孟 瑋，楊天燕，阿地力，咸玉蘭

( 新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830000 )

基于ITS1基因分析亞東鮭(♂)、虹鱒(♀)及其F1代遺傳關(guān)系

孟 瑋，楊天燕，阿地力，咸玉蘭

( 新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830000 )

虹鱒、棕鱒均為優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，亞東鮭為棕鱒的同物異名，是19世紀(jì)西藏由歐洲引進(jìn)。為探索雜種優(yōu)勢(shì)，對(duì)亞東鮭和虹鱒進(jìn)行雜交試驗(yàn)，對(duì)其子一代幼魚與虹鱒、棕鱒進(jìn)行了體長和體質(zhì)量測(cè)定。采用ITS1基因分析其遺傳關(guān)系，并與巴基斯坦引進(jìn)的棕鱒對(duì)比研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)F1代體長、體質(zhì)量增長快于虹鱒、棕鱒，其遺傳多樣性高于亞東鮭和虹鱒，略低于棕鱒，表明F1代具有一定雜種優(yōu)勢(shì)。此外，棕鱒較高的遺傳多樣性也反映出從巴基斯坦引進(jìn)的發(fā)眼卵遺傳背景較好，具有進(jìn)一步養(yǎng)殖選育的潛力。

ITS1；基因；亞東鮭；棕鱒；虹鱒；雜種優(yōu)勢(shì)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，屬鮭形目、鮭科，原產(chǎn)美國西海岸，1959年引進(jìn)我國。因性成熟個(gè)體體側(cè)沿側(cè)線中部有一條寬而鮮艷的紫紅色彩虹帶而得名。虹鱒具有生長周期短、成本低、肉質(zhì)好等特點(diǎn)，是世界上廣泛養(yǎng)殖的重要冷水性魚類。虹鱒營養(yǎng)成分高于“四大家魚”[1]，也是世界糧農(nóng)組織推薦養(yǎng)殖的三大魚類之一。棕鱒(Salmotruttafario)又名河鱒，是原產(chǎn)歐洲、北非和西亞的一種名貴冷水性鮭科魚類[2]。十八世紀(jì)初英國人將其引入印度和巴基斯坦地區(qū)，經(jīng)過幾個(gè)世紀(jì)的繁衍生息，已在當(dāng)?shù)匦纬梢欢ㄒ?guī)模和數(shù)量的自然種群。棕鱒因生長迅速、個(gè)體大、色彩艷麗、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿Γ壳耙驯灰氲?0多個(gè)國家和地區(qū)。亞東鮭為棕鱒的同物異名，19世紀(jì)英國人自歐洲引種至西藏地區(qū)亞東河，始稱亞東鮭，1992年被列為西藏自治區(qū)二級(jí)保護(hù)水生動(dòng)物。

雜交育種是水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛的一種傳統(tǒng)育種技術(shù)。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可以分為近緣雜交和遠(yuǎn)緣雜交。近緣雜交一般指種內(nèi)雜交，遠(yuǎn)緣雜交則包括種間、屬間、亞科間、科間雜交。雜交育種利用分離、自由組合和連鎖互換規(guī)律，可以產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)，培育出具有優(yōu)良性狀的新品種。例如，金鱒是從虹鱒突變種選育出來的金黃色品系，但純系的金鱒抗病力較低，而與虹鱒雜交后子一代體質(zhì)得到改良，從稚魚至成魚較其親本表現(xiàn)出攝食力強(qiáng)、耐高密度飼養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)[3]。

