陳言峰,卓孝磊,王 超,鄭宗正,付 強

( 1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231； 2. 清遠市北江水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣東 清遠 511510； 3. 清遠市水生動物防疫檢驗站，廣東 清遠 511510 )

鯪魚致病性遲鈍愛德華氏菌的鑒定及藥敏分析

陳言峰1,卓孝磊2,王 超3,鄭宗正1,付 強1

( 1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231； 2. 清遠市北江水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣東 清遠 511510； 3. 清遠市水生動物防疫檢驗站，廣東 清遠 511510 )

自廣東省清遠市某養(yǎng)殖場患病鯪魚的肝、腎、脾組織分離到兩株優(yōu)勢菌QY15814、QY15815，通過細(xì)菌生化鑒定管與16S rDNA序列分析對這兩株菌進行鑒定，采用紙片擴散法進行藥敏試驗，并測定了這兩株菌對鯪魚的半致死劑量。試驗結(jié)果顯示，這兩株菌為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧，有動力，能利用蔗糖、甘露糖、麥芽糖，硝酸鹽還原、吲哚、MR試驗均為陽性；根據(jù)其生理生化特性，鑒定為遲鈍愛德華氏菌，通過PCR擴增其16S rDNA基因，經(jīng)測序及NCBI比對，結(jié)果與遲鈍愛德華氏菌的同源性高達99%。這兩株致病菌對頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢呋辛等抗生素高度敏感，對鏈霉素、克拉霉素、紅霉素中度敏感，對阿米卡星、復(fù)方新諾明、大觀霉素、克林霉素不敏感。這兩株菌對鯪魚具有較強的致病力，半致死劑量分別為1.93×105cfu/g和9.65×104cfu/g。

鯪魚；遲鈍愛德華氏菌；鑒定；藥物敏感性

鯪魚(Cirrhinusmolitorella)，俗名土鯪、雪鯪、鯪公、花鯪，屬鯉科、野鯪亞科、鯪屬，是我國南方地區(qū)重要的經(jīng)濟魚類[1]。該品種具有食性雜、產(chǎn)量高、飼料來源廣等特點，且肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美[2]，深受廣大消費者喜愛。目前關(guān)于鯪魚的研究主要涉及其生長特性[3]、形態(tài)變異特征[4]、肌肉營養(yǎng)成分[1]、營養(yǎng)需求[5]、生長因子[6]、線粒體基因組序列[7]，群體遺傳結(jié)構(gòu)[8]與遺傳多樣性[9-10]等方面。自然條件下，鯪魚抗病能力較強，但在高密度養(yǎng)殖條件下，一旦養(yǎng)殖水體水質(zhì)惡化，鯪魚患病也時有發(fā)生，已造成了較大的經(jīng)濟損失[11]。長期以來，引發(fā)鯪魚病害的病原主要以各類寄生蟲為主[12-15]，而有關(guān)鯪魚細(xì)菌性疾病的報道并不多，目前僅方蘋等[11]報道過由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)混合感染引發(fā)鯪魚的紅鰓病、劉禮輝等[16]報道過由無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)引發(fā)的鯪魚病害。筆者于2015年8月從廣東省清遠市某養(yǎng)殖場得到部分患病的鯪魚，并對病原菌進行了分離鑒定及藥物敏感性分析，可為鯪魚養(yǎng)殖過程中疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病魚為采自廣東省清遠市某養(yǎng)殖場所養(yǎng)殖的鯪魚。癥狀為體表充血，有部分潰爛的病灶，肛門紅腫，解剖發(fā)現(xiàn)肝、腎腫大，并有血紅色的腹水。健康的鯪魚取自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管購于廣東環(huán)凱微生物有限公司，抗生素紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq聚合酶、dNTP和PCR緩沖液(含Mg2+)購于寶生物工程(大連)有限公司。細(xì)菌16S rDNA引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 病原菌的分離純化

