòng)植物中，主要在滲透調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用[23]，這與菲律賓蛤仔生活在高鹽環(huán)境中需要進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)相符合。

在菲律賓蛤仔受到鰻弧菌和燦爛弧菌感染后，代謝物葡萄糖、蘇氨酸、谷氨酸在兩種菌刺激后均發(fā)生變化。通常貝類通過(guò)體內(nèi)氨基酸含量的改變來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透性，氨基酸及糖原直接參與體內(nèi)的能量代謝過(guò)程[24]，葡萄糖的改變證明弧菌可引起菲律賓蛤仔能量代謝發(fā)生變化。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸的改變推測(cè)弧菌可引起貝類神經(jīng)系統(tǒng)毒性。蘇氨酸直接參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，并且具有一定的免疫作用[25]。綜上所述，兩種弧菌刺激后共同發(fā)生的代謝變化包括能量代謝、谷氨酸代謝及蛋白質(zhì)合成等。

鰻弧菌和燦爛弧菌均屬于革蘭氏陰性致病菌，尋找他們對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物產(chǎn)生毒性的差異代謝物，對(duì)區(qū)分兩種弧菌的毒性效應(yīng)具有重要的意義，因此筆者構(gòu)建了不同弧菌脅迫后菲律賓蛤仔代謝圖譜。鰻弧菌暴露24 h后，代謝物?；撬峤档?，表明鰻弧菌引起菲律賓蛤仔低滲脅迫。亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸屬于支鏈氨基酸，在免疫反應(yīng)中主要涉及到氨基酸生成蛋白質(zhì)的過(guò)程。精氨酸能提高魚(yú)類抗氧化酶活性，抑制魚(yú)類炎癥反應(yīng)，保護(hù)魚(yú)體在免疫應(yīng)答時(shí)免受自我損傷[26]。這些氨基酸的升高可補(bǔ)充?；撬岬慕档停瑥亩鴮?duì)抗菲律賓蛤仔的低滲脅迫反應(yīng)。苯丙氨酸對(duì)乙酰膽堿酯酶有一定的抑制活性[27]。賴氨酸是具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能完善等作用[28]。苯丙氨酸及賴氨酸升高與神經(jīng)系統(tǒng)作用有關(guān)，鰻弧菌可導(dǎo)致貝類神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。燦爛弧菌暴露24 h后，有關(guān)膽堿合成的代謝途徑發(fā)生改變，主要包括二甲基甘氨酸、甜菜堿和膽堿。亞?；撬釣榕；撬岬那绑w物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與?；撬嵯嗨?，且還原性更強(qiáng)，本身具有強(qiáng)大的抗氧化作用[29]，表明燦爛弧菌可引起菲律賓蛤仔氧化應(yīng)激反應(yīng)。

由此可見(jiàn)，鰻弧菌和燦爛弧菌引起菲律賓蛤仔代謝途徑變化主要包括能量代謝、滲透調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成及氧化應(yīng)激等。表征鰻弧菌感染的代謝物包括?；撬?、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。而表征燦爛弧菌污染的代謝物包括甜菜堿、二甲基甘氨酸、膽堿、谷氨酸、亞?；撬?。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，尤其是“組學(xué)”技術(shù)(包括蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及基因組學(xué))的逐漸興起，在整體的生物學(xué)水平系統(tǒng)闡明貝類在受到弧菌感染下的響應(yīng)特征指日可待。

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MetabolicResponsesofManilaClamRuditapesphilippinarumtoVibrioanguillarumandVibriosplendidusChallenges

LIU Xiaoli, HOU Chengzong, LAI Yongkai, GAO Jun, LI Jie, SHANG Qiushuang, LONG Jing, DENG Xiaoyu, QIU Wenbin, SUN Hushan

( School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China )

In this work, we characterized the metabolic responses induced byVibrioanguillarumandV.splendiduschallenges towards hepatopancreas of Manila clamRuditapesphilippinarumusing nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabolomics. Metabolic responses showed that bothV.anguillarumandV.splendidusinduced disturbances in energy metabolism, osmotic regulation, protein biosynthesis and oxidative stress with different mechanisms. Three metabolites (glucose, glutamate and threonine) were altered in bothV.anguillarumandV.splendidusexposed groups. The metabolic biomarkers inV.anguillarum-treated groups included leucine, isoleucine, valine, arginine, lysine, taurine, tyrosine, and phenylalanine. And the metabolic biomarkers inV.splendidus-treated groups included hypotaurine, dimethylglycine, choline, betaine, and glycine. The findings indicate that metabolomics could be used to elucidate the biological effects of marine pathogens to the clam.

Vibrioanguillarum;Vibriosplendidus;Ruditapesphilippinarum; nuclear magnetic resonance (NMR); metabolites

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.004

2016-02-23；

2016-05-12.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41506190)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J14LE08)；魯東大學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY2014018).

劉小莉(1979—)，女，講師，博士；研究方向：海洋生物學(xué). E-mail:lxlshz2006@163.com.

S917.1

A

1003-1111(2017)02-0143-05