桑鋒鋒，高 洋，張洪杰，朱偉英，王 毅，陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

IL-17單克隆抗體的制備與鑒定

桑鋒鋒，高 洋，張洪杰，朱偉英，王 毅，陳德坤*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

為制備山羊IL-17單克隆抗體，誘導(dǎo)重組菌 rIL-17-pET32a-TransB(DE3)表達(dá)山羊IL-17重組蛋白(rIL-17)，純化后免疫BALB/c小鼠，取免疫合格的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接ELISA方法篩選陽性克隆細(xì)胞株。對獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體組型分析，并對其分泌的IL-17單克隆抗體進(jìn)行抗體特異性、抗體類別等分析。結(jié)果顯示，成功獲得了純化的山羊IL-17原核表達(dá)產(chǎn)物；篩選到1株能特異性分泌山羊IL-17單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株-B6,其分泌的單克隆抗體亞型為IgG1，抗體輕鏈為κ。

山羊；IL-17單克隆抗體；雜交瘤細(xì)胞；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

白細(xì)胞介素17(IL-17)是一種主要由IL-17+淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，它通過誘導(dǎo)IL-6、IL-8和TNFα等細(xì)胞因子的釋放，募集中性粒細(xì)胞至炎癥部位，介導(dǎo)清除炎癥部位的病原微生物。因此，IL-17在機(jī)體抵抗細(xì)胞外寄生菌如大腸桿菌、鼠類檸檬酸桿菌、白色念珠菌等的感染中發(fā)揮著重要作用[1-3]。進(jìn)一步的研究指出，IL-17在抗病毒感染中也發(fā)揮著重要作用[4]。不僅如此，IL-17也是機(jī)體病理性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性介導(dǎo)者[5]。目前，有關(guān)IL-17在山羊機(jī)體抗感染免疫、山羊炎癥反應(yīng)中的作用還很不清楚。本研究開展山羊IL-17單克隆抗體研發(fā)，以期為IL-17在山羊疾病中發(fā)揮的作用機(jī)理研究提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞 雌性Balb/c小鼠，6周齡～8周齡，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；山羊rIL-17-pET-32a-TransB(DE3)重組菌，cIL-17-pEGFP-N1質(zhì)粒，SP2/0細(xì)胞，西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、小鼠抗體亞型鑒定試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為Sigma公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購自天根生化科技有限公司；Ni-NTA瓊脂糖凝膠鎳柱購自北京全士金生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；酶標(biāo)板為Castor公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 rIL-17蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將重組菌在Amp+/kan+的LB固體培養(yǎng)基上劃板復(fù)蘇，挑取單個菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體，10 000 r/min 離心1 min，用PBS重懸菌體，在冰水上超聲破碎至澄清，12 000 r/min離心30 min，收集上清。取上清過鎳柱，用80 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，500 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。收集目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定并測定濃度。

1.2.2 IL-17的真核表達(dá) 將cIL-17-pEGFP-N1及pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞上清。

1.2.3 動物免疫 取4只7周齡雌性Balb/c小鼠，將抗原按50 μg/只的劑量與等體積的弗氏佐劑充分乳化后腹部皮下多點(diǎn)注射，每隔2周加強(qiáng)免疫一次。第3次免疫7 d后，摘眼球法采集免疫小鼠血清，此為免疫血清(陽性血清)。另采集未免小鼠血清，作為陰性血清。

1.2.4 小鼠血清效價的檢測 3次免疫后第7天，尾靜脈采血，按照實(shí)驗(yàn)室之前建立的ELISA檢測方法測定小鼠血清效價，選擇抗體效價大于1∶50 000的小鼠，尾靜脈注射50 μg/只的水劑抗原沖擊免疫，3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合[6]。ELISA方法操作如下：用pH9.6、0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋抗原終濃度為10 μg/mL，4℃包被12 h；50 g/L脫脂奶粉37℃封閉1 h；小鼠血清用PBST進(jìn)行 1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀釋，100 μL/孔，37℃孵育1 h；羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗1∶5 000稀釋，100 μL/孔，37℃孵育1 h；TMB顯色15 min，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀，讀取OD450nm值。待測孔OD450nm值(P)比陰性對照孔OD450nm值(N)大于或等于2.1(即P/N≥2.1)時，待測孔判為陽性孔。

