呂晴霽，潘忠超,，石和榮，楊慧榮，王樹啟，趙會宏

( 1.華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642; 2．汕頭大學 廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東 汕頭 515063; 3．廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東 廣州510630 )

斜帶石斑魚生長激素基因重組蛋白的發(fā)酵

呂晴霽1，潘忠超1,3，石和榮3，楊慧榮1，王樹啟2，趙會宏1

( 1.華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642; 2．汕頭大學 廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東 汕頭 515063; 3．廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東 廣州510630 )

將含有石斑魚生長激素基因的畢赤酵母X33進行震蕩培養(yǎng)后，裝入≥50 L的自控罐中，28～30.5 ℃、pH 5.5～6.0、溶解氧≥30 mg/L條件下發(fā)酵84 h，生產(chǎn)石斑魚生長激素基因重組蛋白。發(fā)酵期間，通過甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母獲得目的蛋白的高效表達，最后通過Western Blot和SDS-PAGE聚丙酰胺凝膠電泳對目的蛋白進行定性定量檢測。最終獲得目的蛋白表達量約為1.5～2.0 g/L，約占胞外可溶性總蛋白的16.4%。本試驗用自控罐發(fā)酵生產(chǎn)含有斜帶石斑魚生長激素基因重組蛋白的畢赤酵母生產(chǎn)工藝，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)魚類生長激素餌料添加劑奠定基礎(chǔ)。

斜帶石斑魚；生長激素基因重組蛋白；畢赤酵母；發(fā)酵

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)是我國南部沿海地區(qū)以及東南亞地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚類。硬骨魚類生長激素是垂體細胞分泌的一種多功能激素，參與代謝、生長、發(fā)育、繁殖和滲透壓調(diào)節(jié)等生理過程，可以增加魚食欲，提高飼料轉(zhuǎn)化率。研究發(fā)現(xiàn)，外源生長激素給入魚體后能明顯促進魚類的生長[1-5]。但是，天然的生長激素難以獲得，且分離純化成本高，不適合在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用。重組的生長激素具有天然生長激素的生物活性，利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)魚類生長激素能夠解決外源激素的來源問題，為魚類養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展開辟新途徑。

20世紀30年代以來，已克隆了40多種魚類的生長激素基因及其DNA，魚類生長激素基因工程研究取得了一系列重要進展。在原核表達方面，Sekine等[6]從腦垂體的cDNA文庫中克隆得到了大麻哈魚(Oncorhynchusketa)生長激素的cDNA，并在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達。Fine等[7]在大腸桿菌中表達了鯉魚(Cyprinuscarpio)的生長激素，發(fā)現(xiàn)在表達過程中形成了包含體。Ben-Atia等[8]在大腸桿菌中表達了金鯛(Sparusaurata)的生長激素，通過口服和腹腔注射的方式處理金鯛，均能顯著地促進金鯛的生長。露斯塔野鯪(Labeorohita)[9]，點斑藍子魚(Siganusguttatus)[10]的生長激素都在大腸桿菌中得到有效的表達。Zang等[3]用集胞藻(Synechocystissp.) PCC6803作為宿主，成功表達了褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的生長激素。真核表達系統(tǒng)與原核表達系統(tǒng)比較，具有很大的優(yōu)越性，例如能對蛋白進行糖基化，磷酸化的翻譯后修飾，正確形成二硫鍵，幫助蛋白折疊成正確的構(gòu)象，進行高密度發(fā)酵(酵母細胞)等。Piyaviriyakul等[11]將鲇魚(Silurusasotus)生長激素在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)胞內(nèi)重組表達。Acosta等[2]在畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達了紅羅非魚(Oreochromisaureus×O.niloticus)和鯉魚的生長激素，并發(fā)現(xiàn)生長激素在酵母中重組表達時C-端缺失46個氨基酸殘基同樣具有生物學活性，其培養(yǎng)液中的上清液不僅能促生長，還能有效提高羅非魚的非特異性免疫功能。近些年，美國FDA認為畢赤酵母為安全微生物，為其在食品和醫(yī)藥上的應(yīng)用鋪平了道路[12]。

