陳 仲，楊愛(ài)馥，王 擺，蔣經(jīng)偉，高 杉，董 穎，周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

仿刺參纖維膠凝蛋白基因的分子特征及表達(dá)分析

陳 仲，楊愛(ài)馥，王 擺，蔣經(jīng)偉，高 杉，董 穎，周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

纖維膠凝蛋白是非特異性免疫系統(tǒng)中的重要分子。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及cDNA末端快速克隆技術(shù)得到一條仿刺參纖維膠凝蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并將其編碼的蛋白命名為仿刺參纖維膠凝蛋白-1。獲得的基因cDNA全長(zhǎng)為1951 bp，其中5′-末端非翻譯區(qū)為397 bp，3′-末端非翻譯區(qū)為666 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?88 bp，編碼295個(gè)氨基酸，N端16個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽后面有兩個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，C端為纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析了仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參幼參不同組織及細(xì)菌脂多糖刺激后的時(shí)序表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參的腸道、呼吸樹(shù)、體腔細(xì)胞和體壁均有表達(dá)，且腸道的表達(dá)量最高；脂多糖刺激后，4種組織的仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因表達(dá)量均有變化，且以腸道和體壁表達(dá)量的變化最為顯著；此外，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參4種組織中的表達(dá)量變化具有不同的時(shí)序性，表明仿刺參纖維膠凝蛋白-1可能在仿刺參免疫應(yīng)答中起重要作用。

仿刺參；纖維膠凝蛋白；序列分析；基因表達(dá)；脂多糖刺激

纖維膠凝蛋白(ficolin)是一組存在于多種動(dòng)物體內(nèi)，組織分布廣泛的寡聚蛋白，在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[1]。纖維膠凝蛋白最初是作為一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)β因子結(jié)合蛋白發(fā)現(xiàn)于豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞上[2]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種重要的纖維膠凝蛋白家族成員，證實(shí)是機(jī)體天然免疫中的關(guān)鍵分子[3]。纖維膠凝蛋白由膠原樣結(jié)構(gòu)域和纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域組成[1]，可以通過(guò)凝集素途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，繼而形成C3轉(zhuǎn)化酶，形成攻膜復(fù)合體使細(xì)菌溶解，或者提高吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬作用[4-5]。目前已有報(bào)道，纖維膠凝蛋白廣泛存在于兩棲動(dòng)物[6]、爬行動(dòng)物[7]、哺乳動(dòng)物[8-9]等脊椎動(dòng)物體內(nèi)，近年來(lái)信號(hào)小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)[10]、真海鞘(Halocynthiaroretzi)[11]、近江牡蠣(Crassostreahongkongensis)[12]、文昌魚(yú)(Branchiostomafloridae)[13]、紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)等無(wú)脊椎動(dòng)物和脊索動(dòng)物體內(nèi)也陸續(xù)證明了纖維膠凝蛋白的存在，仿刺參纖維膠凝蛋白基因的克隆及表達(dá)規(guī)律的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動(dòng)物門(mén)、海參綱。棘皮動(dòng)物處于由無(wú)脊椎動(dòng)物向脊椎動(dòng)物開(kāi)始分支進(jìn)化的階段，所以棘皮動(dòng)物是研究免疫系統(tǒng)進(jìn)化的寶貴材料。仿刺參是我國(guó)北方重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種，但其養(yǎng)殖受到細(xì)菌性病害的嚴(yán)重影響，因此，研究仿刺參免疫的分子機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。筆者通過(guò)仿刺參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到了一條與其他物種纖維膠凝蛋白同源性較高的cDNA序列[14]，通過(guò)cDNA末端快速克隆技術(shù)得到該基因的全長(zhǎng)cDNA序列，將其編碼的蛋白命名為仿刺參纖維膠凝蛋白-1，對(duì)其基因及蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，并分析了其在仿刺參不同組織及脂多糖刺激前后的表達(dá)規(guī)律，為深入研究仿刺參免疫分子機(jī)制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參幼參來(lái)源于大連廣鹿島海域，規(guī)格為(10.0±0.5) g。鮮活樣品取回后于人工育苗池常規(guī)條件下暫養(yǎng)一周，暫養(yǎng)期間保持充氣。所用海水均經(jīng)過(guò)砂濾，水溫16～18 ℃，鹽度32，pH 7.8～8.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 仿刺參纖維膠凝蛋白-1全長(zhǎng)基因序列的擴(kuò)增

