黃春秀 董煥嫦 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510631)

我國東南海域2個(gè)新記錄擬菱形藻物種及其產(chǎn)毒特征*

黃春秀 董煥嫦 李 揚(yáng)①

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510631)

為豐富我國擬菱形藻屬的物種多樣性, 并澄清其產(chǎn)毒特征, 本文從我國東南海域分離和建立了擬菱形藻的單克隆培養(yǎng)株系, 結(jié)合光學(xué)顯微鏡下的群體特征和透射電鏡下的超微形態(tài)特征, 還有基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù), 以及基于 ITS2轉(zhuǎn)錄 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 鑒定到我國擬菱形藻屬的2個(gè)新記錄種: 鐮刀擬菱形藻(P.sabitTeng, Lim, Lim & Leaw)和中鼓擬菱形藻(P.inflatula(Hasle) Hasle)。鐮刀擬菱形藻的典型形態(tài)特征是殼面呈現(xiàn)鐮刀狀, 點(diǎn)條紋由兩排孔紋組成,與并基擬菱形藻(P.decipiens)的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系最為接近, ITS2-RNA有2個(gè)補(bǔ)償堿基差異。中鼓擬菱形藻主要形態(tài)特征是殼面呈直線形, 點(diǎn)條紋由單排孔紋組成, 孔紋內(nèi)部以上下兩分區(qū)為主, 與格氏擬菱形藻(P.granii)和亞弧線擬菱形藻(P.subcurvata)的親緣關(guān)系接近, ITS2-RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分別有4個(gè)補(bǔ)償堿基差異。另外, 利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)培養(yǎng)藻株的產(chǎn)毒特征進(jìn)行了分析, 未檢測(cè)到多莫酸。本文為我國擬菱形藻屬的物種多樣性做了必要的補(bǔ)充, 還可為擬菱形藻的毒理研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

鐮刀擬菱形藻; 中鼓擬菱形藻; 物種多樣性; 形態(tài); 核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū); ITS2-RNA二級(jí)結(jié)構(gòu);多莫酸

擬菱形藻(Pseudo-nitzschiaPeragallo)是廣泛分布于全球近岸水體的浮游硅藻類群, 也是記憶缺失性貝毒(amnesic shellfish poisoning, ASP)——多莫酸(domoic acid, DA)的重要生物來源(Lelonget al, 2012;Traineret al, 2012)。1987年加拿大發(fā)生了一起由于擬菱形藻引起的人類中毒事件(Bateset al, 1989), 引起了各國政府以及學(xué)者對(duì)其高度的關(guān)注。隨后, 歐洲、大洋洲等地方也陸續(xù)有產(chǎn)毒擬菱形藻的報(bào)道(Hallegraeff, 1994; Lundholmet al, 1994)。因此擬菱形藻受到廣泛關(guān)注, 并成為藻類學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)研究熱點(diǎn)之一(Lundholmet al, 2002, 2006; Lelonget al,2012; Traineret al, 2012)。

目前全球已報(bào)道 48種擬菱形藻(Percopoet al,2016; Tenget al, 2016), 我國報(bào)道了23個(gè)物種(Lüet al, 2012; 徐國雙等, 2015), 但絕大部分物種的研究僅停留在單純形態(tài)學(xué)水平, 甚至有些種類僅報(bào)道于名錄中, 未見任何種源信息。此外, 全球記錄的24種產(chǎn)毒擬菱形藻中(Lelonget al, 2012; Traineret al,2012; Tenget al, 2016; Lundholmet al, 2017), 有15個(gè)物種在我國也有分布(李揚(yáng)等, 2010; Lüet al, 2012;徐國雙等, 2015), 但尚未有產(chǎn)毒的報(bào)道(徐國雙等,2015)。然而近年我國海域海產(chǎn)品中陸續(xù)有 DA的檢出報(bào)道 (宋琍琍等, 2008; 吉薇等2011; 王恒等2011),表明DA產(chǎn)毒物種在我國海域的真實(shí)存在。

