宋秋靈

（山東省菏澤市立醫(yī)院 耳鼻喉科，山東 菏澤 274000）

增強型胸苷激酶基因表達載體的構建及其殺傷性的研究進展

宋秋靈

（山東省菏澤市立醫(yī)院 耳鼻喉科，山東 菏澤 274000）

目的探討人端粒酶催化亞單位（hTERT）啟動子及巨細胞病毒原核（CMV）增強子聯(lián)合調(diào)控胸苷激酶基因增強型表達載體的改良構建及其在殺傷鼻咽癌細胞中的效應與安全性評價。方法對鏈接hTERT啟動子及CMV增強子、胸苷激酶基因進行酶切（模板為pGL3空載體），以構建增強型表達載體；選取hTERT啟動子單調(diào)控胸苷激酶基因的表達載體作為對照組。另選用人鼻咽癌細胞（端粒酶陽性，實驗組）、人乳腺癌細胞（對照組）及正常人臍靜脈內(nèi)皮細胞（端粒酶陰性）為標本，分別對其采用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達、聚合酶鏈式反應（PCR）檢測胸苷激酶基因mRNA的表達、Telochaser法檢測細胞端粒酶活性，同時分析鼻咽癌細胞增殖及抑制受增強型載體的影響作用。結果hTERT啟動子及CMV增強子對胸苷激酶基因的增強型表達載體進行聯(lián)合調(diào)控，可以成功改良構建；通過熒光顯微鏡下觀察顯示人鼻咽癌細胞和人乳腺癌細胞均有熒光表達，但后者較前者在表達數(shù)量及強度方面有所加強，且對照組的人乳腺癌細胞亦有熒光表達存在，但ECV-304細胞無熒光表達。在PCR定量檢測方面，結果顯示增強型載體組（實驗組）的胸苷激酶基因mRNA的表達量顯著強于對照組的單啟動載體（P ＜0.05）。在細胞端粒酶活性方面，ECV-304細胞為陰性，腫瘤細胞端粒酶活性均為陽性。四甲基偶氮唑藍（MMT）檢測結果顯示，增強型載體組可明顯抑制鼻咽癌細胞的體外增殖，其細胞存活率較對照組顯著降低（P ＜0.05）。動物體內(nèi)實驗結果顯示改良重建的增強型載體對裸鼠鼻咽癌移植瘤生長具有明顯抑制作用（抑瘤率為56.5%），顯著高于單啟動子載體組（抑瘤率為43.3%）（P ＜0.05）；實驗組與其他對照組抑瘤率比較差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。實驗組裸鼠肝腎病理檢查顯示，肝、腎組織結構正常，均無明顯損害。結論以hTERT啟動子及CMV增強子對胸苷激酶基因的增強型表達載體進行聯(lián)合調(diào)控，成功改良構建后能夠靶向及高效地殺傷鼻咽癌細胞及體外移植瘤，且應用后在動物模型體內(nèi)未見明顯的毒副反應。

鼻咽癌；胸苷激酶基因；端粒酶；巨細胞病毒原核

腫瘤的靶向基因治療是當今腫瘤治療研究的熱點與難點，也是日后腫瘤治療研究尤其是基因治療研究的主導方向。從當前的腫瘤基因靶向治療原則出發(fā)，治療時采用理想型的腫瘤靶向治療載體應當具備殺瘤細胞作用強及靶向性高的特點。國內(nèi)外的實驗研究及相關文獻報道指出[1-2]，以人端粒酶催化亞單位（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）作為單啟動子來調(diào)控胸苷激酶基因（thymidine kinase,TK）的腫瘤特異表達系統(tǒng)，能夠在體外特異性殺傷鼻咽癌細胞及體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長，且對實驗動物無明顯毒副作用。這一結果顯示出了hTERT/TK/pGL3載體系統(tǒng)的優(yōu)勢，但是筆者在實驗中及文獻報道中發(fā)現(xiàn)，hTERT啟動子調(diào)控TK基因的靶向載體雖然具有較好的靶向性，但其殺傷腫瘤細胞的效應要比巨細胞病毒原核（cytomegalovirus,CMV）增強子調(diào)控TK基因的非靶向性載體明顯偏弱，即hTERT/TK/pGL3載體系統(tǒng)存在對腫瘤細胞殺傷力不強的缺點。為此，筆者在實驗中嘗試對原有載體系統(tǒng)（hTERT/TK/pGL3）進行改良重建，在保證載體具有良好靶向性的前提下，引入一個CMV增強子，即hTERT/CMV雙調(diào)控TK基因的增強型靶向表達載體，以從理論上彌補原有靶向載體系統(tǒng)的不足。因此，為進一步探討這種改良后的增強型載體系統(tǒng)的腫瘤系統(tǒng)殺傷效應，開展本研究。本研究中為能方便地檢測胸苷激酶基因的載體轉染率及蛋白表達率，將綠色熒光報告基因EGFP連接入改良重建后的增強型表達載體中，即胸苷激酶基因與EGFP基因融合表達（pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV）?，F(xiàn)將本研究綜合報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

