劉曉東，楊旭兵，鄭慶禮，馬震乾，劉紅祥，王福軍，楊佳豐，高 豐，杜元釗，王全溪

(1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002; 3.福州康欣農(nóng)牧有限公司，福建福州 350002；4.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000)

我國部分省(區(qū))豬圓環(huán)病毒3型的分子流行病學(xué)研究

劉曉東1,4，楊旭兵4，鄭慶禮2，馬震乾4，劉紅祥4，王福軍4，楊佳豐3，高 豐1*，杜元釗4，王全溪2

(1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002; 3.福州康欣農(nóng)牧有限公司，福建福州 350002；4.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000)

2016年美國報道了一種可引起豬皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙、呼吸道及高熱等多系統(tǒng)炎癥的新型病毒豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)。為了解我國PCV-3的感染情況,針對PCV-3保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物，對10個省106份樣品進(jìn)行PCR檢測并測序分析。結(jié)果表明,10個省(區(qū))中6個省(區(qū))為陽性，地區(qū)陽性率60%；66個豬場中感染PCV-3的豬場為12個，豬場陽性率為18.2%；106個樣品中檢測PCV-3陽性的樣品為19例，樣品陽性率為18.0%。研究結(jié)果為更多了解PCV-3在我國感染情況提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒3型；PCR檢測；分子流行病學(xué)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovius,PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是目前已知最小的動物病毒。PCV為無囊膜、單鏈環(huán)狀、DNA病毒，病毒顆粒呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑大約17 nm～20 nm，病毒復(fù)制以滾環(huán)方式進(jìn)行[1]。Meehan B等[2-4]等將PCV分成PCV-1 和PCV-2 兩種血清型。PCV-1 不能引起豬發(fā)病，但是PCV-2不僅可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，而且還與豬皮炎與腎病綜合征、豬先天性震顫、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎等疾病密切相關(guān)。自從發(fā)現(xiàn)PCV-2可致豬發(fā)病以來，該病毒在世界各國迅速蔓延，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 2015年-2016年，Palinski R等[5-6]兩個實驗室基本同時報道了在美國北卡羅來納州、美國密蘇里州、明尼蘇達(dá)州、南達(dá)科他州送檢豬體檢測出了一種新的病毒，經(jīng)鑒定為PCV-3。這種新型圓環(huán)病毒基因組全長為2 kb，現(xiàn)已成為豬圓環(huán)病毒家族的又一新成員。為了解PCV-3在我國豬場中的情況，本研究采用PCR方法對我國10省(區(qū))106份發(fā)病豬樣品進(jìn)行了PCV-3的分子流行病學(xué)檢測與分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 分別從安徽、江西、山東、福建、廣西、黑龍江、河南、吉林、湖北、海南10省(區(qū))66個不穩(wěn)定豬場采集病料(肺、脾臟、淋巴結(jié))106份。

1.1.2 主要試劑 組織/細(xì)胞DNA提取試劑盒購自Whatson公司；動物組織總RNA提取試劑盒購自北京天根生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京普洛麥格公司；PCR MIX,DNA Marker等購自TaKaRa(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中PCV-3序列(KX778720.1)，在其高度保守區(qū)域設(shè)計一對特異性引物：F:5′-3′CGACGGCGGGAATCTGACTGA,R:5′-3′TACCCATTTAAACATGGACCA，擴(kuò)增片段為260 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增 按照動物/細(xì)胞DNA試劑盒提取病料總DNA。將病料混合加液氮研磨，加入蛋白酶K 55℃裂解，RNaseA除去RNA，然后上柱，按說明書步驟進(jìn)行。PCV-3的PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用50 μL體系，反應(yīng)程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s、57℃ 25 s、72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 測序分析 PCR陽性樣品的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果利用DNA Star軟件進(jìn)行比對，繪制遺傳進(jìn)化樹分析。