本文從我國東南海域建立擬菱形藻單克隆培養(yǎng)株系, 結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子分類學(xué)技術(shù), 開展物種識(shí)別的工作。報(bào)道了我國的2個(gè)新記錄種: 鐮刀擬菱形藻(P.sabit)和中鼓擬菱形藻(P.inflatula)。同時(shí)利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)開展DA的檢測(cè)工作。以期能夠豐富我國擬菱形藻屬的物種多樣性, 并為其毒理研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 單克隆藻株的建立

水平拖曳浮游生物網(wǎng)(篩絹孔徑 10μm)進(jìn)行采樣,盡快將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室。利用毛細(xì)管復(fù)洗法在倒置顯微鏡(Mshot MI-12)下分離目標(biāo)藻細(xì)胞, 經(jīng)過多洗水洗和轉(zhuǎn)移, 以確保目標(biāo)藻的純化。最后轉(zhuǎn)移至預(yù)先滴有L培養(yǎng)基的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(Lundholmet al, 2006),放置在光照強(qiáng)度約 50—80μmol photons/(m2·s)、光周期12h∶12h, 溫度(20±2)°C的條件下培養(yǎng)。待其存活并繁殖達(dá)到約100個(gè)藻細(xì)胞之后, 轉(zhuǎn)移到盛有L培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中培養(yǎng), 以MC(Marine collection)序列進(jìn)行編號(hào), 具體藻株信息詳見表1。

表1 本文建立的目標(biāo)藻株信息Tab.1 List and information of the monoclonal strains in this study

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡(light microscopy, LM)觀察: 取處于對(duì)數(shù)生長期的藻液 0.1mL, 滴在載玻片上, 蓋上玻片后, 利用 Olympus BX53進(jìn)行微分干涉(differential interference contrast, DIC)的觀察, 并使用 Olympus DP27數(shù)碼相機(jī)拍照, 在Olympus CellSens軟件上獲取圖像信息。主要觀察群體特征、細(xì)胞色素體形態(tài)等。

透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察: 取對(duì)數(shù)生長期的藻液 2mL, 加入等量濃硫酸(＞95%)以去除有機(jī)質(zhì), 然后用蒸餾水多次水洗至中性(徐國雙等, 2015)。用微量進(jìn)樣器吸取5—10μL酸化后的水樣, 滴加在噴鍍碳膜的銅網(wǎng)(100目)上,自然晾干后, 即可在JEM-1010 TEM下觀察和拍照。主要觀察殼面超微結(jié)構(gòu), 如點(diǎn)條紋、肋突、孔紋等。

1.3 分子系統(tǒng)學(xué)分析

離心法收集處于對(duì)數(shù)生長期的藻細(xì)胞, 進(jìn)行總DNA的提取(Lundholmet al, 2002)。利用引物ITS1和 ITS4進(jìn)行核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)的擴(kuò)增(Limet al, 2013), PCR產(chǎn)物送至上海立菲生物科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。從NCBI下載擬菱形藻種類的ITS nrDNA序列, 使用BioEdit軟件進(jìn)行序列的比對(duì)和矩陣(Limet al, 2013)。基于MrModeltest 2.3的計(jì)算, 選擇最適模型和參數(shù)為GTR+I+G([AC=1.0449], [AG=3.4071], [AT=1.7247],[CG]=0.4855, [CT]=5.9824, [GT]=1.0000, gamma shape=0.5318, nucleotide frequencies: A=0.2099,C=0.2194, G=0.3136, T=0.2574)。用 MrBayes 3.2(Ronquistet al, 2012)構(gòu)建貝葉斯推理樹(Bayesian inference, BI), 用 RAxML-HPC2 (Milleret al, 2010)構(gòu)建最大似然樹(Maximum Likelihood, ML)。以奇異棍形藻Bacillaria paxillifer、新月細(xì)柱藻Cylindrotheca closterium和船斑菱形藻Nitzschia navis-varingica為群外對(duì)照(Tenget al.2014)。

1.4 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及 CBCs(Compensatory base changes)分析