實驗標本：人鼻咽癌5-8F細胞、人血管內(nèi)皮細胞ECV-304和乳腺癌BT474細胞（均由山東大學微生物技術國家重點實驗室提供）。

實驗質粒：pGL3.Basic.EGFP-TK-hTERTp-CMV、pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp和 pGL3.basic（均由深圳大學醫(yī)學院納米磁實驗室提供）。

實驗試劑：RNA提取試劑Trizol（Invitrogen）、更昔洛韋（GCV,ROCH）；Boyden小室（Chemicon）；四甲基偶氮唑藍（Sigma 美國）；端粒酶活性檢測試劑盒（上海賢綿生物科技有限公司）；脂質體Lipofectamine 2000（上海素爾生物科技有限公司）；胸苷激酶基因、hTERT啟動子及CMV增強子聚合酶鏈式反應 （polymerase chain reaction,PCR）引物（由上海英駿公司合成）。

實驗動物：5～6周齡的健康SPF級裸鼠（BALB/cnu/nu），雌雄不限，體重16～25 g（來自復旦大學實驗動物中心）。

實驗儀器：離心機（上海安亭科學儀器廠）、超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）、熒光顯微鏡（NIKON ECLIPSE E2000，日本尼康）、電子分析天平（湖南湘儀天平廠）、恒溫箱（GRANT，德國）和培養(yǎng)板（Corning，美國）。

增強型靶向載體的改良構建：①分析pEGFP-N1質粒信息后發(fā)現(xiàn)，在EGFP基因編碼序列中，pGL3載體上的luc基因(熒光素酶)可通過Hind III和Xba I置換掉；而CMV增強子序列則可以通過BamH I和Sal I酶切位點將其連接入pGL3-basic中。②分析NCB I上已經(jīng)提交的胸苷激酶基因序列，發(fā)現(xiàn)胸苷激酶基因可以通過XhoI和Hind III酶切位點插入，同時對NCB I上的hTERT基因序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，hTERT基因啟動子序列（hTERTp）可通過KpnI和XhoI酶切位點插入。這樣就可以使胸苷激酶基因與EGFP基因完全融合。③以pEGFP-N1質粒為模板，通過PCR擴增出CMV及EGFP基因序列，分別構建出pGL3-CMV載體及pGL3-GFP載體。以pMDl8-T-hTERTp質粒為模板，通過PCR擴增出胸苷激酶基因及hTERT基因啟動子序列，分別構建出pGL3-TK載體及pGL3-hTERTp載體。④分別對新構建出的載體進行酶切，分別酶切下CMV增強子基因片段及胸苷激酶基因、hTERTp基因，分別連接入pGL3-EGFP載體中從而得到單啟動子載體（pGL3-EGFP-TK-hTERTp）及增強型載體（pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV）。

1.2 方法

1.2.1 熒光蛋白表達分析及熒光定量PCR檢測基因mRNA的表達水平 常規(guī)培養(yǎng)人鼻咽癌細胞、人乳腺癌細胞及正常人臍靜脈內(nèi)皮細胞，用Lipo2000轉染質粒pGL3-EGFP-TK-hTERTp、pGL3-EGFP及 pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV，每孔DNA用量、細胞數(shù)均保持一致。轉染24 h后，在熒光顯微鏡下直接觀察EGFP的表達差異；48 h后用熒光定量PCR檢測胸苷激酶基因mRNA的表達水平。檢測結束后，計算各組A值，并進行統(tǒng)計學檢驗。

