吳 飛，邊青青，王 丹，鄒 勇，胡雄峰，任世斌，芮 聰，李 坤，楊 瑩，林 青*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.商洛市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西商洛 726000)

豬蛔蟲GST蛋白編碼基因克隆及序列分析

吳 飛1，邊青青2，王 丹1，鄒 勇1，胡雄峰1，任世斌1，芮 聰1，李 坤1，楊 瑩1，林 青1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.商洛市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西商洛 726000)

為預(yù)測并分析豬蛔蟲(Ascarissuum)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)蛋白編碼基因的結(jié)構(gòu)特征及其B細胞抗原表位，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴增豬蛔蟲GST蛋白編碼序列(coding sequence，CDS)，將純化的DNA與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細胞，并將陽性菌液測序后進行序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測和抗原表位預(yù)測。結(jié)果表明，獲得的豬蛔蟲GST蛋白CDS序列與參考基因(Y10613.1)相比，在第243和248位核苷酸處發(fā)生變異，并導(dǎo)致第83位氨基酸由甲硫氨酸(Met)變異為蘇氨酸(Thr)；其優(yōu)勢B細胞抗原表位可能位于肽段29-38、43-47、80-87、114-120、129-131、143-145、190-194、201-204區(qū)域內(nèi)或附近，其中最可能位于肽段43-46和201-204區(qū)域內(nèi)或附近。研究結(jié)果為豬蛔蟲基因工程疫苗的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，同時為后續(xù)豬蛔蟲GST基因功能和耐藥相關(guān)性研究提供了基礎(chǔ)資料。

豬蛔蟲；GST基因；克隆；序列分析；豬

豬蛔蟲病(Swine ascariasis)是由豬蛔蟲(Ascarissuum)寄生在豬小腸而引起的一種寄生線蟲病。雖然人與豬的蛔蟲是否屬于同一個種，目前還存在爭議[1]，但據(jù)有關(guān)報道稱，二者存在交叉感染現(xiàn)象，屬于人獸共患寄生蟲病[2-4]。豬蛔蟲病呈全球性分布，感染普遍，無論是集約化飼養(yǎng)或是散養(yǎng)的豬均極易感染發(fā)病，造成地方性流行。感染本病的豬生長發(fā)育不良，飼料回報率低[5]，是造成“僵豬”的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，嚴重制約我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。基于有關(guān)資料報道和筆者近幾年的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國的豬蛔蟲感染率為13%～80%，遠高于北歐國家[6]。目前，由于臨床上沒有可使用的豬蛔蟲病疫苗，藥物預(yù)防仍是控制豬蛔蟲病的有效方法之一。然而，過度依賴抗寄生蟲藥物，在短期內(nèi)雖能達到降低寄生蟲感染率、提高豬生產(chǎn)性能的目的，但必然會導(dǎo)致耐藥蟲株的出現(xiàn)，給豬蛔蟲病的防治帶來新的挑戰(zhàn)。故而，尋找新的疫苗及藥物靶位基因顯得極為重要。

GST是機體內(nèi)重要的解毒物質(zhì)，它可以催化親核性的谷胱甘肽和親電性的外源化學(xué)物結(jié)合以阻止化學(xué)物與細胞生物大分子重要成分發(fā)生共價結(jié)合，從而起到解毒作用[7]。大量研究表明，GST在多種生物體內(nèi)都有表達，且對干旱、藥物等環(huán)境脅迫具有一定抗性作用[8-12]。另有國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，肝片吸蟲和豬蛔蟲GST免疫小鼠對日本血吸蟲尾蚴攻擊感染有明顯的抵抗力[13]。因此，GST極有可能是豬蛔蟲一個理想的疫苗候選基因或是一個重要的藥物靶位。