從GenBank下載鐮刀擬菱形藻的ITSrDNA序列,參考序列標(biāo)注, 將其 ITS2片段截下。使用 Mfold(Percopoet al, 2016)在線預(yù)測(cè)鐮刀擬菱形藻 ITS2的二級(jí)結(jié)構(gòu), 所得二級(jí)結(jié)構(gòu)含4個(gè)環(huán)和一個(gè)擬菱形藻屬環(huán)。以鐮刀擬菱形藻二級(jí)結(jié)構(gòu)為同源模板, 使用ITS2 Database (Percopoet al, 2016)在線預(yù)測(cè)本文的5個(gè)鐮刀擬菱形藻單克隆株系, 與其親緣關(guān)系最接近的并基擬菱形藻(P.decipiens)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。中鼓擬菱形藻藻株的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建方法同上。最后使用VARNA(Limet al, 2013)觀察并下載二級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)使用4SALE v.1.7 (Limet al, 2013)軟件中自帶的補(bǔ)償堿基變化(CBCs)功能觀察 CBC差異, 分析生殖隔離情況。

1.5 LC-MS/MS法檢測(cè)藻毒素

取處于生長穩(wěn)定期中后期的藻液 300—600mL,藻細(xì)胞濃度約5×105ind./mL, 經(jīng)0.2μm醋酸纖維濾膜過濾, 收集藻細(xì)胞立刻置于-20°C冰箱中保存; 另外取5mL混勻的藻細(xì)胞加2mL魯格-4°C保存, 用于單細(xì)胞產(chǎn)毒量的計(jì)算。將已收集的藻細(xì)胞加 4mL甲醇水(甲醇∶水=1∶1)充分混勻, 用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)冰浴破碎 5min, 經(jīng) 0.22μm 濾膜過濾, 濾液于-20°C下保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)樣品皆寄往中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所上機(jī)檢測(cè)。

采用 Prominence UFLC 超快速液相色譜(Shimadzu公司)和5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(SCIEX公司)對(duì)預(yù)處理的樣品進(jìn)行DA檢測(cè), 參見Wu等(2014)方法進(jìn)行分析。DA標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Sigma公司。

2 結(jié)果

結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)和ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)特征,鑒定到我國沿海擬菱形藻兩個(gè)新記錄種: 鐮刀擬菱形藻P.sabitTeng, Lim, Lim & Leaw (MC990、MC3013、MC3014、MC3039)和中鼓擬菱形藻P.inflatula(Hasle) Hasle (MC3086、MC3087)。

2.1 形態(tài)學(xué)描述

鐮刀擬菱形藻Pseudo-nitzschia sabitTeng, Lim,Lim & Leaw (圖 1A—G)

細(xì)胞具有兩個(gè)黃褐色的色素體, 對(duì)稱分布在橫軸兩側(cè), 相鄰兩細(xì)胞間非對(duì)稱分布, 可形成非直線鏈狀群體(圖1A), 重疊部為殼面全長的1/10—1/12。細(xì)胞殼面縱軸呈現(xiàn)鐮刀狀(圖1B, C), 殼端鈍圓(圖1C),兩殼端形狀相似。殼面長28—47μm, 寬1.8—2.2μm。管殼縫強(qiáng)烈偏心, 值得注意的是管殼縫位置有所不同, 有的處于凸面(圖1B), 有的處于凹面(圖1C)。具有中央較大船骨點(diǎn)(圖1E)。肋突分布在殼緣, 排列不規(guī)則(圖1F), 密度為20—27個(gè)/10μm。點(diǎn)條紋主要由兩排孔紋組成, 偶爾會(huì)出現(xiàn)單排孔紋(圖 1E), 密度為41—48條/10μm?？准y為不規(guī)則的多邊形, 密度為1μm內(nèi)11—14個(gè)。本文只觀察到第二和第三條環(huán)帶(圖1G), 第二條環(huán)帶寬1—2個(gè)孔紋, 高1—2個(gè)孔紋,點(diǎn)條紋密度50—54個(gè)/10μm, 孔紋內(nèi)部由多邊形的篩孔構(gòu)成(圖 1G); 第三條環(huán)帶具有一排縱向排列的孔紋(圖 1G)。

圖1 鐮刀擬菱形藻Fig.1Pseudo-nitzschia sabit

生態(tài): 海水浮游生活。

分布: 標(biāo)本采自臺(tái)灣海峽(4月)和南海北部(6月)。本種曾報(bào)道于馬來西亞和墨西哥(Tenget al,2015)。

中鼓擬菱形藻Pseudo-nitzschia inflatula(Hasle)Hasle(圖 2A—F)