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到了一條與其他物種纖維膠凝蛋白同源性較高的cDNA序列[14]，使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit與Advantage 2 PCR Enzyme System 試劑盒(Clontech)進(jìn)行5′和3′ 末端擴(kuò)增，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)特異引物 5r-1和3r-1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1，通用引物UPM和巢式引物NUP為試劑盒中自帶引物。使用特異引物和UPM進(jìn)行第1輪PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用特異引物和NUP進(jìn)行巢式PCR，條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，利用 Agarose GEL DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0(TaKaRa)回收目的片段，連入克隆載體 pMD19-T，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109，所獲得的陽(yáng)性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與原序列進(jìn)行拼接，獲得仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的cDNA 全長(zhǎng)。

1.2.2 蛋白序列特征分析及分子進(jìn)化分析

將仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的cDNA和蛋白序列與 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)及蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)分析。應(yīng)用 ORF Finder 程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)確定正確的開(kāi)放閱讀框并推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列。用Simple Modular Architecture Reach Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行信號(hào)肽和蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。使用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)[15]，采用MEGA 4.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)抽樣次數(shù)設(shè)為1000來(lái)計(jì)算各分支的置信程度。

1.2.3 脂多糖刺激

健康仿刺參幼參(約10 g)飼養(yǎng)于水族箱內(nèi)，2 d內(nèi)不投喂任何餌料，排空消化道內(nèi)食物，注射脂多糖500 μL(1 μg/μL)，對(duì)照組注射500 μL無(wú)菌海水，空白組(0 h)無(wú)任何注射。幼參注射脂多糖4、12、24、48、72 h后用飽和MgSO4麻醉，無(wú)菌海水沖洗后取腸道、呼吸樹(shù)、體腔細(xì)胞和體壁，各種組織分別取10個(gè)個(gè)體的混合樣，重復(fù)3次，投入液氮中迅速冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 總RNA提取

用RNAprep pure 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取仿刺參不同組織的總RNA，電泳檢測(cè)RNA的完整性，用Implen Nanophotometer核酸蛋白分析儀(德國(guó)) 檢測(cè)RNA的純度和濃度。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取每個(gè)樣品的總RNA 900 ng用Prime-ScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體積及反應(yīng)條件按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ染料法(SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit，TaKaRa)，在Mx 3000pTM熒光定量PCR儀(Stratagene，La Jolla，CA，USA)上進(jìn)行。以Cytb基因作為內(nèi)參[16]，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因和內(nèi)參基因的引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)終體積20 μL：2×SYBR Green Master mix緩沖液10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA樣品1 μL，引物各0.4 μmol/L。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 PCR所用引物序列

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

相對(duì)表達(dá)水平通過(guò) Relative Expression Software Tool 384 v.2軟件計(jì)算[17]。運(yùn)用單因素方差分析和多次對(duì)比檢驗(yàn)分析比較試驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)水平的差異性，P<0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿刺參纖維膠凝蛋白-1序列分析

仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因cDNA序列全長(zhǎng)為1951 bp，其中5′-末端非翻譯區(qū)為397 bp，3′-末端非翻譯區(qū)為666 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?88 bp，編碼295個(gè)氨基酸，分子量為33.4 ku，理論等電點(diǎn)為4.62。利用SMART對(duì)仿刺參纖維膠凝蛋白-1結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，該蛋白N端16個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽后面有2個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，其中G為甘氨酸，X、Y為任意氨基酸。C端的纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域位于79～290氨基酸之間(圖1)。