目前，對部分生物和寄生蟲GST的研究已取得了一定的進展，但對豬蛔蟲GST結(jié)構(gòu)和功能的研究相對不足，尤其是GST在豬蛔蟲耐藥性形成和入侵過程中可能扮演的角色和作用機制方面尚未明確。本研究擬通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆豬蛔蟲GST蛋白編碼基因序列，利用生物信息學(xué)手段分析其序列并預(yù)測其結(jié)構(gòu)和抗原表位，旨在為深入研究豬蛔蟲GST的功能及分析其作為疫苗候選基因和藥物靶位的可行性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株 本研究中所用豬蛔蟲采自于陜西扶風(fēng)成年豬小腸。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒TIANgel Midi Purification Kit購于天根生化科技(北京)有限公司；Trizol裂解液購于北京康為世紀生物科技有限公司；感受態(tài)細胞JM109、pMD19-T Vector、rTaq酶、PCR試劑(Buffer、MgCl2、dNTPs)、DNA Ladder Marker DL 2000及PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司；三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 分析軟件 序列分析軟件Lasergene 由實驗室提供；NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)系在線共享網(wǎng)絡(luò)平臺。

1.2 方法

1.2.1 蟲體總RNA提取與驗證 無菌條件下剪取50 mg～100 mg蟲體活組織，剪碎后置于滅菌研缽中充分研磨；加入含1 mL Trizol裂解液的RNase Free離心管中，充分搖勻；勻漿樣品室溫(16℃～30℃)靜置5 min；加入200 μL氯仿，振蕩15 s，室溫靜置3 min；4℃、10 000 r/min 離心15 min；吸取上清液并加入等體積異丙醇(約500 μL)，輕輕混勻后室溫靜置10 min；4℃、10 000 r/min 離心10 min；棄上清液并加入1 mL 750 mL/L乙醇，輕輕顛倒洗滌沉淀；4℃、7 500 r/min 離心5 min；棄上清液室溫干燥5 min～10 min；加入30 μL DEPC水充分溶解RNA；取5 μL進行凝膠電泳驗證，其余RNA置-80℃保存。

1.2.2 總RNA的反轉(zhuǎn)錄 在0.2 mL RNase Free PCR管中加入DEPC水5.5 μL，5×Prime Script buffer 2 μL，OligodT 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，總RNA 1 μL，共計10 μL，混勻后瞬時離心，以37℃ 15 min，85℃ 5 s的程序在PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物保存于-20℃。

1.2.3 目的基因的擴增 本研究所用引物根據(jù)GenBank登錄號為：Y10613.1 的豬蛔蟲GST蛋白CDS序列設(shè)計，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(F：5′-ATGCCGCAGTACAAGCTC-3′，R：5′-CTAATATGGCGTCTTCGG-3′)。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，按下述體系和程序擴增目的基因CDS區(qū)域，體系：ddH2O 15.375 μL，10×buffer 2.5 μL，Mg2+2 μL，dNTPs 2 μL，rTaq酶0.125 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，共計25 μL；程序：95℃ 5 min；94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4 目的基因的克隆與鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后按TIANgel Midi Purification Kit操作說明進行膠回收，回收產(chǎn)物按照說明書體系用PCR儀16 ℃ 12 h連接到pMD19-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細胞中，搖床上37℃搖2 h后涂布到含氨芐青霉素(100 mg/L)的平板上，隨后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取出平板挑取單個菌落接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37℃搖12 h后收取菌液，菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5 序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測及B細胞抗原表位預(yù)測 用Lasegene對測序所獲得的豬蛔蟲GST基因CDS序列進行序列分析[14]；采用Garnier-Robson和Chou-fasman方法預(yù)測GST蛋白的二級結(jié)構(gòu)；運用SWISS-MODEL在線服務(wù)器預(yù)測GST蛋白的三級結(jié)構(gòu)；使用Karplus-Schulz、Kyte-Doolittle、Jameson-Wolf和Emini等方法分別預(yù)測GST蛋白的柔韌性、親水性、抗原指數(shù)和表面可能性，以綜合分析預(yù)測B細胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取效果及菌液PCR結(jié)果