細(xì)胞具有兩個(gè)黃褐色的色素體, 對(duì)稱分布在橫軸兩側(cè), 可形成鏈狀群體(圖2A), 重疊部為殼面全長的1/10—1/11。細(xì)胞殼面縱軸呈線形(圖2B), 兩殼端形狀相似。殼面長 67—74μm, 寬 1.0—1.3μm。管殼縫強(qiáng)烈偏心(圖 2D)。有中央較大船骨點(diǎn)(圖 2D)。肋突分布在殼緣, 排列不規(guī)則(圖 2C, D), 密度為23—28個(gè)/10μm。點(diǎn)條紋由單排孔紋組成, 密度為46—50條/10μm。孔紋內(nèi)部的篩板膜分成 1—3個(gè)分區(qū), 以上下2個(gè)分區(qū)為主, 每個(gè)分區(qū)為不規(guī)則的多邊形, 孔紋密度1μm內(nèi)6—9個(gè)?？捎^察到2條環(huán)帶(圖2E, F), 殼環(huán)帶寬2個(gè)孔紋, 高3個(gè)孔紋, 點(diǎn)條紋密度59—63個(gè)/10μm, 孔紋內(nèi)部有裂縫, 分成不規(guī)則的多邊形(圖2E, F); 第二條環(huán)帶寬2個(gè)孔紋, 高2個(gè)孔紋。

生態(tài): 海水浮游生活。

分布: 標(biāo)本采自南海北部(6月)。本種曾報(bào)道于丹麥海峽和亞南極的太平洋(Hasle 1997)、泰國(Priisholmet al, 2002; Lundholmet al, 2006; Quijano-Scheggiaet al, 2009)、墨西哥(Hernández-Becerrilet al,2006)、馬來西亞(Tenget al, 2013)。

圖2 中鼓擬菱形藻Fig.2 Pseudo-nitzschia inflatula

2.2 基于ITS序列分析的分子系統(tǒng)學(xué)分析

本文利用RAxML對(duì)ITS1-5.8S-ITS2序列的939個(gè)堿基進(jìn)行了比對(duì)分析, 建立了分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。MC990與MC3111、MC3013與MC3014的基因完全相同, 后兩個(gè)株系與前兩個(gè)株系有1個(gè)堿基的差異, MC3039與前四個(gè)株系的遺傳差異最大, 有 5個(gè)堿基的差異。MC990、MC3111與馬來西亞株系(PnPd96)基因完全相同, 與墨西哥株系(Ps147、Ps149、Ps283)有 1—2個(gè)堿基的差異。本文建立的5個(gè)株系與已報(bào)道的 5株鐮刀擬菱形藻聚在同一個(gè)分支上, 且具有較高的置信值(BPP=0.84, ML=85), 這表明分子分類的結(jié)果也支持形態(tài)鑒定的結(jié)論。

以往對(duì)中鼓擬菱形藻的認(rèn)知主要是形態(tài)特征,分子數(shù)據(jù)較少, NCBI上只有一個(gè)株系(no7)提供了分子序列信息。本文建立的2個(gè)單克隆株系(MC3086、MC3087)在形態(tài)學(xué)上與以往報(bào)道的中鼓擬菱形藻完全相符。MC3086與MC3087基因完全相同, 與泰國株系(no7)有 6個(gè)堿基的差異, 應(yīng)該是不同地理株系之間的差異。這三個(gè)株系聚為一枝, 并且具有較高的置信值(BPP=1, ML=100), 也表明分子系統(tǒng)發(fā)育樹的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果相一致。

圖3 基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-5.8S-ITS2的分子系統(tǒng)樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree inferred from ITS1-5.8S-ITS2 rDNA