本文通過振蕩和自控罐發(fā)酵含有斜帶石斑魚生長激素基因重組蛋白的酵母，獲得高效發(fā)酵的條件，以期為指導(dǎo)生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

含斜帶石斑魚生長激素基因的畢赤酵母工程菌，由中山大學水生經(jīng)濟動物研究所構(gòu)建，本實驗室保存。

1.1.2 試劑及儀器

Peptone，Yeast Extract(Oxioid LTR.有限公司)；Zeocin[Invitrogen(USA)公司]；預(yù)染蛋白Marker[MBI Fermentas(USA)公司]；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(北京百泰克公司產(chǎn)品)；TEMED和AP[Bio-Rad(USA)公司]，2×SDS-PAGE Loading Buffer[威佳科技(廣州)有限公司產(chǎn)品]；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

INFORSAGCH-4103控溫搖床，Thermo Forma超凈臺，BECKMAN Avanti J-30I離心機，TOMYSS-325滅菌鍋，50 L自動控制發(fā)酵罐(中國臺灣Biotop Process & Equipment公司的BTF-B型號)。

1.1.3 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

液體(g/L)：酵母粉10，蛋白胨10，葡萄糖20；固體(g/L)：酵母粉10，蛋白胨10，葡萄糖20，瓊脂粉15。

1.1.4 改良基本鹽培養(yǎng)基

成分(按1 L計，百分比為各成分占發(fā)酵培養(yǎng)基總量的質(zhì)量百分比)：硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，七水硫酸鎂0.4%，硫酸鉀0.4%，二水氯化鈣0.02%，消泡劑0.03%，甘油2%。高壓后每升加4.35 mL微量元素(PTM1)。

1.1.5 營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基

成分(按1 L計，百分比為各成分占發(fā)酵培養(yǎng)基總量的質(zhì)量百分比)：硫酸銨10%，磷酸二氫鉀10%，七水硫酸鎂7%。高壓滅菌。

1.1.6 PTM1

成分：五水硫酸銅6.0 g/L，碘化鈉0.08 g/L，一水硫酸錳3.0 g/L，二水鉬酸鈉0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，氯化鈷0.5 g/L，氯化鋅20.0 g/L，七水硫酸亞鐵65.0 g/L，硫酸5.0 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種的保存與擴大培養(yǎng)

斜帶石斑魚生長激素基因酵母工程菌在酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中(1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖)，于28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)至菌體質(zhì)量濃度為5.5 g/L，加15%滅菌甘油，-70 ℃冷凍保存。還可將冷凍保存的菌種在酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基固體平板上劃線，28 ℃溫箱中培養(yǎng)3 d后于4 ℃冰箱中保存3個月。

挑取酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基固體平板上的酵母工程菌單個菌落于酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至菌體濕質(zhì)量為5.5 g/L，用作振蕩發(fā)酵及自控罐發(fā)酵的種子。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

將2%種子液接種于酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)液中，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至菌體質(zhì)量濃度為5.5 g/L。然后每隔24 h向振蕩瓶中加入0.5%的甲醇，28 ℃，180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)3 d，離心取上清液。

1.2.3 自控罐發(fā)酵

檢查自控罐及其相關(guān)設(shè)備，確保自控罐安全正常工作；然后加入25 L發(fā)酵改良培養(yǎng)基，滅菌；滅菌后待培養(yǎng)基冷卻到接種溫度后，接入種子液1.5 L，設(shè)置發(fā)酵溫度30 ℃，pH 6.0，溶解氧35%，轉(zhuǎn)速200 r/min，開始發(fā)酵。在發(fā)酵過程中適時補加營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基、發(fā)酵微量元素、甘油，開始誘導(dǎo)時加入甲醇。發(fā)酵過程中每隔一段時間記錄日期、時間、pH、溶解氧、溫度、菌種濕質(zhì)量及保種、補料情況，并取樣品，保存于4 ℃冰柜中。

1.2.4 濕質(zhì)量檢測與測定

取大小相同的4個1.5 mL的離心管，稱量質(zhì)量，然后再取發(fā)酵液各1 mL，13 000 r/min，離心5 min，棄上清液，稱量沉淀，減去初始質(zhì)量，取平均值，即為當前時段酵母發(fā)酵的濕質(zhì)量。