為進(jìn)一步開發(fā)雜交品種，需要明確子一代遺傳背景。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的成熟，采用這些工具進(jìn)行親緣分析得到廣泛開展。張玉勇等[4]采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了虹鱒、山女鱒(O.masou)及其子代的遺傳關(guān)系；隋班良等[5]采用AFLP標(biāo)記分析了黃姑魚(Nibeaalbiflora)與大黃魚(Pseudosciaenacrocea)雜交F1代的遺傳組成。此外，ISSR、RAPD、SRAP等標(biāo)記也在雜交種分析中得到應(yīng)用。與上述標(biāo)記相比，直接基因測(cè)序分析具有更高的準(zhǔn)確性。然而，目前國內(nèi)采用基因片段進(jìn)行子代遺傳分析的報(bào)道較少，線粒體標(biāo)記盡管在魚類中應(yīng)用較多，但由于其母系遺傳特性不適用于親本與子代關(guān)系分析。ITS基因作為核基因不受母系遺傳限制，進(jìn)化速率適合進(jìn)行種間雜交的遺傳背景分析[6]。本研究采用ITS1標(biāo)記分析了虹鱒、亞東鮭及其子一代的遺傳關(guān)系，同時(shí)選取了來自巴基斯坦的棕鱒作為對(duì)比，以期探明其遺傳關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及形態(tài)測(cè)定

本研究用樣本均采自烏魯木齊市達(dá)坂城區(qū)東溝冷水魚養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)，其中亞東鮭為2008年西藏亞東引進(jìn)，棕鱒為2011年巴基斯坦引進(jìn)，亞東鮭(♂)與虹鱒(♀)雜交子代為2009年人工繁殖。現(xiàn)場(chǎng)剪取新鮮尾鰭組織用無水乙醇浸泡固定，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于冰箱-20 ℃保存。對(duì)棕鱒、虹鱒及雜交F1代個(gè)體幼苗進(jìn)行形態(tài)測(cè)量，測(cè)量時(shí)間為8月齡、10月齡及2.5齡。分別測(cè)量3種幼魚50尾的體長及體質(zhì)量。分別用Y代表亞東鮭，Z代表棕鱒，H代表虹鱒，F(xiàn)代表亞東鮭(♂)、虹鱒(♀)的雜交子代。

1.2 基因組DNA抽提、PCR擴(kuò)增及克隆

試驗(yàn)前將鰭條充分漂洗、晾干并剪碎，采用標(biāo)準(zhǔn)酚—氯仿法提取基因組[7]。擴(kuò)增引物序列為Gits1F(5′-AAAAAGCTTCCGTAGGTGAACCTGCG-3′)和Gits1R(5′-AGCTTGCTGCGTTCTTCATCGA-3′)[7]。

PCR反應(yīng)總體積50 μL，其中10×buffer 5.0 μL，Mg2+終濃度為2.0 mmol/L，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，Taq聚合酶2 U，引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 2 μL(1 μg)，加滅菌水至終體積50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后是35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用天根回收試劑盒純化回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α。每個(gè)種選取10個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體挑取1個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DNASTAR Lasergene 7.1.0軟件對(duì)同源序列進(jìn)行比對(duì)、編輯和校準(zhǔn)；Dnasp 5.10.1[9]軟件計(jì)算變異位點(diǎn)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)等；Mega 6.0[10]軟件基于Kimura雙因子參數(shù)模型構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹，1000次重抽樣檢驗(yàn)系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的自引導(dǎo)值。

2 結(jié) 果

獲得的ITS1序列T、C、A、G含量分別為20.3%、31.8%、17.5%、30.5%，A+T含量小于G+C含量。比較序列長度在614～619 bp，其中虹鱒長度為614～615 bp，亞東鮭為617～618 bp，棕鱒為617～619 bp，F(xiàn)1代中2個(gè)單倍型為617 bp，其余5個(gè)均為614～615 bp。

分別計(jì)算虹鱒、棕鱒、亞東鮭、雜交F1代的遺傳多樣性參數(shù)(表1)，棕鱒9尾個(gè)體中發(fā)現(xiàn)7種單倍型，其單倍型多樣度和核苷酸多樣度均為最高；虹鱒10尾個(gè)體中發(fā)現(xiàn)2種單倍型，其單倍型多樣度和核苷酸多樣度均為最低。亞東鮭多樣性略低于棕鱒，高于虹鱒。雜交子代多樣性高于亞東鮭和虹鱒，略低于棕鱒。

圖1 基于ITS1基因序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)樹Y，亞東鮭；Z，棕鱒；H，虹鱒；F，亞東鮭(♂)、虹鱒(♀)的雜交子代.