2.3 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

鐮刀擬菱形藻和中鼓擬菱形藻的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)模型具有四個(gè)單環(huán)和一個(gè)擬環(huán)IIa(圖4, 5), 與其他擬菱形藻種類的 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致(Tenget al,2014; Percopoet al, 2016)。鐮刀擬菱形藻ITS2–RNA的標(biāo)志性區(qū)間位于helix III, 31-bp信號(hào)區(qū)域: 5'-UUG UUA CUA GCU GUU CGA ACG AUU ACU AAA A-3′。本文 4個(gè)鐮刀擬菱形藻株系(MC990、MC3013、MC3014、MC3111)與之前報(bào)道的馬來西亞株系(PnPd96)和墨西哥株系(Ps147、Ps149、Ps283)具有完全一致的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu), 只有 MC3039與前四個(gè)實(shí)驗(yàn)株系有 3個(gè) SNPs(單核苷酸多態(tài)性)的差異, 沒有CBC和 hemi-CBC(HCBC)的差異, 這表明 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)論亦支持形態(tài)學(xué)與分子分類的鑒定結(jié)果。將本文的鐮刀擬菱形藻與系統(tǒng)發(fā)育樹上親緣關(guān)系最近的并基擬菱形藻相比較, 發(fā)現(xiàn)與并基擬菱形藻株系(GranCan4-1)在helix Ⅲ上有2個(gè)CBCs和3個(gè)HCBCs的差異。

本文的2個(gè)中鼓擬菱形藻株系(MC3086、MC3087)具有完全相同的二級(jí)結(jié)構(gòu), 與泰國株系(no7)在helixⅢ上有一個(gè)SNP差異, 沒有CBC和HCBC的差異,這表明ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)論也支持形態(tài)學(xué)與分子分類學(xué)的鑒定結(jié)果。中鼓擬菱形藻 ITS2–RNA的標(biāo)志性區(qū)間位于helixⅢ, 33-bp信號(hào)區(qū)域: 5′-UUG UUG GUA GCC UGU UUG CGA UCA CAA CAA GUC-3′。在4SALE軟件中將本研究的中鼓擬菱形藻株系與分子系統(tǒng)樹中親緣關(guān)系較接近的格氏擬菱形藻(P.granii)株系(UBC100)和亞弧線擬菱形藻(P.subcurvata)株系(1-F)相比較, 發(fā)現(xiàn)與后兩者均存在4個(gè)CBCs的差異, 存在生殖隔離, 應(yīng)該分別隸屬于不同物種。

圖4 鐮刀擬菱形藻ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The secondary structure of ITS2-RNA in Pseudo-nitzschia sabit strain MC990

圖5 中鼓擬菱形藻ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.5 The secondary structure of ITS2-RNA in Pseudo-nitzschia inflatula strain MC3087

2.4 DA產(chǎn)毒特征的LC-MS檢測(cè)

以 DA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo), 建立DA的LC-MS檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線, DA濃度為50—500μg/L時(shí), 其峰面積與質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系(R2=0.99934), 回歸方程為:y=164.64875x-3947.22457。本方法的檢測(cè)下限為 50ng/mL。DA的出峰保留時(shí)間為 0.77min。對(duì)常規(guī)培養(yǎng)的鐮刀擬菱形藻和中鼓擬菱形藻進(jìn)行 LC-MS檢測(cè), 結(jié)果在預(yù)定的保留時(shí)間內(nèi)都未出現(xiàn)樣品峰。表明藻株在本檢測(cè)限內(nèi)未檢到DA的存在。