1.2.4 混合感染情況的分析 為了進(jìn)一步了解PCV-3與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、PCV-2的混合感染情況，分別對所有病料提取RNA和DNA，PCR檢測。引物分別為：豬瘟F:5-AGGAGCCCGTATTTCTGGA-3,R:5-CCCTTGATGCTTGATCTTGTG-3,擴(kuò)增片段478 bp;豬藍(lán)耳病F:5-GCGTCCTCACAGACGGAATA-3,R:5-CGCCGAGAAGACCCAGA-3,擴(kuò)增片段1 004 bp;豬偽狂犬F:5-CGGATCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGAC-3,R:5-GAAGGCGTCGACGGGTCAGGCGGTCAG-3,擴(kuò)增片段1 245 bp; PCV-2:F:5-TTACCGGCGCACTTCGGCAG-3,R:5-ACTCCGTTGTCCCTGAGAT-3,擴(kuò)增片段404。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果

利用所設(shè)計的PCV-3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明可擴(kuò)增出1條約260 bp條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。

2.2 臨床病料的PCV-3檢測

對來自全國10個省(區(qū))65家豬場的106份病料進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，10個省(區(qū))中，6個省(區(qū))為的病料PCV-3陽性，地區(qū)陽性率60%；66個豬場中感染PCV-3的豬場為12個，豬場陽性率為18.2%；106個樣品中檢測PCV-3陽性的樣品為19例，樣品陽性率為18.0% (表1,圖2)。19例PCV-3陽性病例中存在高熱呼吸道癥狀的為5例，消瘦與生長緩慢的為7例，急性死亡的為2例，繁殖障礙的為5例。

1～2.陽性樣品; 3.陰性樣品 M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 1 000

1-2.Positive samples; 3.Negative sample M.DNA Marker DL 1 000

圖1 PCR檢測結(jié)果

Fig.1 Detection results of PCR

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 1 000；A.陽性對照；B.陰性對照； 1～19.陽性檢測樣品M.DNA Marker DL 1 000；A.Positive control samples；B.Negative control sample； 1-19.Positive samples

編號№省份Province豬場/個FarmPCV-3陽性場/個PCV-3positivefarm樣品數(shù)/個SamplesPCV-3陽性樣品數(shù)/個PCV-3positivesamples豬場陽性率/%Positiverateoffarms樣品陽性率/%Positiverate1安徽Anhui314133.325.02江西Jiangxi427350.042.63山東Shandong26450915.418.04福建Fujian8313337.523.15河南Henan1111619.106.256廣西Guangxi315233.340.07黑龍江Helongjiang4040008吉林Jilin2020009湖北Hubei30300010海南Hainan202000合計Total1066121061918.218.0

2.3 遺傳進(jìn)化樹分析

選擇13份陽性病料的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列分析結(jié)果表明，13份陽性的毒株與參考毒株在同一分支中均屬于PCV-3(圖3)，同源性均大于98%(圖4)。13份病料雖均為PCV-3，但不同區(qū)域毒株也存在一定差異,如江西毒株(JXXY3)。

□表示基因庫中的參考序列 □Reference sequence in GenBank

圖4 同源性分析

2.4 PCV-3混合感染的結(jié)果

對106份可疑樣品通過PCR檢測，結(jié)果CSFV與PRRSV混合感染為5例，CSFV與PCV-2混合感染為1例，CSFV與PCV-3混合感染為5例，PRRSV與PCV-2混合感染為9例，PCV-2與PRV混合感染為4例，PCV-2與PCV-3混合感染為3例，CSFV+PRRSV+PCV-2混合感染為4例，CSFV+PRRSV+PRV混合感染為1例，CSFV+PRRSV+PCV-3混合感染為1例，CSFV+PCV-2+PCV-3混合感染為3例(圖5)。可見臨床上PCV-3存在與其他病毒混合感染的現(xiàn)象。