無菌操作從瀕死鯪魚的肝、腎、脾及體表病灶處取樣，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取優(yōu)勢菌落進行純培養(yǎng)，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，加入無菌甘油，置于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的生理生化特征

對已純化的優(yōu)勢菌(QY15814、QY15815)按常規(guī)方法[17]進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。并將細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其菌落的形態(tài)特征。按照細(xì)菌微量生化鑒定管的說明書操作并判定該細(xì)菌各項生化指標(biāo)的結(jié)果。

1.4 半致死劑量的測定

將分離所得的菌株QY15814接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水將其菌落洗下，依次稀釋成密度為1.53×109、1.53×108、1.53×107、1.53×106、1.53×105cfu/mL和1.53×104cfu/mL的菌懸液，并按每尾0.3 mL的劑量，分別將6個密度的菌懸液對6個組(每組10尾，共60尾)的健康鯪魚[(167±19) g]進行腹腔注射，為6個感染組；對照組的10尾鯪魚，每尾注射0.3 mL無菌生理鹽水。連續(xù)觀察15 d。試驗過程中，每日觀察記錄受試魚的發(fā)病癥狀和死亡情況，并對死亡的魚進行細(xì)菌再分離、鑒定，根據(jù)改進的寇氏法[18]計算半致死劑量(LD50)。相同的方法用于QY15815對鯪魚的半致死劑量的測定。

1.5 16S rDNA序列分析

選用細(xì)菌16S rDNA通用引物(正向: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，菌落PCR法直接擴增QY15814和QY15815的16S rDNA。50 μL的PCR反應(yīng)體系包含：新鮮菌液2 μL，上、下游引物(濃度10 mmol/L)各1 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL，10×PCR緩沖液(含Mg2+) 5 μL，Taq聚合酶(5 units/μL) 0.25 μL，ddH2O 36.75 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min 1次；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共進行30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司純化后測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析后，選取相似性高的序列，采用ClustalX 1.83軟件進行多重序列比對分析，并通過Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 抗生素敏感試驗

用滅菌棉簽將QY15814和QY15815的新鮮菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂表面，用無菌鑷子夾取每種抗生素紙片并貼在上面，37 ℃培養(yǎng)48 h后，測量抑菌圈直徑的大小。根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI-M100-S18)[19]，判定該菌對34種抗生素的敏感程度。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌的形態(tài)特征

分離得到的QY15814和QY15815為革蘭氏陰性短桿菌，在營養(yǎng)肉湯里培養(yǎng)時菌液呈均勻渾濁，接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h，形成圓形、凸起、灰白色、有光澤的菌落，直徑1.0～2.0 mm。該菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長，其菌落中央有黑色小點。

2.2 病原菌的生化特征

除QY15814、QY15815蔗糖為陽性、QY15815 L-阿拉伯糖為陽性外，其他指標(biāo)與遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)一致(表1)。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]，鑒定菌株QY15814、QY15815為遲鈍愛德華氏菌。

表1 分離菌的生化特征

注：“+”表示陽性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng).

2.3 半致死劑量的測定

人工感染后，發(fā)病鯪魚的主要癥狀與自然發(fā)病鯪魚的癥狀相似，從感染后瀕死魚的肝、腎等處均能分離到與原致病菌形態(tài)、特征一致的菌株。對照組的魚無發(fā)病癥狀和死亡現(xiàn)象。計算得到菌株QY15814和QY15815對鯪魚的半致死劑量分別為1.93×105cfu/g和9.65×104cfu/g (表2)。

2.4 16S rDNA序列分析及發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序得到的菌株QY15814和QY15815的16S rDNA的序列 (Accession No. KU711814和KU711815)分別在GenBank中進行BLAST分析，顯示與遲鈍愛德華氏菌的同源性均為99%，表明這兩株菌為遲鈍愛德華氏菌。根據(jù)上述序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株QY15814、QY15815與遲鈍愛德華氏菌親源關(guān)系最近(圖1)。