3 討論

3.1 相似種的比較研究

3.1.1 鐮刀擬菱形藻與相似種的比較研究 鐮刀擬菱形藻最典型的形態(tài)特征是殼面呈現(xiàn)獨(dú)特的鐮刀狀, 該種類的殼面寬度小于3μm, 點(diǎn)條紋由兩排孔紋組成, 而且點(diǎn)條紋密度大于 40條/10μm, 屬于 CladeⅡ: 柔弱擬菱形藻類群(Tenget al, 2015)。分子系統(tǒng)學(xué)的研究已經(jīng)證實(shí), 擬菱形藻屬內(nèi)的多個(gè)復(fù)合群, 都是基于相似形態(tài)學(xué)特征而建立的種類集群, 并不能反映各個(gè)種類之間的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系(Lundholmet al, 2006;Quijano-Scheggiaet al, 2009; Tenget al, 2015, 2016)。本研究的鐮刀擬菱形藻點(diǎn)條紋密度(41—48條/10μm)略高于以往報(bào)道(38—45條/10μm)(Tenget al, 2015),明顯高于柔弱擬菱形藻類群中的阿雷擬菱形藻(34—43 條/10μm)(Quijano-Scheggiaet al, 2009)、柔弱擬菱形藻(34—40條/10μm)(Lundholmet al, 2006)、疑難擬菱形藻(30—36條/10μm)(Lundholmet al, 2006)和P.lineola(Cleve) Hasle(22—31條/10μm)(Lundholmet al, 2012)。鐮刀擬菱形藻與微孔擬菱形藻和多紋擬菱形藻都具有兩排孔紋, 孔紋形狀也相似, 但前者具有中央船骨點(diǎn), 而后兩種沒有(Tenget al, 2015)。鐮刀擬菱形藻與亞弧線擬菱形藻具有相似的殼面(鐮刀狀VS一殼面邊緣有凸起)及寬度(1.8—2.2μm VS 1.3—2.5μm)(Hasleet al, 1997; Almandozet al, 2008),兩者在光鏡下易混淆, 但是前者為長鏈狀群體生活,而后者以單個(gè)細(xì)胞生活為主(Hasleet al, 1997;Almandozet al, 2008), 此外在電鏡下還是比較容易區(qū)分的, 如肋突密度前者(20—27個(gè)/10μm)明顯高于后者(12—22 個(gè)/10μm) (Almandozet al, 2008)。

在擬菱形藻分類學(xué)中, 環(huán)帶特征(環(huán)帶數(shù)目、點(diǎn)條紋密度、環(huán)帶上孔紋形狀)可以作為區(qū)分不同種類或變種的重要指標(biāo)(Lundholmet al, 2003, 2006, 2012;Amatoet al, 2008; Limet al, 2013), 例如依據(jù)環(huán)帶上孔紋形狀而劃分的尖刺擬菱形藻的三個(gè)變種: 尖刺擬菱形藻原變種、尖刺擬菱形藻阿維羅變種和尖刺擬菱形藻環(huán)帶變種(Casteleynet al, 2008)。鐮刀擬菱形藻的環(huán)帶特征也有其獨(dú)特之處, 絕大多數(shù)擬菱形藻具有3條環(huán)帶, 而鐮刀擬菱形藻有4條環(huán)帶(Teng etal,2015)。鐮刀擬菱形藻殼環(huán)帶上點(diǎn)條紋的數(shù)目(49—58條/10μm)(Tenget al, 2015)明顯高于柔弱擬菱形藻復(fù)合群中的阿雷擬菱形藻(40—50條/10μm)(Quijano-Scheggiaet al, 2009)、柔弱擬菱形藻(43—48 條/10μm)(Lundholmet al, 2006)和疑難擬菱形藻(40—44條/10μm)(Lundholmet al, 2006), 略高于其形態(tài)與遺傳最接近的并基擬菱形藻(48—55條/10μm)(Lundholmet al, 2006)。

鐮刀擬菱形藻的遺傳相似種類主要有兩個(gè): 并基擬菱形藻和銀河擬菱形藻。鐮刀擬菱形藻與并基擬菱形藻的親緣關(guān)系最為接近, 但兩者形態(tài)上存在明顯差異, 最大的區(qū)別在于前者的殼面呈獨(dú)特的鐮刀狀(Tenget al, 2015)。鐮刀擬菱形藻與銀河擬菱形藻在形態(tài)學(xué)上最明顯的區(qū)別是: 前者的點(diǎn)條紋由兩排孔紋構(gòu)成, 而后者點(diǎn)條紋中未見明顯的孔紋(徐國雙等, 2015)。

