朱新峰，林堅

（1.山東濟寧市第二人民醫(yī)院 普外科，山東 濟寧 272049；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 胃腸腺體外科，廣西 南寧 530012）

結直腸癌術前腹腔液不同CA125基因表達水平對手術預后的相關性研究

朱新峰1，林堅2

（1.山東濟寧市第二人民醫(yī)院 普外科，山東 濟寧 272049；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 胃腸腺體外科，廣西 南寧 530012）

目的探討結直腸癌術前腹腔液不同CA125基因表達水平與手術預后的相關性。方法收集2014年6月‐2016 年5月在山東濟寧市第二人民醫(yī)院接受手術治療的結直腸癌患者70例，納入結直腸癌組,另選擇同期行手術治療的結直腸良性疾病患者35例為對照組，兩組患者均采集腹腔液，并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術進行CA125基因檢測，分析結直腸癌患者腹腔液中CA125基因表達與臨床病理的關系，以CA125基因平均表達為界分高表達組和低表達組，比較高表達組、低表達組術后1年的復發(fā)轉移率和生存率情況。結果結直腸癌組術前腹腔液標本的CA125基因表達水平為（1.75±0.26），顯著高于對照組的（0.20±0.03）（t =35.069，P =0.000）；術后1個月結直腸癌組腹腔液標本的CA125基因表達水平為（0.38±0.07），明顯低于同組患者術前的（1.75±0.26）（t =42.569，P =0.000）；低分化、浸潤深度為T3～4、TNM分期為III～IV期、有淋巴結轉移和遠處轉移患者的術前腹腔液CA125基因表達水平明顯分別高于高-中分化、浸潤深度為T1～2、TNM分期為I～II期、無淋巴結轉移和無遠處轉移患者（P ＜0.05）；術后隨訪1年，高表達組患者復發(fā)轉移率為81.25%（26/32），明顯高于低表達組患者的39.47%（15/38）（χ2=12.494，P =0.01）；高表達組患者術后1年生存率為62.50%（20/32），明顯低于低表達組患者的89.47%（34/38）（χ2=7.168，P =0.07）。結論腹腔液CA125基因檢測可作為結直腸癌篩查的輔助方法，為患者的預后評估及進一步治療提供依據(jù)。

結直腸癌；腹腔液；CA125

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率在所有惡性腫瘤中位居第三，且近年來有增長的趨勢[1]。手術是結直腸癌的有效治療手段。但臨床約30%～40%的結直腸癌手術患者終因術后復發(fā)并腫瘤轉移而死亡[2]。因此如何在早期檢測出腹腔微轉移，降低術后復發(fā)率，評估手術預后具有重要意義。CA125是機體存在腫瘤的重要指標，其廣泛存在于乳腺癌、胃癌和結直腸癌等惡性腫瘤中，臨床上常用于消化系統(tǒng)腫瘤的輔助診斷。近10年來，隨著診斷技術進步，特別是實時熒光定量聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技術的應用，極大提高了腹腔內腫瘤切除術過程中腹腔液內微量CA125的檢出率，這為結直腸癌手術切除患者的預后評估提供了依據(jù)。本研究采用RT-PCR技術對結直腸癌患者術前腹腔液內CA125基因表達進行檢測，探討其表達水平與手術預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年6月‐2016年5月在山東濟寧市第二人民醫(yī)院接受手術治療的結直腸癌患者70例，納入結直腸癌組，其中，男45例，女25例；年齡35～86歲，中位年齡61歲；結腸癌48例，直腸癌22例；腫瘤類型：隆起型、潰瘍型和浸潤型；病理分期I期13例，II期30例，III期27例；手術方式為開腹結直腸癌根治術，術后病理檢查確診為結直腸癌；排除原發(fā)大腸癌、術前放化療、同時或既往患其他惡性腫瘤、合并急性腸梗阻或穿孔需急診手術者；診斷及分期標準按1997年國際抗癌聯(lián)盟和美國癌癥聯(lián)合會（Union for International Cancer Control,UICC）修訂標準[3]。另選擇同期行手術治療的結直腸良性疾病患者35例作為對照組，其中，男24例，女11例；年齡32～73歲，中位年齡48.9歲；結直腸腺瘤22例，結直腸息肉11例，先天性巨結腸1例，潰瘍性結腸炎1例。本實驗取材均告知患者或其家屬并征得同意,且經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會批準，兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑及設備 CA125及U6引物序列（北京豐壽實業(yè)有限公司）、RT-PCR試劑盒（武漢默克爾生物技術有限公司）、RNA提取試劑盒（RNAisoTMPlus）（北京天根生化科技有限公司）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（上海翊圣生物科技有限公司）和RNA酶蛋白質抑制劑（RNasin）（上海索萊寶科技有限公司）；紫外分光光度儀（上海奧析科學儀器有限公司）；H1-16KR型低溫高速離心機（上海松朗電子儀器有限公司）；晶芯RT-cycler RT-PCR儀（北京博奧晶典生物技術有限公司）和安捷倫2100芯片生物分析儀（中國安捷倫科技有限公司）。

