于正青，胡瑞思，王莎莎，趙光輝，宋軍科

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

致犢牛腹瀉腸道原蟲的分子生物學(xué)鑒定

于正青，胡瑞思，王莎莎，趙光輝*，宋軍科*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為確定導(dǎo)致犢牛腹瀉的寄生原蟲種類及分子學(xué)特性，利用基于隱孢子蟲核糖體小亞基RNA、藍(lán)氏賈第蟲β-賈第素和畢氏腸微孢子蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的分子生物學(xué)技術(shù)對腹瀉犢牛的糞便樣品進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，引起犢牛腹瀉的寄生原蟲包括微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、瑞氏隱孢子蟲、E型藍(lán)氏賈第蟲和多種基因型的畢氏腸微孢子蟲，并且存在多種原蟲混合感染。說明原蟲是引起犢牛腹瀉的重要病原，畜牧業(yè)臨床中應(yīng)加強(qiáng)原蟲病的防控。

犢牛；腹瀉；原蟲；鑒定

腹瀉是引起犢牛生長發(fā)育不良甚至死亡的重要疾病，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，其病因復(fù)雜，不僅有環(huán)境、營養(yǎng)等因素，還有細(xì)菌、病毒及寄生蟲等病原因素。其中，寄生性腸道原蟲是犢牛腹瀉常見的病原[1-2]。隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)、藍(lán)氏賈第蟲(Giardialamblia)、畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)作為重要的牛機(jī)會性腸道原蟲，不僅引起犢牛水樣腹瀉，嚴(yán)重阻礙著畜牧業(yè)發(fā)展，這些原蟲還是重要的人獸共患病原，嚴(yán)重威脅著人類健康[3-9]。目前對于這些腸道寄生蟲的檢測方法主要包括病原學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測。免疫學(xué)方法檢測包括免疫熒光分析(immunofluorescence assay，IFA)[10-15]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[16]等方法，雖然其特異性強(qiáng)和敏感性高，但它的檢測不直接，且無法區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染。病原學(xué)檢測雖可直接檢測病原，提供感染的直接證據(jù)，但其費時、費力，檢出率低，并需要專業(yè)人員進(jìn)行種類鑒定[14]。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為這些病原檢測提供了基于PCR的直接、快速、敏感、特異的檢測方法[17]。

2016年11月，陜西關(guān)中地區(qū)某牛場多數(shù)犢牛出現(xiàn)了嚴(yán)重的水樣腹瀉，牛場先后飼喂了痢菌凈、卡那霉素、吡喹酮等，并給予口服補(bǔ)液鹽，但沒有明顯效果。為明確犢牛腹瀉的原因，本研究分別利用基于核糖體小亞基RNA(small sub-unit ribosomal RNA，SSU rRNA)、β-賈第素(beta-giardin，bg)和核糖體RNA基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)基因位點的分子生物學(xué)技術(shù)對犢牛腹瀉樣品進(jìn)行檢測，以確定Cryptosporidiumspp.、G.lamblia和E.bieneusi在此次犢牛腹瀉中的作用，為犢牛腹瀉的治療和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床糞便樣本 采集5頭腹瀉犢牛的新鮮糞便，置于25 g/L重鉻酸鉀溶液中，混勻并放冰盒中運(yùn)回實驗室，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 糞便基因組EZNA?DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；10×ExTaqbuffer(不含Mg2+)、ExTaqDNA聚合酶、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2、6×Loading buffer、DNA Marker DL 2 000、溴化乙錠均為TaKaRa公司產(chǎn)品；引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成；瓊脂糖為上海英濰捷基貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；雙蒸水為本實驗室自制。

1.1.3 儀器設(shè)備 HC3018型臺式高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HH-4型恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；C-XP-D型PCR擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；DYY-12型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；ChampGel 5000型紫外凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；AUY220型精密電子天平，上海光學(xué)儀器一廠產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，上海人和科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；微量移液器，北京大龍興創(chuàng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便DNA的提取 分別取每個糞便樣品200 mg置于1.5 mL離心管中，加入蒸餾水，混勻，12 000 r/min離心1 min，棄上清，重復(fù)以上步驟直至洗凈重鉻酸鉀溶液；然后嚴(yán)格按照糞便基因組EZNA?DNA 提取試劑盒說明書提取糞樣基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及電泳 分別參照Xiao L等[18]、Cacciò S M等[19-20]及Sulaiman I M等[21]的方法進(jìn)行隱孢子蟲、G.lamblia和E.bieneusi的檢測，使用基于SSU rRNA、bg及ITS的套式PCR，引物序列見表1，引物均由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。3種原蟲套式PCR第1輪PCR均在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括2.5 μL 10×ExTaqPCR buffer，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.625 U ExTaq，1 μL基因組模板及1 μL上、下游引物(10 pmol/μL)，第2輪PCR除了使用1 μL第1輪PCR產(chǎn)物為模板，1 μL第2輪上、下游引物外，其他反應(yīng)體系與第1輪完全相同。Cryptosporidiumspp.及E.bieneusi2種原蟲的PCR反應(yīng)條件基本相同，94 ℃ 5 min；94 ℃，45 s，35個循環(huán),退火溫度見表1，45 s，延伸72 ℃ 1 min；最后72 ℃延伸10 min。G.lamblia的PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 15 min,95 ℃ 30 s，35個循環(huán),退火溫度見表1，30 s，延伸72℃ 1 min；最后72 ℃延伸7 min。取4 μL第2輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物與0.8 μL上樣緩沖液(6×loading buffer)充分混勻小心加入到含溴化乙錠的10 g/L瓊脂糖凝膠中，110 V電泳30 min，利用凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