3.1.2 中鼓擬菱形藻與相似種的比較研究有報(bào)道認(rèn)為中鼓擬菱形藻的主要形態(tài)特征是點(diǎn)條紋由單排孔紋組成, 殼面中部略鼓起, 接近殼端也出現(xiàn)局部膨脹(Priisholmet al, 2002; Hernández-Becerrilet al, 2006)。但是本文的中鼓擬菱形藻接近線形, 殼面中央略有膨脹, 或有時(shí)不明顯; 而且殼端未見局部膨脹。因此本文認(rèn)為這兩個(gè)特征對(duì)于中鼓擬菱形藻是不穩(wěn)定的。該種類在透射電鏡下比較容易區(qū)分, 因此以往對(duì)中鼓擬菱形藻的鑒定主要是進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察(Hasle, 1997; Priisholmet al, 2002; Hernández-Becerrilet al, 2006; Tenget al, 2013), 現(xiàn)有的分子數(shù)據(jù)較少。本文鑒定的中鼓擬菱形藻與以往報(bào)道的泰國株系(Priisholmet al, 2002)在形態(tài)學(xué)上更為接近, 但也存在一些差異。如泰國株系(1.3—1.8μm)寬度明顯大于本文株系(1.0—1.3μm)。在點(diǎn)條紋密度上, 本文株系(46—50 條/10μm)稍高于泰國株系(38—46 條/10μm),而在殼環(huán)帶點(diǎn)條紋密度上, 本文株系(59—63μm)也明顯高于泰國株系(46—52條/10μm)。在ITS序列系統(tǒng)樹中, 本文株系與泰國株系聚在同一個(gè)分枝, 而且具有較高置信值。同時(shí)鑒于ITS2-RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)論, 我們認(rèn)為上述形態(tài)差異應(yīng)該是地理分布差異引起的。中鼓擬菱形藻屬于偽柔弱擬菱形藻復(fù)合群中的一員, 其中與其形態(tài)最為相似的是偽柔弱擬菱形藻(P.pseudodelicatissima)和尖細(xì)擬菱形藻 (P.cuspidate)。本文中鼓擬菱形藻的點(diǎn)條紋密度和殼環(huán)帶上點(diǎn)條紋密度明顯高于偽柔弱擬菱形藻(36—43條/10μm; 48—55 條/10μm)和尖細(xì)擬菱形藻(35—44 條/10μm; 47—53 條/10μm)(Lundholmet al, 2003)。在孔紋內(nèi)部篩板膜的分區(qū)上, 中鼓擬菱形藻具有1—3個(gè),以上下不規(guī)則的2個(gè)分區(qū)為主, 而后兩者孔紋則分成較均勻的2個(gè)分區(qū)。

在分子系統(tǒng)學(xué)中, 由于中鼓擬菱形藻與擬菱形藻屬中其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 在以往研究中多被作為外類群(Lundholmet al, 2006)。但中鼓擬菱形藻與格氏擬菱形藻、亞弧線擬菱形藻的親緣關(guān)系相對(duì)較近, 然而前者與后兩者在形態(tài)學(xué)上卻存在明顯區(qū)別。雖然三者細(xì)胞殼面都是中部膨大, 但是中鼓擬菱形藻殼面中部膨脹的特征不是很明顯, 而后兩者較明顯。在孔紋形狀上前者孔紋主要分成2部分, 而后兩者孔紋分成4—6部分(Almandozet al, 2008)。此外在肋突密度和點(diǎn)條紋密度上也存在些許差別。值得注意的是, 本研究對(duì)格氏擬菱形藻(UBC100)和亞弧線擬菱形藻 (圖 1F)的 ITS序列進(jìn)行比對(duì), 發(fā)現(xiàn)兩者只有7個(gè)堿基差異, 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中它們也聚在一起, 而且具有較高置信值(圖 3)。甚至它們的ITS2-RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)不存在CBC或HCBC的差異。Hasleet al在1997年對(duì)這兩個(gè)種類進(jìn)行了描述, 主要依據(jù)兩者殼面特征進(jìn)行區(qū)分, 認(rèn)為亞弧線擬菱形藻的一邊殼緣凸起, 另一邊殼緣是直線或稍微出現(xiàn)凹面, 而格氏擬菱形藻細(xì)胞殼面中部膨大, 兩邊殼緣都凸起。此外, 它們?cè)趯挾?、肋突密度、點(diǎn)條紋密度上也完全一樣。格氏擬菱形藻和亞弧線擬菱形藻之間更為清晰的種類界限, 需要后續(xù)研究加以澄清。