1.2.2 標本采集 無腹腔積液的患者，取一根16 號導尿管留置腹腔，注入200 ml生理鹽水，輕輕攪動后吸出；有腹腔積液患者則用50 ml注射器抽出腹腔積液50 ml。采集完標本后，室溫狀態(tài)靜置30 min后，3 000 r/min離心20 min，過濾獲得沉淀并加入新的離心管，-40℃保存；結直腸癌組患者腹腔液標本分別在術前、術后1個月時采集。

1.2.3 腹腔液CA125基因檢測 ①提取RNA：根據(jù)RNAisoTMPlus試劑盒的操作方法提取腹腔液標本中總RNA；用紫外分光光度儀測定RNA并評估純度，安捷倫2100芯片生物分析儀分析RAN分子完整性；將RNA樣品置于-40℃保存。②合成cDNA 混合反應體系的建立（25 μl）：2.5 μl dNTP（10 μmol/μl）、2 μl RNasin（20 u/μl）、總 RNA 8 μg、5.5 μl無 RNA 酶 水、6 μl MMLV反轉錄酶（5 u/μl）、1 μl隨機引物（0.1 μg/ μl）、5×反轉錄緩沖液8 μl；反應條件：42℃反轉錄20 min→95℃滅活反轉錄酶5 min→4℃ 5 min。③RT-PCR反應 反應體系的建立（25 μl）：12.5 μl SYBR Green PCR預混液、8 μl無RNA酶水、2.5 μl模 板 cDNA、1 μl PCR 上 游 引 物 和 1 μl PCR下游引物；反應條件：93℃，3 min預變性，（95℃15 s；退火60℃ 20 s；72℃ 40 s）×40循環(huán)，內參基因為3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。CA125基因表達強度以GAPDH標化后的相對值表示，采用2-△△CT法計算。

1.3 術后隨訪

結直腸癌組患者術后隨訪1年，根據(jù)參考文獻資料[4]推薦的標準,結直腸癌組患者術前腹腔液的平均CA125基因表達水平為界，高于平均值者納入高表達組，低于平均值者納入低表達組；記錄高表達組、低表達組隨訪期間的復發(fā)轉移及生存情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結果中計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；中位年齡組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗；計數(shù)資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組與對照組術前腹腔液標本的CA125基因表達情況

結直腸癌組術前腹腔液標本的CA125基因表達水平為（1.75±0.26），顯著高于對照組的（0.20±0.03）（t =35.069，P =0.000）；術后 1 個 月結直腸癌組腹腔液標本的CA125基因表達水平為（0.38±0.07），明顯低于同組患者術前的（1.75±0.26）（t =42.569，P =0.000）。

2.2 術前腹腔液CA125基因表達與結腸癌患者病理特征的相關性

術前腹腔液CA125基因表達水平與結腸癌患者年齡、性別及腫瘤大小無明顯相關性（P ＞0.05）；低分化、浸潤深度為 T3～4、TNM 分期為 III～IV期、有淋巴結轉移和遠處轉移患者的術前腹腔液CA125基因表達水平明顯分別高于高-中分化、浸潤深度為 T1～2、TNM 分期為 I～II期、無淋巴結轉移和無遠處轉移的患者（P ＜0.05）。見表1。

2.3 術前腹腔液不同CA125基因表達水平結直腸癌患者的手術預后情況

結直腸癌患者術前腹腔液平均CA125基因表達水平為1.74，術前腹腔液CA125基因表達水平 ≥1.74患者32例，納入高表達組；38例術前腹腔液CA125基因表達水平＜1.74的患者，納入低表達組；術后隨訪1年，高表達組患者復發(fā)轉移率為81.25%（26/32），明顯高于低表達組患者的39.47%（15/38）（χ2=12.494，P =0.01）；高表達組患者術后1年生存率為62.50%（20/32），明顯低于低表達組患者的89.47%（34/38）（χ2=7.168，P =0.07）。