2.5 藥敏試驗

遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢呋辛等抗生素高度敏感，對鏈霉素、克拉霉素、紅霉素中度敏感，對阿米卡星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、麥迪霉素、萬古霉素、大觀霉素、克林霉素與苯唑西林不敏感(表3)。

表2 人工感染試驗結(jié)果

圖1 根據(jù)菌株QY15814和QY15815的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

抗生素每片含量μg抑菌圈直徑/mmQY15814QY15815敏感性阿米卡星卡那霉素鏈霉素復(fù)方新諾明慶大霉素頭孢唑啉四環(huán)素頭孢噻肟左氟沙星諾氟沙星多粘菌素B環(huán)丙沙星頭孢吡肟麥迪霉素青霉素G氨芐西林呋喃妥因頭孢曲松頭孢他啶紅霉素萬古霉素頭孢西丁大觀霉素米諾環(huán)素頭孢噻吩氯霉素克林霉素妥布霉素頭孢呋辛克拉霉素頭孢哌酮苯唑西林氧氟沙星哌拉西林30301023．75/1．2510303030510300units530301010300303015303010030303021030157515100224160202693930．523．51232367．5212724．539321483572124300233411358．53033224．51602025938302312323682128243932．5148357．52124．53002334．51135930．533RSIRSSRSSSSSSRSSSSSIRSRSSSRSSISRSS

注：“S”為高度敏感，“I”為中度敏感，“R”為不敏感.

3 討 論

3.1 病原菌的分離及對鯪魚的致病力

近年來，鯪魚除可用于加工、食用外，還可作為尖塘鱧(Oxyeleotris)、鱖魚(Sinipercachuatsi)等品種的餌料魚，因此需求量逐年上漲，已成為華南地區(qū)熱門的養(yǎng)殖品種之一。盡管目前國內(nèi)外有關(guān)鯪魚病原的文獻報道主要集中于各類寄生蟲，但在實際生產(chǎn)中，由病原細(xì)菌引發(fā)的鯪魚病害已日趨嚴(yán)重[11,16]。本次從患病鯪魚分離到遲鈍愛德華氏菌，這在鯪魚的細(xì)菌性疾病研究中尚屬首次。

本研究中，人工感染后鯪魚的癥狀與自然發(fā)病時的癥狀相似，并從瀕死的魚體內(nèi)重新分離到了與遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815形態(tài)、生化特征一致的細(xì)菌，證實這兩株菌即為本次導(dǎo)致鯪魚發(fā)病的病原菌。經(jīng)計算遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對鯪魚的半致死劑量依次為1.93×105cfu/g和9.65×104cfu/g，顯示這兩株菌對鯪魚具有較強的致病力[20]。

3.2 病原菌的表型特征

Grimont等[21]根據(jù)遲鈍愛德華氏菌的生理生化特征，將其分為野生型和生物型Ⅰ。野生型的菌株能夠產(chǎn)生硫化氫，但不能利用某些糖類(如蔗糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖)作為能源，并與人和動物的感染密切相關(guān)；生物型Ⅰ菌株的以上4個生化指標(biāo)的特征與野生型的相反，該類型的菌株只從水體中和蛇體內(nèi)分離過，也尚未見生物型Ⅰ感染動物致病的文獻報道[22]。本研究所檢測的生化指標(biāo)中，除蔗糖和L-阿拉伯糖之外，其他指標(biāo)的結(jié)果與遲鈍愛德華氏菌一致。本研究中，QY15814蔗糖為陽性，而硫化氫、D-甘露醇、L-阿拉伯糖均為陰性；QY15815蔗糖、L-阿拉伯糖為陽性，而硫化氫、D-甘露醇為陰性，此兩菌株均未嚴(yán)格符合野生型和生物型Ⅰ的特征。因此，本次分離到的兩株遲鈍愛德華氏菌，屬于表型有差異的野生型，還是屬于表型有差異的生物型Ⅰ，尚需進一步驗證。