1.2.2 端粒酶的活性檢測 取對數(shù)生長期的人鼻咽癌細胞、乳腺癌細胞及正常人臍靜脈內(nèi)皮ECV-304細胞接種到6孔培養(yǎng)板中，每種細胞1孔（1、2、3），采用TeloChaser法對3孔細胞進行端粒酶活性檢測。

1.2.3 Boyden小室試驗 ①將Matrigel用4℃的無血清培養(yǎng)基稀釋（終濃度為0.8 g/L），使得每個Boyden小室含有100 μl溶液含量，分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上，在4℃環(huán)境下風干。②取實驗組轉染增強型載體加GCV預處理48 h后的人鼻咽癌細胞和對照組(未做任何處理)人鼻咽癌細胞加入上室（依據(jù)細胞數(shù)1×105/200 μl的比例），另取含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基500 μl加入下室，孵育24 h。③用棉簽將膜上未侵襲的細胞以及人工基底膜膠擦凈，進行下室面固定，而后進行結晶紫染色，在顯微鏡下觀察每張膜的任意5個視野，每組設3個平行樣本。④觀察400倍顯微鏡視野下的穿膜細胞數(shù)，取其平均值，進行統(tǒng)計學分析。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）實驗分析 ①將處于對數(shù)生長期內(nèi)的人鼻咽癌細胞接種到細胞培養(yǎng)板中（96孔，1×105/孔），設置6個復孔；②接種12 h后對細胞培養(yǎng)板中的人鼻咽癌細胞進行轉染，轉染實驗共設立5組（分別為對照組A：細胞無處理；對照組B：空載體+GCV；對照組C：單啟動子載體+GCV；對照組D：增強型載體無GCV；實驗組：增強型載體+GCV）；③轉染實驗72 h后進行MTT實驗；④計算分析相關數(shù)據(jù)：首先計算細胞存活率，而后計算相對細胞存活率，最終結果以相對細胞存活率表示。

1.2.5 體內(nèi)實驗 取裸鼠30只，飼養(yǎng)于SPF級無菌飼養(yǎng)室，自由攝取食物和水，取對數(shù)生長期鼻咽癌細胞，制成單細胞懸液，裸鼠左側腋部皮下注入鼻咽癌細胞進行接種。接種后第10天，當絕大多數(shù)腫瘤直徑達1.2～1.5 cm時，依據(jù)不同的處理方法將荷瘤裸鼠分成6組：不作干預（空白對照組）；腹腔注射GCV（陰性對照組A）；瘤內(nèi)注射脂質體，腹腔注射GCV（陰性對照組B）；瘤內(nèi)注射增強型載體+脂質體（陰性對照組C）；瘤內(nèi)注射單啟動子載體+脂質體，腹腔注射GCV（陽性對照組）；瘤內(nèi)注射增強型載體+脂質體，腹腔注射GCV（實驗組）。觀察6組移植瘤的生長情況，待空白組的腫瘤體積達到約6 cm3時，停止實驗，斷頸處死裸鼠，完整剝離腫瘤，稱重，計算抑瘤率（%）=（空白組瘤塊質量-治療組瘤塊質量）/空白組瘤塊質量×100%。同時，取實驗組裸鼠肝臟、腎臟組織，經(jīng)10%的甲醛固定，送病理檢查。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性，兩組計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組計量資料組間比較采用方差分析，其中兩組計量資料比較采用Dunnet-t法；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡下觀察胸苷激酶基因綠色熒光蛋白表達

通過熒光顯微鏡下觀察顯示人鼻咽癌細胞和人乳腺癌細胞均有熒光表達，但后者較前者在表達數(shù)量及強度方面有所加強，且對照組的人乳腺癌細胞亦有熒光表達存在，但正常對照的ECV-304細胞無熒光表達。

2.2 熒光定量PCR檢測胸苷激酶基因mRNA表達

在PCR定量檢測方面，結果顯示增強型載體組（實驗組）的胸苷激酶基因mRNA的表達量顯著強于對照組的單啟動載體，比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.3 端粒酶活性檢測結果

在細胞端粒酶活性方面，ECV-304細胞為陰性，腫瘤細胞端粒酶活性均為陽性。

2.4 MTT檢測結果

轉染增強型載體后的鼻咽癌細胞的生長被抑制，相對細胞存活率為（36.8±2.1）%，與啟動子對照組相比較，增強型載體組可明顯抑制鼻咽癌細胞的體外增殖，其細胞存活率較對照組顯著降低，實驗組與對照組Hep-G2細胞存活率比較差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 MTT法對雙調(diào)控增強型載體聯(lián)合前體藥物殺傷鼻咽癌細胞存活率情況