表1 三種原蟲巢式PCR引物

1.2.3 測序及序列分析 將電泳檢測陽性的第2輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。應(yīng)用ClustalX 1.83軟件，將獲得的序列的核苷酸進(jìn)行比對校正，將校準(zhǔn)序列用BLAST進(jìn)行相似性分析。對于Cryptosporidiumspp.的樣本使用Mega 5.1軟件，以Plasmodiumovale(GenBank號碼：KP050371)作為外群，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ法)，選取Kimura 2-parameter模型，bootstrap值設(shè)定為1 000，構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行種類鑒定。G.lamblia和E.bieneusi的鑒定直接采用ClustalX 1.83和BLAST比對分析。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉犢牛的癥狀

該牛場出現(xiàn)劇烈水樣腹瀉的犢牛以6月齡以內(nèi)的犢牛為主，病犢牛的精神沉郁，食欲下降，多臥少立、被毛粗亂。腹瀉發(fā)生后，牛場先后給予犢牛飼喂了痢菌凈、卡那霉素、吡喹酮等，期間穿插飼喂口服補(bǔ)液鹽，但沒有明顯效果，有犢牛發(fā)生死亡。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

5份送檢樣品(Y1-Y5)中，4份樣品擴(kuò)增出約392 bp的E.bieneusi的ITS基因位點(圖1A)，4份樣品擴(kuò)增出約830 bp的Cryptosporidium的 SSU rRNA基因位點(圖1B)，1份樣品擴(kuò)增出約511 bp的G.lamblia的bg基因位點(圖1C)。其中，樣品Y5同時擴(kuò)增出了E.bieneusi、Cryptosporidium和G.lamblia的目的條帶，樣品Y1和Y4同時出現(xiàn)了E.bieneusi和Cryptosporidium的擴(kuò)增條帶，而Y2和Y3僅分別擴(kuò)增出Cryptosporidium和E.bieneusi。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.陰性對照；2～6.樣品Y1-Y5；7.陽性對照M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control; 2-6.Samples Y1-Y5; 7.Positive control

2.3 致病原蟲種類鑒定

為了確定致病原蟲的種類，首先構(gòu)建了基于SSU rRNA基因的Cryptosporidium遺傳進(jìn)化樹(圖2)，樣品Y1與C.andersoni位于同一進(jìn)化支，樣品Y2和Y4與C.parvum聚在同一進(jìn)化支，樣品Y5與C.ryanae位于同一進(jìn)化支，且具有較高的節(jié)點支持值(>95%)，說明引起本次犢牛腹瀉的隱孢子蟲種類為C.andersoni、C.parvum和C.ryanae。G.lamblia特異性PCR的擴(kuò)增片段經(jīng)測序和序列比對發(fā)現(xiàn)樣品Y5與G.intestinalis(JN812335，基因型為E)的同源性為99%。基于E.bieneusi的ITS基因擴(kuò)增的基因片段比對分析發(fā)現(xiàn)，樣品Y1與E.bieneusi(KP262386，基因型J)同源性為100%，樣品Y3與E.bieneusi(KP262380，基因型E)同源性為99%，樣品Y4與E.bieneusi(KP262374，基因型CHG19)相似性為99%，樣品Y5與E.bieneusi(JF776170，基因型J)同源性為100%。