3.3 可防治鯪魚遲鈍愛德華氏菌病的抗生素的篩選

當(dāng)前，使用抗生素仍是防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的主要手段[23]。本研究得出的對34種抗生素敏感性的結(jié)果，可為在對由遲鈍愛德華氏菌引發(fā)的鯪魚感染癥防治用藥時提供參考。然而，抗生素選用時要以不同地區(qū)、不同來源、不同菌株的藥敏試驗結(jié)果為依據(jù)，避免藥物的濫用。目前對青霉素G耐藥的魚源遲鈍愛德華氏菌的菌株[24-27]較多，而本次分離得到的兩株遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對青霉素G敏感，此外，Xiao等[28-30]也分別報道過對青霉素G敏感的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)源、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)源與斑馬魚(Daniorerio)源遲鈍愛德華氏菌菌株。本研究發(fā)現(xiàn)遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用漁藥如克拉霉素、紅霉素、鏈霉素的敏感性降低，且對四環(huán)素、麥迪霉素、大觀霉素、克林霉素已產(chǎn)生耐藥性，推測由養(yǎng)殖戶長期投放此類藥物所致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，分離得到的兩個菌株對34種抗生素的敏感性并未由于菌株的不同而出現(xiàn)明顯的差異。此外，有趣的是，本次分離到的兩個菌株對部分二、三、四代頭孢類抗生素(如頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢呋辛)的敏感性最高。通過比較抑菌圈直徑，這些抗生素的抑菌能力明顯強于第一代頭孢菌素如頭孢唑啉、頭孢噻吩。本研究的藥敏試驗結(jié)果又一次證實，新型頭孢類抗生素相比早期頭孢類抗生素在抗菌作用方面具有更顯著的優(yōu)勢。

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IdentificationandAnalysisofAntibioticSensitivityofPathogenicBacteriumEdwardsiellatardafromCulturedMudCarp(Cirrhinusmolitorella)

CHEN Yanfeng1, ZHUO Xiaolei2, WANG Chao3, ZHENG Zongzheng1, FU Qiang1

( 1. College of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, China; 2. Qingyuan North River Fishery Science Institute，Qingyuan 511510， China; 3. Epidemic Prevention Station of Aquatic Animal in Qingyuan City, Qingyuan 511510， China )

Two dominant bacterial strains (QY15814 and QY15815) were isolated from hepatopancreas, kidney and spleen of diseased mud carp (Cirrhinusmolitorella) in an aquafarm in Qingyuan city, Guangdong province. They were identified through biochemical identification tubes and 16S rDNA sequence analysis, and antibiotic susceptibility test was performed through Kirby-Bauer disk diffusion method. Moreover, the median lethal dose values (LD50) for the isolates to mud carp were determined. The results showed that the isolates were facultative anaerobes which were gram negative, rod in shape, and motile. Their indole, MR and nitrate reduction test were positive, and they utilized sucrose, mannose and maltose. The isolates were identified asEdwardsiellatardaaccording to their physiological and biochemical characteristics. The 16S rDNA sequences of the isolates showed a high similarity (99%) to that ofE.tardavia BLAST network services in NCBI. The isolates were highly susceptible to cefotaxime, cefepime, ceftriaxone, cefoxitin, cefoperazone, cefuroxime and the others, intermediately susceptible to phytomycin, clarithromycin, erythromycin, and not susceptible to amikacin, complex sinomin, spectinomycin, and clindamycin. The LD50values for the isolates to healthy mud carps were 1.93×105cfu/g and 9.65×104cfu/g, respectively, indicating that they had strong pathogenicity to mud carp.

Cirrhinusmolitorella;Edwardsiellatarda; identification; drug sensitivity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.008

S941.42

A

1003-1111(2017)01-0048-06

2016-03-08；

2016-06-03.

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(2014A030310020); 廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2014KQNCX183); 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目(fsyq201507).

陳言峰(1981-), 男, 博士；研究方向: 水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治技術(shù). E-mail: chyfwf@126.com.