圖1 仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因cDNA及氨基酸序列分析仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因cDNA及其氨基酸序列，大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別表示開(kāi)放閱讀框和非翻譯區(qū)；下劃線標(biāo)注為信號(hào)肽；G-X-Y重復(fù)序列用雙下劃線標(biāo)注；陰影標(biāo)注為纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域；方框標(biāo)注為Ca2+結(jié)合位點(diǎn)；多聚腺苷酸信號(hào)(AATAAA)用黑體加斜體標(biāo)注；poly A尾用黑體標(biāo)注.

2.2 仿刺參纖維膠凝蛋白-1氨基酸序列的同源性分析

將仿刺參纖維膠凝蛋白-1的氨基酸序列輸入到NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，發(fā)現(xiàn)仿刺參纖維膠凝蛋白-1的氨基酸序列與鴨嘴海豆芽(Lingulaanatina)的ficolin-1序列相似度最高，為50%，其次是同為棘皮動(dòng)物的紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)ficolin-1，序列相似度為48%。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索纖維膠凝蛋白，選取不同進(jìn)化地位的代表生物用于序列比對(duì)和進(jìn)化分析，所選物種及NCBI登記號(hào)見(jiàn)表2。對(duì)不同物種纖維膠凝蛋白的纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示包括仿刺參纖維膠凝蛋白-1在內(nèi)的各物種纖維膠凝蛋白的纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域中均包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基和一個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，除毛首鞭蟲(chóng)(Trichuristrichiura)以外，其他物種的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)序列均為D-N-D(圖2)。

以表2中不同物種纖維膠凝蛋白氨基酸序列構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，基本符合物種的傳統(tǒng)分類進(jìn)化關(guān)系，仿刺參處于低等無(wú)脊椎動(dòng)物和脊索動(dòng)物之間，與海膽親緣關(guān)系最近，這與諸多研究結(jié)果一致[18-20](圖3)。

表2 不同物種纖維膠凝蛋白的NCBI登記號(hào)

圖2 仿刺參纖維膠凝蛋白-1纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與其他物種的同源性比對(duì)黑色背景代表保守區(qū)，灰色背景代表高度保守區(qū)；▼表示保守的半胱氨酸殘基；＊表示Ca2+結(jié)合位點(diǎn).

圖3 纖維膠凝蛋白的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的組織表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在不同組織中的表達(dá)情況。仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在的腸道、呼吸樹(shù)、體腔細(xì)胞和體壁4種組織中均有表達(dá)，體腔細(xì)胞中的表達(dá)量最低，其他3種組織中的表達(dá)量均明顯高于體腔細(xì)胞。腸中的表達(dá)量最高，為體腔細(xì)胞中的7.5倍，其次為體壁，表達(dá)量為體腔細(xì)胞中的5.5倍(圖4)。

圖4 仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的組織表達(dá)分析＊表示該組織仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因表達(dá)量與體腔細(xì)胞存在顯著差異.

2.4 脂多糖刺激后仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參不同組織中的時(shí)序表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了脂多糖刺激后仿刺參腸道、呼吸樹(shù)、體腔細(xì)胞和體壁4種組織中仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的時(shí)序表達(dá)情況，結(jié)果顯示仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在脂多糖刺激后4種組織中的表達(dá)規(guī)律存在差別(圖5)。首先在腸道中，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的表達(dá)顯著正調(diào)控，刺激組表達(dá)量在12 h即達(dá)到對(duì)照組的10倍，24 h達(dá)到了頂峰，為對(duì)照組的27倍，48 h開(kāi)始下降，但仍顯著高于對(duì)照組，整體顯現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。而在體壁中，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因表達(dá)顯著負(fù)調(diào)控，刺激組表達(dá)量在48 h達(dá)到最低點(diǎn)，僅為對(duì)照組的0.1倍。在體腔細(xì)胞中，脂多糖刺激后4 h，刺激組的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組即有一個(gè)顯著的升高，隨后開(kāi)始下降，24 h和48 h刺激組的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，72 h刺激組的表達(dá)量再一次升高，達(dá)到對(duì)照組的2.5倍。在呼吸樹(shù)中，刺激組的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，但與腸道不同的是，呼吸樹(shù)中刺激組的表達(dá)量?jī)H在24 h顯著高于對(duì)照組(2.2倍)，其他時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組。