從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看，主要分成了兩支(圖1)。一支包含了棕鱒、亞東鮭與2尾F1代個(gè)體(2個(gè)單倍型，稱為F1代Z型)。另一支包含了虹鱒與7尾F1代個(gè)體(5個(gè)單倍型，稱為F1代H型)。從兩支的單倍型來看，棕鱒一支有1個(gè)主體單倍型，包含3尾亞東鮭，2尾棕鱒，1尾F1代。虹鱒一支有2個(gè)主體單倍型，一個(gè)包含5尾虹鱒與3尾F1代，一個(gè)包含5尾虹鱒與2尾F1代。這3個(gè)主體單倍型以外的單倍型均不超過2尾個(gè)體。

Mega軟件計(jì)算群體間遺傳距離(表2)，結(jié)果顯示最小遺傳距離出現(xiàn)在虹鱒與F1代H型之間，最大遺傳距離分別出現(xiàn)在F1代H型與Z型、F1代Z型與虹鱒間。亞東鮭和棕鱒的遺傳距離小于1%，仍在種的范圍內(nèi)。虹鱒與亞東鮭、棕鱒的遺傳距離分別為13.5%、13.6%。

分別對(duì)棕鱒、虹鱒及雜交種的苗種生長發(fā)育情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不論體長還是體質(zhì)量，雜交種生長速度最快，是虹鱒與棕鱒生長速度的2～3倍(表3)。

表1 4個(gè)群體魚類遺傳多樣性參數(shù)

表2 5個(gè)群體魚類遺傳距離

表3 3個(gè)群體魚類生長性狀比較

3 討 論

亞東鮭為國外引入西藏品種，現(xiàn)存亞東鮭多是當(dāng)時(shí)引進(jìn)的少量親本的后代，受到奠基者效應(yīng)的影響，其遺傳多樣性有一定的降低。豪富華[11]采用線粒體Cyt b和D-loop基因分析了西藏亞東河流的亞東鮭和丹麥引進(jìn)棕鱒群體間遺傳差異，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)二者兩個(gè)基因序列完全相同。此外，筆者也曾采用線粒體COⅠ基因檢測(cè)了同一批次亞東鮭樣品遺傳變異情況，結(jié)果所有個(gè)體均為同一種單倍型。上述研究均揭示了亞東鮭較低的遺傳多樣性現(xiàn)狀。然而，從本研究分析的核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1基因來看，其遺傳多樣性較線粒體基因更豐富，表明亞東鮭核基因ITS1的變異程度高于線粒體基因。本研究中棕鱒為巴基斯坦引進(jìn)發(fā)眼卵孵化培育所得個(gè)體，由于巴基斯坦的棕鱒引種時(shí)間早于亞東鮭一個(gè)世紀(jì)，受基因突變的影響，其遺傳多樣性尤其是核苷酸多樣性高于亞東鮭。此外，棕鱒較高的遺傳多樣性反映出這些發(fā)眼卵遺傳背景較好，具有進(jìn)一步養(yǎng)殖選育的潛力。

淡水魚類雜交現(xiàn)象普遍存在。Hubbs[12]認(rèn)為雜交現(xiàn)象在引種地或者物種生境遭到物理或生物干擾的地方會(huì)較高。鮭鱒魚類作為一種引種廣泛的魚類，雜交現(xiàn)象在鮭亞科已有廣泛報(bào)道，如鮭屬的大西洋鮭(S.salar)與棕鱒[13-14]，大麻哈魚屬的切喉鱒(O.clarkiilewisi)與虹鱒[15-16]，紅點(diǎn)鮭屬(Salvelinus)的美洲紅點(diǎn)鮭(S.fontinalis)與白斑紅點(diǎn)鮭(S.leucomaenis)[17]。盡管雜種優(yōu)勢(shì)經(jīng)常被用來選育新品種，但是并非所有的雜交都能給后代帶來優(yōu)勢(shì)，如切喉鱒和虹鱒的雜交后代生長和存活性能較親本大幅度降低[18]。虹鱒和亞東鮭雜交試驗(yàn)國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道，本研究中二者雜交子代遺傳多樣性高于父、母本，從生長性能來看，F(xiàn)1代在3個(gè)時(shí)間段體長和體質(zhì)量也都明顯優(yōu)于親本。綜合上述研究結(jié)果表明，二者的雜交種具有雜種優(yōu)勢(shì)，有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。