1.2.5 細(xì)胞融合與篩選 取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行細(xì)胞融合，用間接ELISA法進(jìn)行篩選。有限稀釋法克隆3次后，逐級擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.6 單克隆抗體制備及特異性鑒定 采用小鼠腹腔誘導(dǎo)腹水制備單克隆抗體[7],同時對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及小鼠腹水與293T細(xì)胞分泌的IL-17、pEGFP-N1空載體真核轉(zhuǎn)染培養(yǎng)上清K進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)。

1.2.7 雜交瘤細(xì)胞染色體組型分析 重懸生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入含終濃度0.2 μg/mL秋水仙素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h；1 000 r/min離心8 min，棄上清，加入37℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl溶液8 mL，低滲處理20 min；加入2 min先配置的固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，預(yù)固定2 min；棄上清，加入8 min固定液，靜止固定20 min，1 000 r/min離心8 min，棄上清(固定)。固定好的細(xì)胞懸液視細(xì)胞多少留下0.5 mL～1 mL的固定液，懸浮細(xì)胞，在-20℃預(yù)冷的載玻片上垂直滴加1～2點(diǎn)，自然陰干。Gimsa法染色20 min后油鏡鏡檢[8]。

1.2.8 單克隆抗體亞型鑒定 采用Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit進(jìn)行鑒別。取雜交瘤細(xì)胞及小鼠腹水，用pH7.2的PBS做1∶10稀釋；取稀釋液200 μL加入試驗(yàn)管中，室溫靜止30 s，將Isotrip膠體金試紙插入管底，10 min后取出，觀察結(jié)果。

1.2.9 單克隆抗體穩(wěn)定性試驗(yàn) 將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代3次并凍存后復(fù)蘇，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測抗體效價確定其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 山羊rIL-17蛋白的表達(dá)及純化

山羊rIL-17蛋白的分子質(zhì)量大約為33 ku～35 ku，經(jīng)鎳柱純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1，純化后的蛋白分子質(zhì)量約為34 ku，與理論值相符，目的蛋白純度高，雜蛋白較少。蛋白濃度為2 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ; 1.空載體誘導(dǎo)表達(dá)上清; 2.重組菌未誘導(dǎo)表達(dá)上清; 3.未純化的山羊rIL-17; 4.純化的山羊rIL-17

M.Protein molecular weight Marker; 1.Soluble products of the induced PET 32a expressing vector; 2.Soluble products of the no-induced recombinant expressing cells (unpurified); 3.The unpurified goat IL-17 protein; 4.The purified goat IL-17 protein

圖1純化rIL-17蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果

Fig.1 SDS-PAGE detection of purified rIL-17 protein

2.2 三免后Balb/c小鼠血清抗體水平ELISA檢測結(jié)果

三免后第7天，對小鼠斷尾采血，進(jìn)行ELISA檢測血清效價，2號小鼠和4號小鼠的血清抗體效價在30 000左右，1號小鼠和3號小鼠的血清抗體效價在60 000左右，取1號小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

沖擊免疫后，取小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液與SP2/0瘤細(xì)胞融合，以重組IL-17蛋白、pET-32a融合標(biāo)簽蛋白(包括Trx·Tag、S·Tag、His·Tag)為包被抗原，通過間接ELISA篩選到2株(B6，H8)識別重組IL-17蛋白的單克隆抗體(表1)。

表1 抗山羊rIL-17單克隆抗體的篩選結(jié)果

2.4 雜交瘤細(xì)胞的特異性鑒定

以293T細(xì)胞分泌的IL-17(F)、空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清k為包被抗原，通過間接ELISA方法，檢測發(fā)現(xiàn)在這2株單抗中有1株(B6)能特異性識別293T細(xì)胞表達(dá)的IL-17，對k不識別(表2)。

2.5 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目分析

SP2/0細(xì)胞染色體數(shù)目為62～68條，而正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為40條，所得雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)為102～108條。抗山羊rIL-17單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為104條，符合融合后細(xì)胞的染色體數(shù)目。

表2 抗山羊rIL-17單克隆抗體的特異性檢測結(jié)果

圖2 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目分析

2.6 單克隆抗體亞型的鑒定

B6株單抗經(jīng)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit 檢測后，確定其抗體亞型為IgG1，輕鏈類型為κ。

圖3 雜交瘤細(xì)胞亞型鑒定

2.7 單抗穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測

將陽性雜交瘤細(xì)胞B6株連續(xù)傳代3次，凍存復(fù)蘇后ELISA檢測細(xì)胞上清抗體效價，結(jié)果基本不變，說明雜交瘤細(xì)胞B6株具有一定的穩(wěn)定性。