圖5 脂多糖刺激后仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參不同組織中的時(shí)序表達(dá)a. 體腔細(xì)胞；b. 體壁；c. 呼吸樹(shù)；d. 腸道.＊表示某時(shí)間點(diǎn)刺激組與對(duì)照組存在顯著差異.

3 討 論

纖維膠凝蛋白是在非特異性免疫中起到重要作用的蛋白因子[1]，纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域是纖維膠凝蛋白識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌表面糖基的結(jié)構(gòu)域，與纖維膠凝蛋白結(jié)合的糖類配體都是病原微生物表面常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)成分，人L-ficolin可以識(shí)別傷寒桿菌(Salmonellatyphimurium)表面的糖結(jié)構(gòu)，并能識(shí)別和結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的細(xì)胞壁成份磷壁酸[21-22]；H-ficolin能結(jié)合傷寒桿菌和明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌(Salmonellaminnesota)的脂多糖[23]；仿刺參纖維膠凝蛋白-1的C端有一個(gè)纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域，與其他物種該結(jié)構(gòu)域比對(duì)結(jié)果顯示，仿刺參纖維膠凝蛋白-1具有保守的半胱氨酸殘基和Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)仿刺參纖維膠凝蛋白-1可以像脊椎動(dòng)物一樣行使識(shí)別并結(jié)合病原菌糖基的功能。在其他無(wú)脊椎動(dòng)物中，信號(hào)小龍蝦纖維膠凝蛋白可凝集大腸桿菌、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和金黃色葡萄球菌，并可以幫助機(jī)體清除注入血淋巴中的革蘭氏陰性菌[10]；近江牡蠣的重組纖維膠凝蛋白可在體外凝集大腸桿菌并增強(qiáng)對(duì)其吞噬作用[12]。在脊索動(dòng)物海鞘體內(nèi)，纖維膠凝蛋白可識(shí)別并結(jié)合含N-乙酰氨基的多種糖類[11]。

脊椎動(dòng)物纖維膠凝蛋白由膠原樣結(jié)構(gòu)域和纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域兩部分結(jié)構(gòu)域組成，例如非洲爪蟾[6]、玉米錦蛇[7]、人[9]等，纖維膠凝蛋白與病原菌表面糖基結(jié)合后，通過(guò)膠原樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶，進(jìn)一步通過(guò)凝集素途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)[4-5]。而牡蠣[12]、文昌魚(yú)[13]等無(wú)脊椎動(dòng)物和脊索動(dòng)物的纖維膠凝蛋白只有纖維蛋白素原結(jié)構(gòu)域而不具有膠原樣結(jié)構(gòu)域。仿刺參纖維膠凝蛋白-1 N端有2個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，而脊椎動(dòng)物纖維膠凝蛋白的膠原樣結(jié)構(gòu)域是由多個(gè)G-X-Y重復(fù)序列組成，仿刺參纖維膠凝蛋白-1 N端的2個(gè)G-X-Y重復(fù)序列能否同膠原樣結(jié)構(gòu)域行使相同的功能有待于進(jìn)一步研究。