遠(yuǎn)緣雜交一般指在分類學(xué)上物種以上分類階元個(gè)體之間的交配。由于親本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，雜交時(shí)精卵結(jié)合的情況比較復(fù)雜。有些時(shí)候僅僅部分遺傳物質(zhì)發(fā)生合并或交換，有些時(shí)候未發(fā)生精卵結(jié)合即雄核或雌核發(fā)育。本研究中虹鱒與亞東鮭雜交是屬間的遠(yuǎn)緣雜交。從F1代的遺傳屬性看，它并非完全偏向親本的一方，而是分成了兩種類型，暗示二者雜交時(shí)應(yīng)該存在遺傳物質(zhì)的交流，不屬于精卵不結(jié)合的情況。ITS1基因并沒有明顯的單親遺傳現(xiàn)象，與母系遺傳的線粒體基因相比更適合進(jìn)行親子關(guān)系分析。

ITS基因已經(jīng)在植物雜交種鑒定中得到廣泛應(yīng)用，本研究中ITS基因能夠有效區(qū)分兩親本，通過對(duì)F1代與親本單倍型的比較，證明了F1代確為兩親本的雜交種。盡管F1代數(shù)據(jù)顯示其遺傳性狀偏向母本虹鱒，但這可能是由于僅僅挑取1個(gè)單克隆所致。聚類分析顯示父、母本ITS1單倍型分別聚在一起沒有交叉，故F1代個(gè)體的ITS1基因可能存在分別偏向父、母本兩種類型。本研究在F1代中未檢測(cè)到兩種親本基因型的交換重組序列。

種間雜交親和性與物種遺傳距離有一定關(guān)系。徐冬冬等[19]對(duì)8種鲆鰈魚類研究發(fā)現(xiàn)，遺傳距離小于0.04，正反交后代均可以存活；遺傳距離為0.04～0.15，正反交單向后代可以存活；種間距離大于0.15，則雜交后代很難存活。本研究中虹鱒與亞東鮭的遺傳距離相對(duì)較大(0.135)，但是雜交種仍可以存活，由于缺乏反交驗(yàn)證，尚難以判斷是否為單向存活。本研究中的雜交種表現(xiàn)出了一定的雜種優(yōu)勢(shì)，但值得注意的是，雜交種自交會(huì)產(chǎn)生基因分離，不能保持雜種優(yōu)勢(shì)，與其他魚雜交會(huì)產(chǎn)生遺傳污染。因此，對(duì)雜交種尤其是具有繁育能力的雜交種應(yīng)嚴(yán)格控制其在自然環(huán)境中的擴(kuò)散。

[1] 宋蘇祥, 孫大江. 虹鱒魚肌肉營養(yǎng)成分的分析[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 11(1):70-73.

[2] MacCrimmon H R, Marshall T L, Gots B L. World distribution of brown trout,Salmotrutta: further observations[J]. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1970, 27(4):811-818.

[3] 姜福堂, 萬進(jìn)德, 齊秀云, 等. 雜交金鱒苗種培育技術(shù)[J]. 齊魯漁業(yè), 2004, 21(1):23-24.

[4] 張玉勇, 白慶利, 賈智英, 等. 虹鱒、山女鱒及其雜交子代(虹鱒♀×山女鱒♂)的微衛(wèi)星分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2009, 33(2):188-195.

[5] 隋班良, 蔡明夷, 劉穎, 等. 黃姑魚♀與大黃魚♂雜交試驗(yàn)與AFLP分析[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2012, 17(4):241-246.

[6] 孫超，劉洪波，姜濤，等. 鳳鱭ITS1與Cyt b基因序列的比較研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué),2013,32(9)：536-540.

