張 菡，戴 偉，石洪玥，陳成勛，王慶奎，邢克智

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)與養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

遲鈍愛(ài)德華氏菌對(duì)雜交東方鲀r(jià)ags基因表達(dá)的影響

張 菡，戴 偉，石洪玥，陳成勛，王慶奎，邢克智

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)與養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)冀研一號(hào)(菊黃東方鲀 ♀×紅鰭東方鲀♂)稚魚(yú)肝胰臟、脾臟、頭腎中重組激活基因rags在腹腔注射遲鈍愛(ài)德華氏菌后6、12、24、36、48、72 h內(nèi)相對(duì)表達(dá)量的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，感染遲鈍愛(ài)德華氏菌后，肝胰臟中rags基因表達(dá)呈下降趨勢(shì)，相對(duì)表達(dá)量峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h。脾臟和頭腎中rags基因表達(dá)均呈先升后降趨勢(shì)，但在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升。脾臟中，rags基因相對(duì)表達(dá)量峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h；頭腎中，rag1基因和rag2基因相對(duì)表達(dá)量峰值分別出現(xiàn)在攻毒后48 h和6 h。與對(duì)照組相比，腹腔注射遲鈍愛(ài)德華氏菌能引起冀研一號(hào)東方鲀r(jià)ags基因表達(dá)上調(diào)，且rag1基因和rag2基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

冀研一號(hào)東方鲀；重組激活基因；mRNA表達(dá)；遲鈍愛(ài)德華氏菌

冀研一號(hào)東方鲀是雌性菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)與雄性紅鰭東方鲀(T.rubripes)雜交子代。其幼魚(yú)尾鰭呈淺黃且略帶黑色，體表色斑花紋與菊黃東方鲀相近，形態(tài)特征與紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀存在明顯差異[1]。其食用口感與菊黃東方鲀相似，市場(chǎng)價(jià)值高于紅鰭東方鲀，但其生長(zhǎng)速度快于菊黃東方鲀，接近于紅鰭東方鲀，存活率比親本高，一般約90%[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在抗逆性方面，冀研一號(hào)東方鲀對(duì)重金屬離子、水溫和鹽度波動(dòng)具有較強(qiáng)的抗性[1，4-6]。Hansen等[7]首次克隆和分析虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的 rag1和 rag2。斑馬魚(yú)(Daniorerio)[8]、河鲀(Fugurubripes)[9]、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[10]等rags基因研究也相繼被報(bào)道，國(guó)內(nèi)則針對(duì)斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)[11]、赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelusakaara)[12]、紅笛鯛(Lutjanussanguineus)[13]等進(jìn)行了研究。目前，rags在人和小鼠體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控已被深入研究報(bào)道，但未見(jiàn)有關(guān)冀研一號(hào)東方鲀的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)冀研一號(hào)東方鲀注射遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)，分析重組激活基因在攻毒不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量變化規(guī)律，旨在為東方鲀的免疫應(yīng)答提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

試驗(yàn)用魚(yú)健康狀況良好、體表完整，體長(zhǎng)(5.2±0.39) cm，由天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為對(duì)照組(注射磷酸緩沖鹽溶液pH 7.2，0.1 mol/L)和攻毒組(注射遲鈍愛(ài)德華氏菌，1×106cfu/mL)，每組3個(gè)平行，共120尾。對(duì)照組每尾魚(yú)腹腔注射50 μL無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液，而感染組注射等體積遲鈍愛(ài)德華氏菌菌液。將遲鈍愛(ài)德華氏菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取200 μL培養(yǎng)液以涂布法在固體平板上培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)24 h，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液洗脫，計(jì)數(shù)，備用。注射開(kāi)始前，采3尾普通試驗(yàn)魚(yú)作為基礎(chǔ)組織樣本，注射6、12、24、36、48、72 h后取樣，每次每組取3尾，無(wú)菌條件下取出肝胰臟、脾臟和頭腎，分別置1.5 mL無(wú)RNA酶凍存管液氮保存，用于提取RNA。