棘皮動(dòng)物的先天免疫功能主要是由體腔液中的體腔細(xì)胞和免疫分子來(lái)完成，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的仿刺參，其各種組織中均存在纖維膠凝蛋白-1基因的表達(dá)，腸道和體壁的表達(dá)量高于呼吸樹(shù)和體腔細(xì)胞。而在脂多糖刺激后，腸道和體壁中纖維膠凝蛋白-1的免疫應(yīng)答較其他組織表現(xiàn)得更為活躍，原因可能是由于仿刺參攝食的食物內(nèi)含有大量的病原菌，而腸道組織直接與這些病原菌接觸；而體壁與海洋環(huán)境中的病原菌直接接觸，腸道組織和體壁是海參抵御外來(lái)病原的第一道防線，因而有免疫相關(guān)基因的高水平表達(dá)。經(jīng)脂多糖刺激后，仿刺參4種組織的纖維膠凝蛋白-1基因表達(dá)量均發(fā)生顯著變化，且存在不同的時(shí)序性，說(shuō)明在4種組織中，仿刺參纖維膠凝蛋白-1均參與了仿刺參對(duì)病原菌的免疫應(yīng)答過(guò)程。在其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中，牡蠣的血淋巴內(nèi)纖維膠凝蛋白基因表達(dá)量在鰻弧菌(Vibrioanguillarum)和溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)感染后均有顯著的升高，并呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)[12]，這說(shuō)明其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物與仿刺參相似，纖維膠凝蛋白均在機(jī)體對(duì)病原菌的免疫應(yīng)答過(guò)程中起到重要作用。

[1] Ichijo H，Hellman U，Wernstedt C，et al. Molecular cloning and characterization of ficolin, a multimeric protein with fibrinogen- and collagen-like domains[J]. J Biol Chem，1993，268(19)：14505-14513.

[2] Ichijo H，R?nnstrand L，Miyagawa K，et al. Purification of transforming growth factor-beta 1 binding proteins from porcine uterus membranes[J]. J Biol Chem，1991，266(33)：22459-22464.

[3] 喬濱，熊思東. 糖類模式識(shí)別分子纖維膠凝蛋白與補(bǔ)體凝集素活化途徑[J]. 生命的化學(xué)，2003，23(5)：358-360.

[4] Matsushita M，Endo Y，F(xiàn)ujita T. Cutting edge:complement-activating complex of ficolin and mannose-binding lectin-associated serine protease[J]. J Immunol，2000，164(5)：2281-2284.

[5] Matsushita M，Endo Y，Hamasaki N，et al. Activation of the lectin complement pathway by ficolins[J]. Int Immunopharmacol，2001，1(3)：359-363.

[6] Kakinuma Y，Endo Y，Takahashi M，et al. Molecular cloning and characterization of novel ficolins fromXenopuslaevis[J]. Immunogenetics，2003，55(1)：29-37.

[7] Hargreaves A D，Swain M T，Logan D W，et al. Testing the toxicofera:comparative transcriptomics casts doubt on the single, early evolution of the reptile venom system[J]. Toxicon，2014，92(8)：140-156.

[8] Fujimori Y，Harumiya S，F(xiàn)ukumoto Y，et al. Molecular cloning and characterization of mouse ficolin-A[J]. Biochem Biophys Res Commun，1998，244(3)：796-800.

[9] Le Y，Lee S H，Kon O L，et al. Human L-ficolin:plasma levels, sugar specificity, and assignment of its lectin activity to the fibrinogen-like(FBG)domain[J]. FEBS Lett，1998，425(2)：367-370.

[10] Wu C，S?derh?ll K，S?derh?ll I. Two novel ficolin-like proteins(FLPs)act as pattern recognition molecules for invading pathogen in the freshwater crayfishPacifastacusleniusculus[J]. Proteomics，2011，11(11)：2249-2264.

[11] Kenjo A，Takahashi M，Matsushita M，et al. Cloning and characterization of novel ficolins from the solitary ascidian,Halocynthiaroretzi[J]. J Biol Chem，2001，276(23)：19959-19965.

[12] Xiang Z，Qu F，Wang F，et al. Characteristic and functional analysis of a ficolin-like protein from the oysterCrassostreahongkongensis[J]. Fish & Shellfish Immunol，2014，40(2)：514-523.