2.5 Boyden小室侵襲實驗結果

增強型載體對鼻咽癌細胞的侵襲力有明顯抑制作用；經(jīng)增強型載體處理的鼻咽癌細胞的樣本高倍鏡視野下平均穿膜細胞數(shù)為（20.2±2.3）個，而未處理的鼻咽癌細胞的樣本高倍鏡視野下平均穿膜細胞數(shù)為（63.6±1.3）個，兩組平均穿模細胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.6 動物體內(nèi)實驗結果

改良重建的增強型載體對裸鼠鼻咽癌移植瘤生長具有明顯抑制作用（抑瘤率為56.5%），顯著高于單啟動子載體組（抑瘤率為43.3%）（P ＜0.05）；實驗組與其他對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。實驗組裸鼠肝腎病理檢查顯示，肝、腎組織結構正常，均無明顯損害。見表2。

表2 各組Hep-G2細胞接種裸鼠39 d后腫瘤平均質量及抑瘤率

3 討論

腫瘤分子靶向治療是當前腫瘤治療研究方面最具前景的方向，既往在臨床上廣泛應用的自殺基因因其殺傷細胞作用沒有選擇性容易引起諸多并發(fā)癥，導致其在臨床上進一步應用受到明顯限制[3-4]。鑒于此，采用腫瘤特異性啟動子調(diào)控自殺基因的分子靶向系統(tǒng)便成為治療腫瘤的一種新方法。但在不影響載體的靶向性的前提下，如何選擇調(diào)控元件，以提高該載體的抑瘤效應成為當前腫瘤靶向研究的一個熱點。既往的實驗研究和相關文獻報道[5-6]，已經(jīng)解決了應用單啟動子靶向載體的靶向性問題，但因其抑瘤效應較低，使其應用仍然受到一定的限制。故而尋求一種既具有良好靶向性又具有良好抑瘤效應的載體系統(tǒng)迫在眉睫。國內(nèi)一項研究通過構建hTERT啟動子控制皰疹病毒胸苷激酶基因腫瘤特異表達載體（AdhTERT/TK），結果顯示，該腫瘤的特異性表達載體不僅對未分化甲狀腺癌及其移植瘤具有殺傷作用，還能使GCV對該腫瘤的敏感性增強，從而提升治療效果[7]。同時有研究還顯示該腫瘤特異表達系統(tǒng)，在靶向殺傷腫瘤細胞的同時對正常組織無影響。此外，hTERTp啟動子還可組合一些腫瘤殺傷因子形成新的腫瘤特異性表達載體，以發(fā)揮對腫瘤細胞凋亡的特異性誘導作用[8-9]。所以針對這種組合構建，相關研究顯示，分別構建TRAIL及Bax等腫瘤特異表達載體后，除了能增強藥物對腫瘤細胞的敏感性，提高治療效果，還能靶向性殺傷腫瘤細胞并誘導其進一步凋亡，且對正常組織無明顯影響[10-13]。諸如上述研究，不僅開拓了腫瘤靶向基因治療的新領域，還為后續(xù)的研究奠定了基礎。但從諸多文獻報道結果來看，單純用hTERT啟動子介導各種基因載體的抑瘤效率并不高，這也成為制約腫瘤基因靶向治療研究的難點與瓶頸[14-15]。因此，如何提高靶向載體的殺瘤效率是當前研究的關鍵。

針對這一研究難點與瓶頸，國內(nèi)外文獻已有采用hTERT啟動子介導雙基因等方法來提高載體抑瘤率的報道。如徐岷等[16]采用hTERT啟動子及SV40增強子對胸苷激酶基因的SB系統(tǒng)進行調(diào)控，能夠對鼻咽癌細胞進行選擇性殺滅。李少一等[17]采用的腺病毒介導的TK/CD雙自殺基因表達系統(tǒng)能在體外較高效地殺傷乳腺癌細胞?；谏鲜鰣蟮兰跋嚓P研究，筆者嘗試對原有載體系統(tǒng)（hTERT/TK/pGL3）進行改良重建，在保證載體具有良好靶向性的前提下，引入一個CMV增強子，即hTERT/CMV雙調(diào)控TK基因的增強型靶向表達載體，以從理論上彌補原有靶向載體系統(tǒng)的不足。本研究從此理論基礎出發(fā)，結果顯示改良構建后的增強型胸苷激酶基因表達載體在鼻咽癌細胞中高效表達，且表達效率是單啟動子載體的5倍。結合Boyden小室侵襲實驗及動物實驗結果，增強型載體組對鼻咽癌細胞的體外增殖具有明顯的抑制殺傷作用，對裸鼠移植瘤亦具有明顯的體內(nèi)抑制作用，這些均明顯強于單啟動子載體組（P ＜0.05）。在不良反應方面，通過裸鼠肝腎病理檢查顯示，均無明顯毒副作用表現(xiàn)。