1.2.2 總 RNA 提取及 cDNA第一條鏈合成

應(yīng)用Rnaiso Plus試劑(Takara工程大連有限公司)提取不同組織(肝胰臟、脾臟、頭腎)中的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，應(yīng)用分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf)測(cè)量OD260nm/OD280nm值，將比值為1.7～2.1的RNA應(yīng)用PrimeScript RTase(Takara工程大連有限公司)合成cDNA第一條鏈。

1.2.3 rags 基因 mRNA 表達(dá)的定量分析

根據(jù)GenBank:EU871643.1和GenBank: AF108420.1中東方鲀?chǔ)?actin、rag1、rag2基因保守序列設(shè)計(jì)引物(表1)，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括6.4 μL ddH2O、0.8 μL正向引物、0.8 μL反向引物、2 μL模板和10 μL SYBRDE。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；3步法循環(huán)40次(95 ℃變性15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s)。基因結(jié)果采用相對(duì)表達(dá)量的形式，以2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表 1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)攻毒組和對(duì)照組rags基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，對(duì)攻毒組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)rags基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

感染遲鈍愛(ài)德華氏菌后冀研一號(hào)東方鲀肝胰臟組織rags基因相對(duì)表達(dá)量變化見(jiàn)圖1。感染菌體后rags基因相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h；與對(duì)照組相比，攻毒后6、12、24 h rag1基因表達(dá)極顯著升高(P<0.01)；攻毒后24 h，rag2基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，攻毒后 6、12 h時(shí)，rag2基因表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

感染遲鈍愛(ài)德華氏菌后冀研一號(hào)東方鲀脾臟組織rags基因相對(duì)表達(dá)量變化見(jiàn)圖2。隨菌體感染時(shí)間延長(zhǎng)，rags基因相對(duì)表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì)，并在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升，其相對(duì)表達(dá)量峰值出現(xiàn)在攻毒后6 h；在6 h時(shí)rag1基因相對(duì)表達(dá)量與其他各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，第6、12、48 h時(shí)與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；與對(duì)照組相比，感染菌體后rag2基因相對(duì)表達(dá)量在第6、12、24、48 h極顯著升高(P<0.01)。

感染遲鈍愛(ài)德華氏菌后冀研一號(hào)東方鲀頭腎組織rags基因相對(duì)表達(dá)量變化見(jiàn)圖3。菌體感染時(shí)間延長(zhǎng)，rags基因相對(duì)表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì)，并在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升；rag1基因相對(duì)表達(dá)量在攻毒后48 h達(dá)到最大值，顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；rag2基因相對(duì)表達(dá)量在攻毒后6 h達(dá)到最大值，與其他各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

圖1 肝胰臟組織不同時(shí)刻rag1和rag2基因相對(duì)表達(dá)量**表示攻毒組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；*表示攻毒組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05).不同字母表示攻毒組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異顯著.下同.

圖2 脾臟組織不同時(shí)刻rag1和 rag2基因相對(duì)表達(dá)量

圖3 頭腎組織不同時(shí)刻rag1和rag2基因相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

3.1 rags基因在魚(yú)體不同組織中的表達(dá)

李幸等[14]以實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)rag1基因在太平洋鱈(Gadusmacrocephalus)胸腺、頭腎、脾臟和肝臟的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)rag1基因僅在胸腺和頭腎兩種組織中表達(dá)。Mao等[12]采用同樣方法檢測(cè)rag1基因在赤點(diǎn)石斑魚(yú)的肝、頭腎、脾、胸腺、腦、肌肉、腸、心臟、鰓和性腺中表達(dá)情況，rag1基因轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在胸腺和頭腎組織中。但紅笛鯛經(jīng)滅活溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)免疫后，rag1基因在頭腎、胸腺、脾臟、肝臟、腸和腦組織中均有表達(dá)[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rags基因不僅可在頭腎中表達(dá)，同時(shí)還在脾臟和肝胰臟中檢測(cè)到其表達(dá)，與紅笛鯛報(bào)道的結(jié)果相一致。是因?yàn)槊庖咴碳ぃ瑢?dǎo)致rags基因在魚(yú)體不同組織中產(chǎn)生差異表達(dá)。