圖5 混合感染檢測結(jié)果

3 討論

對全國10個省(區(qū))的病例檢測中，6個省(區(qū))為陽性，地區(qū)陽性率60%；66個豬場中感染PCV-3的豬場為12個，豬場陽性率為18.2%。因此提示，全國部分省(區(qū))PCV-3已成流行趨勢，地域分布特點不明顯，這與文獻(xiàn)[7-8]的研究結(jié)果一致。本研究團(tuán)隊認(rèn)為應(yīng)更加重視PCV-3的監(jiān)控及研究工作。通過對106個樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)19個陽性病例中PCV-3單獨發(fā)生為7例，其余均為混感，其中CSFV與PCV-3混合感染為5例，PCV-2與PCV-3混合感染為3例，CSFV+PRRSV+PCV-3混合感染為1例，CSFV+PCV-2+PCV-3混合感染為3例。通過本研究可以推斷，PCV-3與CSFV以及PCV-2的混感率要高于其他疾病。對于PCV-3的起源有文獻(xiàn)指出，PCV-3與蝙蝠圓環(huán)病毒在遺傳進(jìn)化關(guān)系上相近[7]，PCV-3是直接來源于蝙蝠，還是與豬體內(nèi)的其他圓環(huán)病毒重組而來，需要進(jìn)一步研究分析。通過19個陽性案例分析發(fā)現(xiàn)，高熱與呼吸道的病例為5例，消瘦及體況差的病例為7例，急性死亡的病例為2例，繁殖障礙的病例為5例，此結(jié)果的出現(xiàn)可能跟PCV-3與其他疾病混感率比較高有關(guān)，何啟蓋研究發(fā)現(xiàn)的PCV-3具有致母豬繁殖障礙的癥狀[7]與本研究團(tuán)隊統(tǒng)計的癥狀具有一致性[7]。中國作為世界養(yǎng)豬大國，豬病的監(jiān)測、病原的致病、流行病學(xué)調(diào)查等對于疾病的有效防控至關(guān)重要，本研究通過對PCV-3的流行病學(xué)的調(diào)查，可為進(jìn)一步對PCV-3的研究工作和防控措施提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

[1] Tischer I,Gelderblom H,Vettermann W,et al.A very small porcinevirus with circular single stranded DNA[J].Nature,1982,295:64-66.

[2] Meehan B,McNeilly F,Todd D,et al.Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs [J].J Gen Virol,1997,79:2171-2179.

[3] Allan G M,Meehan B,Todd D,et al.Novel porcine cirecovirus from pigs with wasting disease syndrome[J].Vet Rec，1998,142:467-468.

[4] Allan G M,McNeilly F,Meehan B,et al.Isolation and characterization of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain,Denmark and Northern Ireland[J].Vet Microbiol,1999,66:115-123.

[5] Palinski R,Pieyro P,Shang P,et al.A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J].J Virol,2016,91(1):doi:10.1128/JVI01879-16.

[6] Phan T G,Giannitti F,Rossow S,et al.Detection of a novel circovirus PCV3 in pigs with cardiac and multisystemic inflammation[J].Virol J,2016,13(1):184.

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[8] Shen H,Liu X,Zhang P,et al.Genome characterization of a porcine circovirus type 3 in South China[J].Transb Emerg Dis,2017.doi:10.1111/tbed.12639.

MolecularEpidemiologyofPorcineCircovirusType3inSomeProvincesofChina

LIU Xiao-dong1,4,YANG Xiu-bin4,ZHENG Qing-li2,WANG Fu-jun4,LIU Hong-xing4,YANG Jia-feng4,GAO Feng1,DU Yuan-zhao4,WANG Quan-xi2

(1.CollegeofVeterinaryScience,JilinAgricultureUniversity,Changchun,Jilin,130062,China；2.CollegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian,350002,China; 3.FuzhuoKangxinBioengineeringCo.，F(xiàn)uzhou,Fujian,350002,China; 4.QingdaoYebioBioengineeringCo.，Ltd,Qingdao,Shandong,266000，China)

In 2016,a new virus was identified with porcine circovirus type 3 (PCV-3) that caused porcine dermatitis and nephropathy syndrome,reproductive disorders,respiratory disease and high fever and so on in the United States.In order to investigate the infection of PCV-3 in China,a pair of specific primers were designed according to the conserved sequence of PCV 3.106 samples collected from ten provinces were detected by PCR,and the PCR products were sequenced and analyzed.The results showed that there were 6 PCV-3 positive provinces from 10 provinces,the positive rate was 60%.And there were 12 PCV-3 positive swine farms from the 66 swine farms,the positive rate was 18.2%.There were 19 PCV-3 positive cases from 106 samples,the positive rate was 18.0%.This study provided the basis data of PCV-3 infection situation in our country.

Porcine circovirus type 3; PCR detection; molecular epidemiology

2017-05-05

福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)展基金項目(KF2015094);國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0500707)

劉曉東(1984-)，男，山東青島人，博士研究生，主要從事動物病理學(xué)研究。*

S852.659

A

1007-5038(2017)11-0018-04