用二喹啉甲酸蛋白含量試劑盒測定總蛋白含量。用三氯乙酸法沉淀上清蛋白。用蛋白質(zhì)印跡法鑒定目的蛋白。

1.2.5 SDS-PAGE電泳

將酵母表達上清加電泳緩沖液后跑12%SDS-PAGE蛋白電泳，低分子量標準蛋白作Maker。染色、脫色后，拍照，然后用Quantity-one軟件分析蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 自控罐發(fā)酵

2.1.1 發(fā)酵誘導(dǎo)前后發(fā)酵液溫度和pH變化

發(fā)酵試驗結(jié)束后，發(fā)酵過程中的溫度和pH變化見圖1。由圖1可知，14 h是誘導(dǎo)時間點，甲醇誘導(dǎo)之前，最高溫度為30.2 ℃，最低為29.4 ℃，最大pH為6.08，最小為5.88；誘導(dǎo)后直到76 h放罐，最高溫度為30.9 ℃，最低為29.1 ℃，最大pH為6.68，最小為5.74。這說明在誘導(dǎo)前后溫度及pH變化結(jié)果不大，且溫度29.1～30.9 ℃，pH 5.74～6.68，有利于發(fā)酵正常進行。

圖1 誘導(dǎo)前后發(fā)酵液溫度和pH的變化

2.1.2 誘導(dǎo)前后發(fā)酵液溶解氧的變化

誘導(dǎo)前后溶解氧的波動較大，誘導(dǎo)之前溶解氧最大值為92.1 mg/L，最小值為63.2 mg/L；誘導(dǎo)之后溶解氧開始上升，最大值123.6 mg/L，然后逐漸降低，呈S型曲線變化，32 h時降至最低值20.75 mg/L，其余均在27 mg/L以上。這說明前期溶解氧越高越好，到后期菌種變多，溶解氧最好控制在27 mg/L以上，這樣能獲得更多的目的蛋白，保持菌種的正常生長(圖2)。

圖2 誘導(dǎo)前后溶解氧的變化

2.1.3 誘導(dǎo)前后菌體濕質(zhì)量的變化

發(fā)酵期間每隔2 h收集菌液，測菌體濕質(zhì)量，直至發(fā)酵結(jié)束。整個過程菌體濕質(zhì)量變化見圖3。由圖3可知，整個發(fā)酵過程濕質(zhì)量一直升高，14 h達15 g，此時開始誘導(dǎo)，直到最后72 h時達最大值59.75 g，接著開始呈下降趨勢，于76 h時放罐。這與微生物的生長曲線一致，先是調(diào)整期，接著為快速生長期，最后為穩(wěn)定期，當開始下降時，說明菌體開始衰老，為節(jié)省成本和獲得最大的目的蛋白，應(yīng)及時放罐。

圖3 誘導(dǎo)前后菌體濕質(zhì)量的變化

2.2 重組蛋白的Western Blot鑒定

發(fā)酵后上清液的SDS-PAGE電泳見圖4。對黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)生長激素特異性抗體的Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)有陽性條帶，其大小與SDS-PAGE中的特異性條帶相符合，而陰性對照無此條帶(圖5)，表明在檢測的發(fā)酵上清液中均表達了斜帶石斑魚的重組生長激素，具有免疫活性。

圖4 發(fā)酵后上清液的SDS-PAGE電泳

1：Marker；2、3：空載酵母發(fā)酵上清液；4、5：放罐時的上清液； 6、7：誘導(dǎo)前的發(fā)酵上清液.

圖5 甲醇誘導(dǎo)表達24 h后上清總蛋白Western Blot 分析

M：蛋白分子量標準；N：空載pPICZαA陰性對照；1：誘導(dǎo)12 h的上清蛋白；2：誘導(dǎo)24 h的上清蛋白.