3.2 rag1基因和rag2基因表達(dá)的協(xié)同性

rag1 和 rag2基因是重組激活基因由于序列差異而區(qū)分的。結(jié)構(gòu)上，在鯉科和鲀科中rag1基因含有兩個(gè)內(nèi)含子，而斑點(diǎn)叉尾和虹鱒中rag1基因只有一個(gè)內(nèi)含子，其他物種中rag1和rag2基因一樣，不含內(nèi)含子。目前，已有研究提出rag1基因和rag2基因能夠同步表達(dá)，并且二者功能上存在協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)冀研一號(hào)東方鲀肝胰腺、脾臟和頭腎中rag1和rag2基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致。在滅活菌感染紅笛鯛不同組織中rag1和rag2基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)也基本保持一致[13]。而Kapitonov等[15]提出rag1和rag2基因編碼得到的蛋白是通過(guò)相同的轉(zhuǎn)座子完成的。

3.3 細(xì)菌攻毒對(duì)rags基因表達(dá)量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，冀研一號(hào)東方鲀注射遲鈍愛(ài)德華氏菌后，肝胰臟中rags基因表達(dá)呈下降趨勢(shì)，有可能是因?yàn)榧?xì)菌感染后導(dǎo)致v(d)j重組發(fā)生錯(cuò)誤[16-18]。頭腎中rags基因表達(dá)均呈先升后降的趨勢(shì)，但在攻毒后48 h出現(xiàn)反彈回升。這與頭腎所含的淋巴細(xì)胞密切相關(guān)[19]。Zhang等[13]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)滅活溶藻弧菌免疫后紅笛鯛不同時(shí)間點(diǎn)rags基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在0～24 h，肝胰臟、脾臟和頭腎中rag1和rag2 mRNA 的表達(dá)量均下調(diào)至最低值，24～96 h，均呈先升后降且趨于平緩的趨勢(shì)。紅笛鯛和冀研一號(hào)東方鲀二者對(duì)細(xì)菌攻毒后的表達(dá)存在差異，分析原因可能在于以下兩點(diǎn)，其一可能是因?yàn)樵囼?yàn)魚(yú)不同，其二可能是因活菌與滅活菌的差異導(dǎo)致，活菌對(duì)機(jī)體的免疫刺激更為強(qiáng)烈，時(shí)間持續(xù)更長(zhǎng)[20]。

綜上所述，腹腔注射遲鈍愛(ài)德華氏菌能引起冀研一號(hào)東方鲀r(jià)ags基因表達(dá)上調(diào)，且rag1基因和rag2基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致。rags基因作為特異性免疫系統(tǒng)的重要成員，在冀研一號(hào)東方鲀特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

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EffectsofEdwardsiellatardaInjectiononmRNAExpressionsofRecombinationActivatingGenesragsinJiyan-1Fugu

ZHANG Han, DAI Wei, SHI Hongyue, CHEN Chengxun, WANG Qingkui, XING Kezhi

( Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, Fisheries College, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China )

In this study, Jiyan-1 fuguTakifuguflavidus♀×T.rubripes♂ juveniles were injected withEdwardsiellatardafor different times (6, 12, 24, 36, 48, and 72 h), and mRNA expressions of recombination activating genes rags in liver, spleen and kidney were investigated using quantitative real-time PCR technology. The results showed that mRNA expressions of rags in liver was decreased with time, and reached the peak values 6 h after injection. The mRNA expression of rags in spleen and kidney were increased first and then decreased with a rebound in 48 h. The peak values of rags mRNA expressions in spleen were observed 6 h after injection, and rag1 and rag2 mRNA expressions in kidney reached the peak values in 48 h and 6 h, respectively. As compared to the control group,E.tardainjection upregulated mRNA expressions ofrags, and both rag1 and rag2 mRNA expressions were changed in the same trend.

Jiyan-1 fugu; recombination activating gene; mRNA expression;Edwardsiellatarda

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.018

2016-05-03；

2016-06-12.

國(guó)家星火計(jì)劃重大項(xiàng)目(2013GA610002)；天津市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目(TD12-5018)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(13JCZDJC29200)；天津市科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(12ZCDZNC05900).

張菡(1990—)，女，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物增養(yǎng)殖學(xué). E-mail：13820487312@163.com.通訊作者：邢克智(1956—)，男，教授，研究方向：水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖. E-mail：kzxing6668@126.com.

S942.5

A

1003-1111(2017)02-0216-04