綜上所述，以hTERT啟動子及CMV增強子對胸苷激酶基因的增強型表達載體進行聯(lián)合調(diào)控，成功改良構建后能夠靶向及高效地殺傷鼻咽癌細胞及體外移植瘤，且應用后在動物模型體內(nèi)未見明顯的毒副反應。改良后的增強型靶向載體抑瘤作用顯著提高，且載體的靶向性并無改變，體內(nèi)應用具有一定安全性。本研究中增強型胸苷激酶基因載體的成功構建及其基因分子與動物實驗研究為進一步惡性腫瘤靶向治療提供依據(jù)。

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Construction of enhanced thymidine kinase gene expression vector and its experimental study on killing efficiency

SONG Qiuling
(Department of Otorhinolaryngology,Heze Municiple Hospital of Shandong Province,Heze,Shandong 274000,China)

【Objective】To investigate the improved construction of enhanced expression vector of hTERT promoter combined with cytomegalovirus (CMV) enhancer for regulating thymidine kinase gene,and the effect and safety evaluation of killing nasopharyngeal carcinoma cells.【Methods】Link hTERT promoter,CMV enhancer and thymidine kinase gene were digested(template for pGL3 empty vector) to construct enhanced expression vector; the expression vector of thymidine kinase gene controlled by hTERT promoter was selected as the control group.Human nasopharyngeal carcinoma cells (telomerase positive,research group),human breast cancer cells (control group) and normal human umbilical vein endothelial cells (telomerase negative) were selected as samples,fluorescence microscopy was used to observe the expression of fluorescent protein,the expression of thymidine kinase gene mRNA was detected by polymerase chain reaction (PCR),and telomerase activity was detected by Telochaser assay,at the same time,the effect of enhanced vector on the proliferation and inhibition of nasopharyngeal carcinoma cells was analyzed.【Results】hTERT promoter and CMV enhancer for regulating the expression vector of thymidine kinase gene could be successfully constructed;human nasopharyngeal carcinoma cells and breast cancer cells had fluorescence expression under fluorescence microscopy,and the latter was strengthened in expression number and expression intensity,there was fluorescence expression in human breast cancer cells in the control group,but no fluorescence expression in ECV-304 cells.In the quantitative detection of PCR,the results showed that the expression of thymidine kinase gene mRNA in the enhanced vector group was significantly stronger than that in the control group,and the difference was statistically significant (P＜0.05).In the telomerase activity of cells,ECV-304 cells were negative,and tumor cells were positive; the results of MMT detection showed that the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro was significantly inhibited in enhanced vector group,and the cell survival rate was significantly lower than that in the control group,the difference was statistically significant (P＜0.05).At the same time,in the in vivo experiment of nasopharyngeal carcinoma cells,enhanced vector also showed a significant inhibitory effect on the transplantation tumor of nasopharyngeal carcinoma,and the tumor inhibition rate of enhanced vector group was significantly higher than that of the control group (P＜0.05).The differences in the tumor inhibition rate between the research group and other control groups were statistically significant (P＜0.05).The pathological examination of liver and kidney of nude mice in the research group showed normal tissue structure of liver and kidney without significant damage.【Conclusion】The improved construction of hTERT promoter and CMV enhancer for regulating the expression vector of thymidine kinase gene,can successfully targetedly and efficiently kill nasopharyngeal carcinoma cells and transplantation tumors in vitro,and there were no obvious side effects on animal models.

nasopharyngeal carcinoma; thymidine kinase gene; telomerase; cytomegalovirus

R739

A

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.10.005

2017-01-19

（胥洪娟 編輯）