總RNA提取凝膠電泳驗證結(jié)果可見有3個完整的RNA條帶，證明RNA提取效果較理想(圖1)。菌液PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果也表明在目的條帶大小處有一條特異性條帶(圖2)，證明目的基因擴增成功，可以送往測序公司進行序列測定。

1.豬蛔蟲總RNA1.The total RNA of Ascaris suum

M.DNA 標準DL 2 000 ； A.GST基因菌液PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; A.Bacterial liquid PCR products of GST gene

圖2菌液PCR產(chǎn)物凝膠電泳

Fig.2 Agarose gel electphoresis of bacterial liquid PCR products

2.2 GST基因CDS序列測定及分析

2.2.1 核苷酸序列分析 測定的GST基因CDS序列經(jīng)Lasergene分析表明，GST基因CDS序列長度為621 bp，四種核苷酸含量相當(dāng)，堿基A、G、T、C分別含有164個、171個、134個、152個。A+T共298個占47.99%，而C+G共323個占52.01%，兩者含量也十分相近。但特別要指出的是，通過與參考豬蛔蟲GST基因(Y10613.1)比較得知，本研究從陜西扶風(fēng)分離到的豬蛔蟲在編碼區(qū)第243和248位核苷酸發(fā)生變異，前者由G變異為A，后者由T變異為C(圖3)，這導(dǎo)致編碼的第83位氨基酸由甲硫氨酸(Met)變異為蘇氨酸(Thr)。

圖3 陜西扶風(fēng)分離的豬蛔蟲GST蛋白編碼基因與參考基因的比對結(jié)果

2.2.2 氨基酸序列分析 根據(jù)測定序列推導(dǎo)得到的氨基酸序列通過Lasergene分析表明，GST基因CDS序列全長為206個氨基酸(不含信號肽)，分子質(zhì)量為23555.21 D，等電點為7.385，其中堿性氨基酸(K，R)和酸性氨基酸(D，E)均有30個，占總體氨基酸數(shù)目的14.56%，親水性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)有34個，占16.50%，而疏水性氨基酸(A，I，L，F(xiàn)，W，V)有78個之多，占總體37.86%。

2.2.3 氨基酸序列相似性比較 陜西扶風(fēng)分離的豬蛔蟲GST蛋白編碼基因與豬蛔蟲參考GST蛋白編碼基因(登錄號：CAA71620)、人蛔蟲GST蛋白編碼基因(登錄號：4Q5F)、西氏貝蛔蟲GST蛋白編碼基因(登錄號：AJH66211)、犬弓首蛔蟲GST蛋白編碼基因(登錄號：KHN74035)氨基酸序列相似性分別為99.5%、99.5%、91.7%和77.2%。另外，由圖可見，豬蛔蟲參考GST蛋白編碼基因與人蛔蟲GST蛋白編碼基因氨基酸序列同源性達100%(圖4)。

2.3 GST蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.1 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 Garnier-Robson和Chou-Fasman方法預(yù)測結(jié)果顯示，α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角分別有8個、4個、7個和10個、4個、14個(圖5)，其具體分布位置及所占比例如表1所示。且Garnier-Robson方法預(yù)測的無規(guī)則卷曲有9個(圖5)，其分布見表1。兩種預(yù)測方法結(jié)果顯示，α 螺旋最多，β 折疊和無規(guī)則卷曲相對較少，但GST蛋白二級結(jié)構(gòu)整體含量較高，幾乎涵蓋整個序列。

2.3.2 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 將豬蛔蟲GST蛋白氨基酸序列輸入SWISS-MODEL預(yù)測網(wǎng)站中，可以觀測到其3D結(jié)構(gòu)(圖6)。由圖可知，其3D結(jié)構(gòu)中含有多個轉(zhuǎn)角和隨機扭曲結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能在其行使生物學(xué)功能過程中發(fā)揮重要作用。該預(yù)測是以人蛔蟲(Ascarislumbricoides)GST蛋白(登錄號：4Q5F)為參照，且兩者之間序列相似性達到99.51%，結(jié)構(gòu)上也基本相同。