3.2 擬菱形藻屬DA產(chǎn)毒特征分析

Teng等(2015)首次報(bào)道了鐮刀擬菱形藻 , 樣品采自馬來西亞和墨西哥, 但未檢測(cè)到DA的存在。而中鼓擬菱形藻最早報(bào)道于丹麥海峽和亞南極的太平洋, 至今未有產(chǎn)生DA的直接報(bào)道。本文從我國東南海域分離并建立了4株鐮刀擬菱形藻和2株中鼓擬菱形藻培養(yǎng)株系, 利用 LC-MS技術(shù)對(duì)其產(chǎn)毒特征進(jìn)行檢測(cè), 也沒有檢測(cè)到 DA的存在。截至目前, 全球已報(bào)道能夠產(chǎn)生DA的擬菱形藻種類達(dá)到24種(Lelonget al, 2012; Lundholm, 2017; Tenget al, 2016), 其中15種在我國也有分布(徐國雙等, 2015), 但是目前尚未有我國擬菱形藻產(chǎn)毒的直接報(bào)道。近年來我國沿海的部分水產(chǎn)品中卻已有 DA的檢出報(bào)道(宋琍琍等,2008; 吉薇等, 2011; 王恒等, 2011), 并且采集的浮游植物網(wǎng)樣品中亦有檢出(深圳大鵬澳, 2016年8月, 濃縮網(wǎng)樣中DA的含量9.56—13.28mg/L, 黃春秀等, 未發(fā)表數(shù)據(jù)), 但本數(shù)據(jù)由于拖網(wǎng)濾過的實(shí)際海水體積無法計(jì)算, 因此只能用于定性, 而不能定量分析。因此上述DA的生物來源是什么？有待后續(xù)研究的持續(xù)深入。

擬菱形藻的產(chǎn)毒能力是一個(gè)比較復(fù)雜的情況,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)影響擬菱形藻產(chǎn)毒的因素進(jìn)行了分析(Lelonget al, 2012), 如硅和磷限制可以促進(jìn)DA的產(chǎn)生, 低濃度的鐵和高濃度的銅也能激發(fā) DA的產(chǎn)生;有機(jī)氮源、pH、二氧化碳、鹽度、細(xì)菌濃度等的變化都能影響擬菱形藻屬產(chǎn)DA(Lelonget al, 2012)。

4 結(jié)論

(1) 結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)數(shù)據(jù), 發(fā)現(xiàn)并鑒定了我國擬菱形藻屬的兩個(gè)新記錄種, 分別是鐮刀擬菱形藻P.sabit和中鼓擬菱形藻P.inflatula, 豐富了我國擬菱形藻屬的物種多樣性。

(2) 對(duì)所建立的7個(gè)擬菱形藻株系進(jìn)行了DA檢測(cè), 未檢測(cè)到DA的存在。

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TWO NEW RECORDS OF DIATOM GENUSPSEUDO-NITZSCHIAAND THEIR DOMOIC ACID PRODUCTION IN SOUTHEASTERN CHINA COASTAL WATERS

HUANG Chun-Xiu, DONG Huan-Chang, LI Yang
(Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring,Guangdong Provincial Key Laboratory of Healthy and Safe Aquaculture,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou510631,China)

A set of monoclonal strains was isolated and established from the southeastern China coastal waters.These strains were identified carefully using morphology in light microscopy and transmission electron microscopy.Their molecular data from internal transcribed spacer region of ribosomal rRNA encoding gene were characterized, and compared with the secondary structure of ITS2 RNA transcripts.Two new recorded species were found for China,P.sabitTeng, Lim, Lim & Leaw andP.inflatula(Hasle) Hasle.Their morphology were compared with both morphology-similar and molecule-close taxa, and the unique molecular feature for the secondary structure of ITS2-RNA was analyzed.Meanwhile, the production of domoic acid was examined in liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)injection.However, it showed no detectable domoic acid.The new records enrich the diversity of the genusPseudo-nitzschiain China, and may provide detail information of domoic acid production inPseudo-nitzschiastrains.

Pseudo-nitzschia sabit;Pseudo-nitzschia inflatula; diversity; morphology; internal transcribed spacer; ITS2-RNA secondary structure; domoic acid

Q949.2

10.11693/hyhz20161200288

* 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目, 31570205號(hào), 31370235號(hào); 廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目, 201607010370號(hào)。黃春秀, 碩士研究生,E-mail: 3127166788@qq.com

① 通訊作者: 李 揚(yáng), 研究員, E-mail: liyang@scnu.edu.cn

2016-12-24, 收修改稿日期: 2017-04-11