[13] Putnam N H，Butts T，F(xiàn)errier D E，et al. The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotype[J]. Nature，2008，453(7198)：1064-1071.

[14] Zhou Z C，Dong Y，Sun H J，et al. Transcriptome sequencing of sea cucumber(Apostichopusjaponicus)and the identification of gene-associated markers[J]. Mol Ecol Resour，2014，14(1)：127-138.

[15] Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics，2007，23(21)：2947-2948.

[16] Yang A F，Zhou Z C，He C B，et al. Analysis of expressed sequence tags from body wall, intestine and respiratory tree of sea cucumber(Apostichopusjaponicus)[J]. Aquaculture，2009，296(3/4)：193-199.

[17] Pfaffl M W，Horgan G W，Dempfle L. Relative expression software tool (REST?)for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR[J]. Nucleic Acids Research，2002，30(9)：36.

[18] Chen Z，Zhou Z C，Yang A F，et al. Characterization and expression analysis of a complement component gene in sea cucumber(Apostichopusjaponicus)[J]. J Ocean Univ China，2015，14(6)：1096-1104.

[19] 高杉，董穎，王擺，等. 仿刺參銅鋅超氧化物歧化酶基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及表達(dá)分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2014，33(5)：288-294.

[20] 董穎，高杉，陳仲，等. 仿刺參profilin基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013，15(2)：159-167.

[21] Lynch N J，Roscher S，Hartung T，et al. L-ficolin specifically binds to lipoteichoic acid, a cell wall constituent of Gram-positive bacteria, and activates the lectin pathway of complement[J]. J Immunol，2004，172(2)：1198-1202.

[22] Aoyagi Y，Adderson E E，Min J G，et al. Role of L-ficolin/mannose-binding lectin-associated serine protease complexes in the opsonophagocytosis of type Ⅲ group B streptococci[J]. J Immunol，2005，174(1)：418-425.

[23] Sugimoto R，Yae Y，Akaiwa M，et al. Cloning and characterization of the Hakata antigen, a member of the ficolin/opsonin p35 lectin family[J]. J Biol Chem，1998，273(33)：20721-20727.

MolecularCharacterizationsandExpressionofFicolininSeaCucumberApostichopusjaponicus

CHEN Zhong, YANG Aifu, WANG Bai, JIANG Jingwei, GAO Shan, DONG Ying, ZHOU Zunchun

( Liaoning Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

We identified the cDNA sequence of ficolin gene from sea cucumber (Apostichopusjaponicus) through RNA-seq sequencing and RACE (rapid amplification of cDNA ends) technology, and the protein known as AjFCN had length of 1951 bp including a 397 bp 5′ untranslated region (UTR), a 666 bp 3′-UTR and an ORF of 888 bp encoding 295 amino acids. The AjFCN protein contained a typical signal peptide, two G-X-Y repetitive sequences and abrinogen-like domain (FBG). The relative expression of AjFCN gene was detected by the qRT-PCR in the intestine, respiratory tree, coelomocyte and body wall, with the maximal expression level in the intestine. After lipopolysaccharide (LPS) challenge, the expressions in intestine and body wall tissues were changed most dramatically. Furthermore, the relative expression levels of AjFCN gene in the four tissues showed different time-sequence patterns. The findings indicated that the AjFCN played an important role in the immune response of sea cucumber.

sea cucumber (Apostichopusjaponicus); ficolin; sequence analysis; gene expression; LPS challenge

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.007

Q786

A

1003-1111(2017)03-0296-07

2016-07-01；

2016-08-21.

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014203006)；遼寧省海洋與漁業(yè)廳項(xiàng)目(201605)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013J21DW025).

陳仲(1980—)，男，工程師，碩士；研究方向：海洋生物技術(shù).E-mail：ch_zhong@163.com. 通訊作者：周遵春(1967—)，男，研究員，博士；研究方向：海洋生物技術(shù).E-mail：zunchunz@hotmail.com.