圖2 基于SSU rRNA基因位點的隱孢子蟲的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

腹瀉是犢牛常見的多發(fā)性胃腸疾病，一年四季均可發(fā)生，主要危害斷奶前犢牛，嚴(yán)重影響其生長、發(fā)育及成活；康復(fù)后的犢牛往往生長遲緩、發(fā)育不良，影響后期培育及出欄。畜牧業(yè)臨床犢牛發(fā)生腹瀉時，常主觀判斷病因為大腸埃希菌、彎曲菌等細(xì)菌感染，以及輪狀病毒等病毒感染，大量應(yīng)用抗生素，造成疾病延誤及抗生素的耐藥性、殘留等問題。事實上，腹瀉病因復(fù)雜，除了細(xì)菌、病毒，還可由寄生蟲感染、飼養(yǎng)管理及應(yīng)激等因素引起[22-23]。本研究的奶牛場犢牛發(fā)生大面積腹瀉后，未進(jìn)行病因的徹底分析及病原鑒定，先后飼喂了痢菌凈、卡那霉素、吡喹酮等，并給予口服補(bǔ)液鹽，腹瀉癥狀不僅未能減輕，反而出現(xiàn)了死亡病例。經(jīng)過對送檢樣品的分子生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)此次腹瀉的病因包括Cryptosporidium、E.bieneusi和G.lamblia的感染，而且我們根據(jù)此結(jié)果對牛場制定了相應(yīng)的防控措施，犢牛病情逐漸好轉(zhuǎn)，未再出現(xiàn)死亡病例。本研究結(jié)果提示，犢牛發(fā)生腹瀉時應(yīng)綜合考慮各種致病因素，對疑似病原均應(yīng)進(jìn)行鑒定，針對性的制定相應(yīng)的防治措施。

本研究的5頭腹瀉犢牛均感染了寄生原蟲，并且3頭犢牛存在混合感染，其中1頭甚至同時感染了Cryptosporidium、E.bieneusi和G.lamblia3種原蟲，其中的Cryptosporidium又含有C.parvum、C.andersoni和C.ryanae3個種類，E.bieneusi又含有基因型E、J和CHG19等多種基因型，結(jié)合前人的研究[25-26]，提示在目前臨床上，犢牛感染的寄生原蟲非常復(fù)雜，而且多種原蟲感染并存?；诖?，在臨床防控犢牛腹瀉時應(yīng)采取綜合性防控措施以有效阻斷多種原蟲混合感染及發(fā)病。

Cryptosporidium、G.lamblia和E.bieneusi均為人獸共患原蟲，不僅危害動物的健康，還威脅人類生活。研究發(fā)現(xiàn)，犢牛隱孢子蟲是人隱孢子蟲病的重要感染源[18]，如1993年美國密爾沃基市的飲用水源密歇根湖遭到奶牛場隱孢子蟲卵囊污染，導(dǎo)致約40多萬名的市民(占城市總?cè)丝诘?6%)罹患該病。本研究發(fā)現(xiàn)，5例腹瀉犢牛病例中有2例感染了人獸共患隱孢子蟲種C.parvum，提示該奶牛場犢牛有傳播隱孢子蟲給人的風(fēng)險，后續(xù)需要進(jìn)一步對奶牛場的工作人員及周邊居民進(jìn)行隱孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查，以確定其危害，制定相應(yīng)的防控措施，阻斷該地區(qū)人、牛及其他動物隱孢子蟲病的再次發(fā)生。

[1] Fayer R,Santin M,Macarisin D.Detection of concurrent infection of dairy cattle withBlastocystis,Cryptosporidium,Giardia,andEnterocytozoonby molecular and microscopic methods [J].Parasitol Res,2012,111(3):1349-1355.

[2] Matsuura Y,Matsubayashi M,Nukata S,et al.Report of fatal mixed infection withCryptosporidiumparvumandGiardiaintestinalisin neonatal calves [J].Acta Parasitol,2017,62(1):214-220.

[3] Santín M,Fayer R.Microsporidiosis:Enterocytozoonbieneusiin domesticated and wild animals [J].Res Vet Sci,2011,90(3):363-371.

[4] Xiao L,Fayer R.Molecular characterisation of species and genotypes ofCryptosporidiumandGiardiaand assessment of zoonotic transmission [J].Int J Parasitol,2008,38(11):1239-1255.

[5] Hingole A C,Gudewar J G,Pednekar R P,et al.Prevalence and molecular characterization ofCryptosporidiumspecies in cattle and buffalo calves in Mumbai region of India [J].J Parasit Dis,2017,41(1):131-136.

[6] Swapna L S,Parkinson J.Genomics of apicomplexan parasites [J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2017,(22):1-20.

[7] Chellan P,Sadler P J,Land K M.Recent developments in drug discovery against the protozoal parasitesCryptosporidiumandToxoplasma[J].Bioorg Med Chem Lett,2017,27(7):1491-1501.

[8] Peng X Q,Tian G R,Ren G J,et al.Infection rate ofGiardiaduodenalis,Cryptosporidiumspp.andEnterocytozoonbieneusiin cashmere,dairy and meat goats in China [J].Infect Genet Evol,2016,(41):26-31.

[9] Zhao G H,Du S Z,Wang H B,et al.First report of zoonoticCryptosporidiumspp.,GiardiaintestinalisandEnterocytozoonbieneusiin golden takins (Budorcastaxicolorbedfordi) [J].Infect Genet Evol,2015,(34):394-401.