圖4 GST蛋白編碼基因氨基酸序列相似性比較

圖5 GST蛋白編碼基因的不同參數(shù)預(yù)測

預(yù)測參數(shù)Predictiveparameters預(yù)測方法Predictionmethod預(yù)測位置Predictedposition百分比/%Percentageα-螺旋Alpha-helixGarnier-Robson1-5,16-25,27-42,53-67,83-149,151-170,172,174-20077.78Chou-Fasman14-29,34-44,50-55,60-68,85-102,107-113,118-141,165-168,179-190,195-20255.56β-折疊Beta-sheetGarnier-Robson6-11,68-70,75,2075.31Chou-Fasman6-9,64-75,146-149,154-16013.04β-轉(zhuǎn)角Beta-turnGarnier-Robson44-45,47-49,71-74,150,173,202-203,206-2077.25Chou-Fasman2-5,10-13,30-33,46-49,56-59,81-84,103-106,114-117,142-145,150-153,161-164,175-178,191-194,204-20727.05無規(guī)則卷曲Ran-domcoilGarnier-Robson12-15,26,43,46,50-52,76-82,171,201,204-20510.14柔韌性FlexibilityKarplus-Schulz13-18,29-38,43-49,56-59,79-87,94-96,113-122,129-131,141-146,151-152,172-173,175,190-196,201-20435.75親水性(≥0)Hydro-philicityKyte-Doolittle1-9,12-16,20,26-49,59,61,66,69-73,76-78,80-94,96-101,103,113-121,126-135,140-150,153-154,164-166,169-170,176,179-194,196-20765.70抗原指數(shù)(≥0)An-tigenicindexJameson-Wolf2-4,10-18,27-50,55-60,71-72,76-88,90-91,94-96,98-100,102-106,112-122,124-135,139-145,148-151,153-154,160,162-165,171,173,175,180,183-194,197-20766.67表面可能性(≥1)SurfaceprobabilityEmini1-7,9,29-38,40,42-47,70-71,80-87,94-95,98,114-120,128-132,139,143-145,180-184,188-194,197-198,200-20736.71合計*Total*29-38,43-47,80-87,114-120,129-131,143-145,190-194,201-20421.74

注：* 合計是根據(jù)的柔韌性、親水性、抗原指數(shù)和表面可能性預(yù)測的最可能B細胞抗原表位。

Note:* The most likely B cell epitopes predicted based on flexibility,hydrophilicity,antigenic index and surface probability.

圖6 GST蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 GST蛋白B細胞抗原表位預(yù)測

綜合B細胞抗原表位的4個主要參數(shù)(柔韌性、親水性、抗原指數(shù)和表面可能性)的預(yù)測結(jié)果可知，雖然由于不同參數(shù)預(yù)測的表位存在些許差異，但肽段29-38、43-47、80-87、114-120、129-131、143-145、190-194、201-204是各個方法都認可的B細胞抗原表位(表1)，故而，豬蛔蟲GST蛋白的優(yōu)勢抗原表位最可能處于這些肽段內(nèi)或其附近。