3 討論

IL-17作為一種主要的炎癥因子，可以誘導(dǎo)多種與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、趨化因子及抗菌肽的產(chǎn)生，在機(jī)體的宿主防御過程中發(fā)揮重要作用。本研究以原核表達(dá)的山羊rIL-17為抗原，免疫Balb/c小鼠，進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得能分泌特異性識別原核表達(dá)的山羊rIL-17抗體的雜交瘤細(xì)胞。同時，該細(xì)胞株分泌的抗體能特異性識別293T細(xì)胞分泌的IL-17，表明本研究獲得了能特異性識別山羊IL-17的單克隆抗體，對后續(xù)羊口瘡、山羊乳房炎、羊痘等疾病的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

制備山羊IL-17單克隆抗體，對IL-17蛋白的要求較高。純化的天然IL-17無論用于免疫還是包被抗原都是最理想的抗原，但是天然的IL-17表達(dá)量低，純化難度較大，可行性較差。用原核表達(dá)的山羊rIL-17為免疫抗原，主要基于其可大量獲得，純化簡單[9]。但由于原核表達(dá)載體標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，其分子質(zhì)量與天然IL-17蛋白分子質(zhì)量大小差距不大，免疫小鼠可激活針對標(biāo)簽蛋白B細(xì)胞表位的B細(xì)胞 ，這加大了后續(xù)單抗的篩選工作量。本試驗(yàn)在用原核表達(dá)的rIL-17篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用293T細(xì)胞分泌的IL-17復(fù)篩，減少了工作量，篩選到一株能同時識別原核表達(dá)及真核轉(zhuǎn)染IL-17的細(xì)胞株。但這株雜交瘤分泌的單抗對山羊IL-17是否具有中和作用，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中，會出現(xiàn)部分細(xì)胞返祖的現(xiàn)象，因此，在進(jìn)行細(xì)胞融合前，用8-AG處理SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，以維持瘤細(xì)胞對HAT選擇培養(yǎng)基的均一敏感狀態(tài)。在成功融合的雜交瘤細(xì)胞中，能夠分泌抗體的細(xì)胞一般生長較慢，沒有競爭優(yōu)勢，可能會隨著傳代次數(shù)的增加而丟失，因此，融合后應(yīng)盡快對陽性孔內(nèi)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化處理，制備單一的細(xì)胞群體。

染色體是基因的載體，當(dāng)兩種不同性狀的細(xì)胞融合后，染色體數(shù)目及形態(tài)都可能發(fā)生變化，一般在數(shù)目上接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和。雜交瘤細(xì)胞染色體的穩(wěn)定對于維持其增殖能力、分泌特異性抗體十分重要[10]。正常小鼠的染色體數(shù)目是40條，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目是62～68條，新生成的雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)為102～108條，本研究通過染色體組型分析，發(fā)現(xiàn)分泌山羊IL-17抗體的雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為104條，說明細(xì)胞融合成功，兩種細(xì)胞的染色體融合在一起，產(chǎn)生了新的遺傳性狀。

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PreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodiesagainstGoatInterleukin-17

SANG Feng-feng,GAO Yang,ZHANG Hong-jie,ZHU Wei-ying,WANG Yi,CHEN De-kun

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100，China)

To prepare IL-17 monoclonal antibody (IL-17 McAb) of goat,the expression vector rIL-17-PET32a-TransB (DE3) was constructed to express the goat IL-17 recombinant protein,then the BALB/c mice were immunized with the purified goat rIL-17.The spleen of immunized mouse was fused with myeloma cell line SP2/0,and the positive hybridoma clones were screened by indirect ELISA.Then chromosome karyotype analysis was performed on hybridoma cells,and the antibody specificity and subtype analyses of the secreted monoclonal antibody of IL-17 were performed.The results showed that the prokaryotic expression product of purified goat IL-17 was obtained successfully,and one hybridoma cell,B6,was screened out,which could produce the monoclonal antibody and specifically identify the eukaryotic expression product of IL-17.The antibody subtype of McAb was IgG1and the light chain was kappa.

goat; IL-17 monoclonal antibody; hybridoma cells; ELISA

2017-02-28

陜北白絨山羊主要疫病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與示范(2015KTTSNY04-04)

桑鋒鋒(1989-)，女，山東濱州人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*

S852.4

A

1007-5038(2017)11-0052-04