表1 術前腹腔液CA125基因表達與結腸癌患者病理特征的相關性 （±s）

表1 術前腹腔液CA125基因表達與結腸癌患者病理特征的相關性 （±s）

項目 例數(shù) CA125基因表達 t值 P值年齡/歲≤61 37 1.77±0.28 0.783 0.902＞61 33 1.71±0.36性別男34 1.76±0.30 0.737 0.937女36 1.70±0.38大小≤3 cm 42 1.69±0.30 1.278 0.832＞3 cm 28 1.79±0.35分化程度高-中分化 40 1.57±0.31 5.284 0.000低分化 30 1.99±0.34浸潤深度T1～2 43 1.18±0.25 16.732 0.000 T3～4 27 2.53±0.43 TNM分期I～II期 44 1.32±0.29 12.623 0.000 III～IV 期 26 2.45±0.46淋巴結轉移是21 2.30±0.38 12.781 0.000否49 1.22±0.30遠處轉移是11 2.86±0.49 18.207 0.000否59 1.08±0.25

3 討論

結直腸癌手術后復發(fā)轉移是引起患者預后不良的重要因素[5]。腹膜是結直腸癌常見的轉移部位，據(jù)調查報道，結直腸癌患者中約有30%～40%存在術后腹膜的復發(fā)轉移[6]。腹腔內殘留癌細胞和殘余微小轉移灶是術后早期腹膜轉移的主要形式[7]，且目前影像學手段難以檢出。因此需尋找一種預測結直腸癌患者是否存在腹膜轉移的方法，以便準確評估其手術預后并盡早采取有效的干預措施，對改善其手術預后，提高生存率具有較高的臨床價值。對腹腔液進行脫落細胞學檢查可以發(fā)現(xiàn)游離癌細胞，從而判斷結腸癌細胞的腹膜轉移情況。然而腹腔液細胞數(shù)量極少，且癌細胞的形態(tài)學多已出現(xiàn)改變，易與炎性細胞、腹腔內皮細胞相混淆，因此假陰性較高，敏感度較低[8]。

PCR可對樣品內的目標基因進行擴增，有較高的靈敏度和特異度，目前在多種疾病診斷中均有應用。CA125是一種黏液性糖蛋白，作為腫瘤標記物，能用于乳腺腫瘤、消化道腫瘤等腫瘤的良惡篩查，還能用來評估術后的療效。有研究證實，結直腸患者腹腔液存在CA125基因的表達，可能是由于血中CA125基因滲入腹腔或是由于突破腹膜間皮屏障進入腹腔的腫瘤細胞死亡破裂后將CA125基因釋放入腹腔[9]。向德雨等[10]研究發(fā)現(xiàn)，RT-PCT檢測腹腔液中CA125基因表達對結直腸癌腹膜微轉移的檢出率明顯高于脫落細胞學檢查。

本研究對結直腸癌患者腹腔液CA125基因表達采用RT-PCR技術檢測，發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組術前腹腔液標本的CA125基因表達水平顯著高于對照組患者（P ＜0.05），提示對腹腔液CA125基因表達進行RT-PCR檢測可輔助結直腸癌的篩查。同時發(fā)現(xiàn)，術后1個月結直腸癌組腹腔液標本的CA125基因表達水平明顯低于同組患者術前水平（P ＜0.05），其原因可能是結直腸癌灶切除后，癌旁組織或正常組織及可能殘留的癌細胞極少，致使CA125基因減少，從而釋放進入腹腔的CA125基因也減少；另外在癌灶切除后，免疫功能恢復，致使殘留腫瘤細胞對CA125基因表達降低。因此通過術后1個月復查腹腔液CA125基因表達水平可進一步了解術后腫瘤殘留及機體免疫功能恢復情況。

有研究報道，結直腸癌腹腔轉移與其分化程度及浸潤深度有關，且常發(fā)生在結腸癌晚期；患者術前腹腔液CA125基因表達與腫瘤的病理特征密切相關[11]。本研究結果顯示，結直腸癌患者術前腹腔液CA125基因表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移及遠處轉移有關，這與上述研究結果相符，提示腹腔液CA125基因表達對結腸癌的診斷及預后評估具有積極意義。本研究對結腸癌患者術后進行1年隨訪，發(fā)現(xiàn)術前腹腔液CA125基因高表達患者術后1年復發(fā)轉移率明顯高于低表達者，生存率明顯低于低表達者，說明結直腸癌患者術前腹腔液CA125基因檢測可判斷其是否存在腹腔播散，其可作為結直腸癌患者預后的評估指標，為臨床醫(yī)生制定針對性治療提供依據(jù)。

盡管結直腸癌患者腹腔液CA125基因檢測的靈敏度高于脫落細胞學檢查，但其特異性仍不高，故有一定的假陽性。且以腹腔液CA125基因檢測來評估結直腸癌患者術后復發(fā)轉移及生存率，還需更多的隨機對照研究證實?？偠灾?，腹腔液CA125基因檢測可作為結直腸癌篩查的輔助方法，為患者的預后評估及進一步治療提供依據(jù)。

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R735.35；R735.37

B

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.10.021

2017-06-23

（劉東京 編輯）