3 討論

豬蛔蟲泛濫不僅會給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，其感染性幼蟲還可在人體肝臟、肺臟等組織中生長，導(dǎo)致眼幼蟲移行癥和內(nèi)臟幼蟲移行癥，造成各個器官和組織損傷和出血，引起患者發(fā)熱、腹痛、咳嗽、視力障礙甚至失明等癥狀[15-16]，是一種重要的人獸共患寄生蟲病。本研究通過分子生物學(xué)及生物信息學(xué)手段對豬蛔蟲GST蛋白編碼基因進行研究，結(jié)果表明，本次從陜西扶風(fēng)分離到的豬蛔蟲GST蛋白編碼基因序列與參考序列(登錄號：CAA71620)和人蛔蟲GST蛋白編碼基因(登錄號：4Q5F)氨基酸序列相似性較高(圖4)，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果也顯示其與人蛔蟲GST蛋白編碼基因(登錄號：4Q5F)結(jié)構(gòu)基本相同，這說明GST在豬蛔蟲和人蛔蟲中可能行使著相似的功能，同時也預(yù)示著豬蛔蟲與人蛔蟲種群親緣關(guān)系較近，可能是同一個物種寄生于不同的宿主而已。值得一提的是，通過與參考序列(登錄號：CAA71620)進行核苷酸和氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，陜西扶風(fēng)分離到的豬蛔蟲在GST蛋白編碼基因的第243和248位核苷酸發(fā)生變異(圖3)，并導(dǎo)致編碼的第83位氨基酸發(fā)生改變(Met→Thr)，這種變化有可能是長期的環(huán)境脅迫如藥物或是地理位置及氣候因素造成的適應(yīng)性改變，故而，其突變是否改變了其功能或是與耐藥有關(guān)還有待進一步深入研究。

另外，對豬蛔蟲GST蛋白編碼的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其α螺旋和β折疊的區(qū)域較多，這有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，卻不適宜作為抗原表位。但有報道稱，除了柔韌性、親水性、抗原指數(shù)和表面可能性這4個B細胞抗原表位的主要參數(shù)外，β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲因其較松散易于發(fā)生扭曲，盤旋并展示在蛋白表面而對抗原表位有很大的影響[17]。因此，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲是B細胞抗原表位預(yù)測的另一重要參數(shù)，本研究綜合以上參數(shù)預(yù)測得知，豬蛔蟲GST蛋白優(yōu)勢抗原最可能出現(xiàn)在肽段43-46和201-204區(qū)域內(nèi)或附近，該表位預(yù)測結(jié)果將為進一步研究制備豬蛔蟲基因工程疫苗提供理論依據(jù)。

綜上所述，本研究不僅分析了陜西扶風(fēng)分離的豬蛔蟲GST蛋白編碼基因序列信息，還綜合預(yù)測了其優(yōu)勢抗原表位，為進一步深入研究豬蛔蟲GST的功能及其作為疫苗候選基因和藥物靶位的基因工程疫苗研制和耐藥相關(guān)性研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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CloningandSequenceAnalysisofAscarissuumGSTProtein-codingGene

WU Fei1,BIAN Qing-qing1,WANG Dan1，ZOU Yong1，HU Xiong-feng1，REN Shi-bin1,RUI Cong1,LI Kun1,YANG Ying1,LIN Qing1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China；2.ShangluoCityAnimalDiseaseControlCenter,Shangzhou,Shaanxi,726000,China)

In order to predict and analyze the structure characteristics and B cell antigenic epitopes ofAscarissuumglutathione S-transferase (GST) protein-coding genes,A.suumGST protein-coding gene was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) technology,followed by cloning the purified DNA products into pMD19-T vector and transforming into JM109 competent cells,and then positive bacterium liquid was sent to sequence.After that,the obtained sequence was analyzed,the structure and antigenic epitopes were predicted by bioinformatics methods.The result showed that GST protein-coding gene ofA.suummutated in 243 and 248 nucleotides,which result in the 83thamino acid turned into threonine from methionine comparing to the reference gene (Y10613).And the dominant B cell antigenic epitopes were located in sections 29-38,43-47,80-87,114-120,129-131,143-145,190-194,201-204 or the adjacent area,particularly in sections 43-46 and 201-204.These results will provide theoretical evidence for the development ofA.suumgenetically engineered vaccine and the subsequent studies onA.suumGST gene function and drug-resistance correlation.

Ascarissuum; GST gene; cloning; sequence analysis; pig

2017-03-31

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610712020)

吳 飛(1992-)，男，安徽宣城人，碩士研究生，主要從事動物疫病防治研究。*

S852.731

A

1007-5038(2017)11-0042-06