2.3 蛋白質(zhì)量濃度的測定以及目的蛋白表達量的估算

采用二喹啉甲酸比色法，測定標準蛋白的吸光度A562，用Excel軟件以標準牛血清蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標，各質(zhì)量濃度標準牛血清蛋白在562 nm波長的吸收值為縱坐標繪制標準曲線(圖6)。由圖6可知，蛋白質(zhì)量濃度與吸光度A562呈線性關(guān)系，說明此標準曲線可信。將蛋白樣品稀釋10倍和100倍進行反應(yīng)，根據(jù)軟件生成的方程計算出樣品蛋白的蛋白質(zhì)量濃度。根據(jù)軟件GeneTools from SynGene (Bio-Rad，USA)分析SDS-PAGE 圖譜的結(jié)果和蛋白定量的結(jié)果，估算出重組生長激素約占胞內(nèi)總蛋白的16.4%，表達量約為1.5～2.0 g/L。

圖6 二喹啉甲酸比色法測定蛋白質(zhì)量濃度的標準曲線

2.4 發(fā)酵上清液目的蛋白表達量隨時間的變化

發(fā)酵過程中每隔2 h取一次上清液，放于冰箱-20 ℃保存，最后選取部分上清液進行SDS-PAGE電泳(圖7)。由圖7可知，隨著時間的變化，上清液中的目的蛋白含量越來越高，說明菌體正常生長，表達正常。

圖7 發(fā)酵上清液目的蛋白表達量隨時間的變化

Mark: 5 μL加樣量，質(zhì)量濃度為0.1～0.2 μg/μL；1～9: 10 μL樣品，14、18、22、26、30、34、38、42、46 h時上清目的蛋白表達.

3 討 論

3.1 培養(yǎng)基的選擇對發(fā)酵的影響

基因工程菌的生長要選擇合適且廉價的培養(yǎng)基配方，使菌體的生長、蛋白表達量和生產(chǎn)成本最優(yōu)化[13]。畢赤酵母含醇氧化酶基因啟動子具明顯的調(diào)控功能，可用于調(diào)控外源基因的表達[14]。甲醇作為誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)畢赤酵母產(chǎn)生外源蛋白[15]。本試驗在振蕩培養(yǎng)中選用適合畢赤酵母發(fā)酵的酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基進行復(fù)壯、保種等工序，而在50 L自控罐中選用以硫酸銨、磷酸二氫鉀等化合物質(zhì)組成的成本相對較低的改良培養(yǎng)基進行放大培養(yǎng)，以期獲得優(yōu)質(zhì)且廉價的適合畢赤酵母基因工程菌生長及表達的工業(yè)用培養(yǎng)基。

3.2 pH以及發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

畢赤酵母在pH 3.0～7.0的范圍內(nèi)均可生長， pH低于2.2時則停止生長， pH恒定在5.0時表達量最高[16]。劉彥麗等[17]研究了高密度培養(yǎng)的畢赤酵母基因工程菌對重組人血清白蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境不利于蛋白表達，誘導(dǎo)過程中pH 6.0～6.5最佳。章如安等[18]認為，用兩步法來誘導(dǎo)外源蛋白的表達，誘導(dǎo)時的起始pH可能是畢赤酵母高效表達重組蛋白的關(guān)鍵之一，改變誘導(dǎo)時的pH，可使表達量提高50%以上。

在高密度發(fā)酵過程中，防止蛋白水解酶的水解、提高外源蛋白的穩(wěn)定性、減少外源蛋白的降解，實際上也是一種提高外源蛋白產(chǎn)量的措施和手段[19]。有時，為減少培養(yǎng)基中蛋白酶的作用，改善外源蛋白的穩(wěn)定性，pH控制在5.5左右[20]。不同重組蛋白類目標蛋白也具有不同的最佳穩(wěn)定pH范圍[21]。本試驗中pH控制在5.5～6.5，基本符合酵母生長的酸性環(huán)境。

溫度升高酵母易衰老，發(fā)酵周期縮短，酶失活加快，影響外源蛋白的表達[22]。本試驗的溫度控制范圍為28～30.5 ℃，是酵母生長、目的蛋白表達的最佳溫度范圍。