[7] Maniatis T, Fritsch E F, Sambrook J. Molecular Cloning:a Laboratory Manual[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.

[8] Presa P, Pardo B G, Martínez P, et al. Phylogeographic congruence between mtDNA and rDNA ITS markers in brown trout[J]. Molecular Biology and Evolution, 2002, 19(12):2161-2175.

[9] Rozas J. DNA Sequence Polymorphism Analysis using DnaSP. Bioinformatics for DNA Sequence Analysis, Methods in Molecular Biology[M]. New Jersey:Humana Press, 2009:337-350.

[10] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA 6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(12): 2725-2729.

[11] 豪富華. 亞東鮭的生物學(xué)和遺傳多樣性研究[D]. 武漢：中國科學(xué)院水生生物研究所, 2006.

[12] Hubbs C L. Hybridization between fish species in nature [J]. Systematic Zoology, 1955, 4(1):1-20.

[13] Elo K, Erkinaro J, Vuorinen J A, et al. Hybridization between Atlantic salmon (Salmosalar) and brown trout (S.trutta) in the Teno and N??t?m? River Systems, northernmost Europe[J]. Nordic Journal of Freshwater Research, 1995(70):56-61.

[14] McGowan C, Davidson W S. Unidirectional natural hybridization between brown trout (Salmotrutta) and Atlantic salmon (S.salar) in Newfoundland [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1992, 49(9):1953-1958.

[15] Weigel D E, Peterson J T, Spruell P. Introgressive hybridization between native cutthroat trout and introduced rainbow trout[J]. Ecological Applications, 2003, 13(1):38-50.

[16] Boyer M C, Muhlfeld C C, Allendorf F W. Rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) invasion and the spread of hybridization with native westslope cutthroat trout (Oncorhynchusclarkiilewisi)[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2008, 65(4): 658-669.

[17] 郭媛, 戶國, 谷偉, 等. 美洲紅點(diǎn)鮭和白斑紅點(diǎn)鮭及其雜交子代幼魚的生長曲線擬合[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2015, 22(1):51-59.

[18] Allendorf F W, Leary R F. Conservation and distribution of genetic variation in a polytypic species: the cutthroat trout[J]. Conservation Biology, 1988(2): 170-184.

[19] 徐冬冬, 尤鋒, 樓寶, 等. 8 種鲆鰈魚種間遺傳距離與雜交親和性的相關(guān)性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010,34(2):178-184.

GeneticAnalysisofYadongSalmon(♂),RainbowTrout(♀)andTheirF1HybridBasedonITS1Gene

MENG Wei, YANG Tianyan, A Dili, XIAN Yulan

( Xinjiang Fisheries Research Institute, Urumqi 830000, China )

Rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) and brown trout (Salmontrutta) are high-quality aquaculture species, and Yadong salmon is synonym of brown trout introduced from Europe to Tibet in 19th century. To explore the heterosis of salmo fishes, a hybrid experiment between Yadong samlo and rainbow trout was carried out, and the body length and body weight of F1hybrid, rainbow trout and brown trout were measured. Their genetic relationship was analyzed by ITS1 gene, and compared with brown trout introduced from Pakistan. The results showed that F1had more rapid growth rate than rainbow trout and brown trout did, higher genetic diversity than Yadong Salmon and rainbow trout, and slightly lower than brown trout, indicating the heterosis of F1generation. High genetic diversity of brown trout reflects the good genetic background, and shows the potential for further breeding.

ITS1 gene;Yadong salmon; brown trout; rainbow trout; heterosis

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.020

S965.232

A

1003-1111(2017)03-0373-04

2016-05-11；

2016-09-06.

新疆少數(shù)民族科技人才特殊培養(yǎng)計(jì)劃科研項(xiàng)目(201423129).

孟瑋(1982-)，男，高級(jí)工程師；研究方向：漁業(yè)種質(zhì)資源. E-mail：mengwei1982@hotmail.com.通訊作者： 楊天燕(1982-)，女，高級(jí)工程師；研究方向：魚類種群遺傳學(xué). E-mail：hellojelly1130@163.com.