[10] Chalmers R M,Katzer F.Looking forCryptosporidium:the application of advances in detection and diagnosis [J].Trends Parasitol,2013,29(5):237-251.

[11] Josko D.Updates in immunoassays:parasitology [J].Clin Lab Sci,2012,25(3):185-190.

[12] McHardy I H,Wu M,Shimizu-Cohen R,et al.Detection of intestinal protozoa in the clinical laboratory [J].J Clin Microbiol,2014,52(3):712-720

[13] Plutzer J,Ongerth J,Karanis P.Giardiataxonomy,phylogeny and epidemiology:Facts and open questions [J].Int J Hyg Environ Health,2010,213(5):321-333.

[14] 鄧明俊,肖西志,孫 敏,等.隱孢子蟲檢測技術(shù)研究進(jìn)展 [J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(7):89-95.

[15] Bandyopadhyay K,Kellar KL,Moura I,et al.Rapid microsphere assay for identification ofCryptosporidiumhominisandCryptosporidiumparvumin stool and environmental samples [J].J Clin Microbiol,2007,45(9):2835-2840.

[16] 何宏軒,張西臣,尹繼剛,等.應(yīng)用間接ELISA檢測微小隱孢子蟲抗體的研究 [J].中國獸醫(yī)科技,2003,33(6):24-27.

[17] Checkley W,White A C Jr,Jaganath D,et al.A review of the global burden,novel diagnostics,therapeutics,and vaccine targets forCryptosporidium[J].Lancet Infect Dis,2015,15(1):85-94.

[18] Xiao L,Escalante L,Yang C,et al.Phylogenetic analysis ofCryptosporidiumparasites based on the small-subunit rRNA gene locus [J].Appl Environ Microbiol,1999,65(4):1578-1583.

[19] Cacciò SM,De Giacomo M,Pozio E.Sequence analysis of the beta-giardin gene and development of a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay to genotypeGiardiaduodenaliscysts from human faecal samples [J].Int J Parasitol,2002,32(8):1023-1030.

[20] Lalle M,Pozio E,Capelli G,et al.Genetic heterogeneity at the beta-giardin locus among human and animal isolates ofGiardiaduodenalisand identification of potentially zoonotic subgenotypes [J].Int J Parasitol,2005,35(2):207-213.

[21] Sulaiman I M,Bern C,Gilman R,et al.A molecular biologic study ofEnterocytozoonbieneusiin HIV-infected patients in Lima,Peru [J].J Eukaryot Microbiol,2003,50(Suppl):591-596.

[22] 王 靜,何生虎,葛 松,等.犢牛腹瀉的發(fā)病原因及治療的研究進(jìn)展 [J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究,2013,34(3):59-62.

[23] 曹明澤,朱 陣,王 磊,等.犢牛腹瀉概述 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016,(14):116-119.

[24] Abeywardena H,Jex A R,Koehler A V,et al.First molecular characterization ofCryptosporidiumandGiardiafrom bovines (BostaurusandBubalusbubalis) in Sri Lanka:unexpected absence of C.parvum from pre-weaned calves [J].Parasit Vectors,2014,7:75.

[25] Wang X T,Wang R J,Ren G J,et al.Multilocus genotyping ofGiardiaduodenalisandEnterocytozoonbieneusiin dairy and native beef (Qinchuan) calves in Shaanxi province,northwestern China [J].Parasitol Res,2016,115(3):1355-1361.

[26] Xiao L,Feng Y.Zoonotic cryptosporidiosis [J].FEMS Immunol Med Microbiol,2008,52(3):309-323.

IdentificationofIntestinalProtozoaCausingDiarrheainCalvesbyMolecularBiology

YU Zheng-qing,HU Rui-si,WANG Sha-sha,ZHAO Guang-hui,SONG Jun-ke

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

To determine the protozoan species that cause calf diarrhea,molecular techniques based on the small sub-unit ribosomal RNA ofCryptosporidium,β-giardin ofGiardialamblia,and internal transcribed spacer ofEnterocytozoonbieneusiwere used to identify the fecal samples of diarrheal calves.The protozoa causing diarrhea of calves includedC.parvum,C.andersoni,C.ryanae,type EG.lamblia,and several genotypes ofE.bieneusi,and mixed infection of several protozoa were also observed.The protozoa were the important pathogens causing diarrhea of calves,and controlling the protozoan diseases should be strengthened in the clinic of animal husbandry.

calf; diarrhea; protozoa; identification

2017-05-24

國家自然科學(xué)基金項目(31572509)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展規(guī)劃資助項目(2016NY-113)；中國博士后面上項目(2016M592848)；陜西省博士后科研項目資助特別資助

于正青(1992-)，男，山東威海人，碩士研究生，主要從事動物寄生蟲病研究。*

S852.72

A

1007-5038(2017)11-0048-05