3.3 甲醇體積分數(shù)對發(fā)酵效果的影響

甲醇體積分數(shù)大于3.65%時菌體的發(fā)酵受抑制[5]。過高體積分數(shù)的甲醇抑制細胞的生長和產(chǎn)物的表達，控制甲醇的流加是提高外源蛋白表達量的關(guān)鍵[21]。本試驗補加甲醇時采用過渡流加的方式，即逐漸降低甘油補加速率而逐漸提高甲醇補加速率，并非等到甘油耗盡后并讓菌體饑餓一段時間再補加。該方法使細胞逐漸適應(yīng)甲醇的加入，不會抑制生長，增加能量的供應(yīng)，增加了生物量外源蛋白的表達。

3.4 最佳發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間是影響外源蛋白表達量的重要因素。本試驗操作總結(jié)所得，最佳發(fā)酵時間為76 h。在發(fā)酵菌液濕質(zhì)量達到15.0 g，穩(wěn)定后開始加入甲醇誘導(dǎo)。發(fā)酵至14 h時，發(fā)酵菌液濕質(zhì)量達到15.5 g，適合作為誘導(dǎo)起點；誘導(dǎo)后發(fā)酵菌液濕質(zhì)量在12 h內(nèi)維持在20.0 g～21.25 g，之后開始穩(wěn)定上升。發(fā)酵至72 h時，發(fā)酵菌液濕質(zhì)量達到59.75 g，之后2 h及4 h后測得濕質(zhì)量分別是59.5 g及59.0 g。濕質(zhì)量穩(wěn)定在59.0 g～59.75 g，因此判斷發(fā)酵到達終點總發(fā)酵時間為76 h。

4 結(jié) 論

本試驗利用已構(gòu)建的含有斜帶石斑魚生長激素表達載體的畢赤酵母X33發(fā)酵生產(chǎn)石斑魚生長激素蛋白，確定了工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵此類蛋白的生產(chǎn)工藝，基本參數(shù)為溫度28～30 ℃，pH 5.5～6.0，發(fā)酵時間76 h。利用此工藝可實現(xiàn)石斑魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用石斑魚生長激素重組基因蛋白(多肽)產(chǎn)品，促進石斑魚的健康生長。整合了外源生長激素基因的酵母菌是綠色、安全、高效的新型微生物制劑，更適合于經(jīng)濟型和環(huán)保型水產(chǎn)養(yǎng)殖[22]。開發(fā)新型微生物制劑有利于生產(chǎn)更多更好的優(yōu)質(zhì)蛋白，保障國家食物安全，促進生態(tài)系統(tǒng)水平的水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展，提升我國漁業(yè)科技進步[23]。

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FermentationofRecombinantProteinofGrowthHormoneGeneinOrange-spottedGrouper

Lü Qingji1，PAN Zhongchao1,3，SHI Herong3，YANG Huirong1，WANG Shuqi2，ZHAO Huihong1

( 1．Animal Science College，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China; 2．Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology，Shantou 515063，China; 3．Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary，Guangzhou 510630，China )

Yeast X33Pichiapastoriswere applied to express recombinant of growth hormone in orange-spotted grouperEpinepheluscoioidescultivated in shaking flask first, and than fermented in 50 liters or bigger auto-control fermentator under conditions of temperature from 28 ℃ to 30.5 ℃,and pH 5.5—6.0 for 76 hours. During the fermentation period, the Yeast X33 were induced to express high amount protein by methanol, and the targets were detected qualitatively and quantitatively by Western Blot and SDS-PAGE. The concentration of target protein was found to be changed from 1.5 g/L to 2.0 g/L, accounting for 16.4% of total soluble protein in vitro. The fementation technology which producted recombinant orange-spotted grouper growth hormone in yeast X33P.pastorisby an automatic control fermentor lays the foundation of industrial production of fish growth hormone feed additives.

Epinepheluscoioides; recombinant growth hormone;Pichiapastoris; fermentation

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.015

S965.334

A

1003-1111(2017)01-0088-06

2016-03-01；

2016-05-11.

廣東省科技計劃項目(2015A020208002)；廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室開放基金資助項目(GPKLMB201301)；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(A201501A03，A201501A09，A201501A10).

呂晴霽(1993-)，女，碩士研究生；研究方向：魚類生理學．E-mail:18819169270@163.com．通訊作者：趙會宏(1975-)，男，副教授，博士；研究方向：魚類生理學．E-mail：zhaohh@scau.edu.cn.