覃川杰 文正勇 袁登越 邵 婷 龔 全

(1.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 長(zhǎng)江上游魚(yú)類(lèi)資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)江 641112;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所 成都 611731)

瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrus vachellii)脂肪酸去飽和酶FAD2和延伸酶ELOVL5的克隆及表達(dá)分析*

覃川杰1文正勇1袁登越1邵 婷1龔 全2

(1.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 長(zhǎng)江上游魚(yú)類(lèi)資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)江 641112;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所 成都 611731)

脂肪酸去飽和酶(FAD, fatty acyl desaturase)及延伸酶(ELOVL, elongases of very long chain fatty acids)在魚(yú)類(lèi)脂肪代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。利用RT-PCR克隆得到瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrus vachellii)肝臟中控制高不飽和脂肪酸合成的(FAD2)和(ELOVL5)基因cDNA 序列。瓦氏黃顙魚(yú)FAD2 cDNA片段長(zhǎng)2041bp, 編碼447個(gè)氨基酸, 含有3個(gè)組氨酸簇(HDxGH, HxxHH, QxxHH), 含亞鐵血紅素結(jié)合基序(HPGG)的類(lèi)似細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域等。瓦氏黃顙魚(yú)ELOVL5 cDNA片段長(zhǎng)1065bp, 編碼 294個(gè)氨基酸, 含有組氨酸簇(HxxHH)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留信號(hào)(K、R)和 4個(gè) ELO 共有的保守區(qū)域(KxxExxDT, QxxFLHxYHH, NxxxHxxMYxYY, TxxQxxQ)等結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR分析表明, FAD2和ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚(yú)腦、肝臟的表達(dá)量最高, 顯著高于腸道、脾臟、腎臟、鰓等組織。結(jié)果表明, 瓦氏黃顙魚(yú)具有合成高不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶 FAD2和 ELOVL5, 且肝臟為合成高不飽和脂肪酸的主要場(chǎng)所。

脂肪酸去飽和酶(FAD2); 脂肪酸延伸酶(ELOVL5); 瓦氏黃顙魚(yú); cDNA

瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrus vachellii)是一種偏肉食性的雜食性魚(yú)類(lèi), 隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagride)、黃顙魚(yú)屬(Pelteobagrus), 其肉細(xì)嫩、味道鮮美, 深受消費(fèi)市場(chǎng)青睞(丁瑞華, 1994)。該魚(yú)體型較大、生長(zhǎng)快, 已成為我國(guó)重要的淡水名優(yōu)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。目前, 吳代武等(2017)發(fā)現(xiàn), 飼料中添加過(guò)高的植物蛋白會(huì)明顯降低黃顙魚(yú)(P.fulvidraco)生長(zhǎng), 飼喂魚(yú)蛋白水解物日糧使黃顙魚(yú)肌肉游離氨基酸含量的升高, 特別是呈味氨基酸含量增加。飼料中添加豆油不會(huì)顯著影響瓦氏黃顙魚(yú)的增重率、肝體指數(shù)和體成分等, 但會(huì)影響肌肉中脂肪酸的組成, 增加肌肉中C18:1n-9、C18:2n-6和單不飽和脂肪酸比例(邵婷等,2017)。變換晝夜投喂時(shí)間會(huì)顯著影響肝臟中?；?CoA去飽和酶(acyl-CoA desaturase), 葡萄糖-6-磷酸酯 酶(glucose-6-phosphatase), γ-谷 氨 酰轉(zhuǎn)肽 酶 1(gamma- glutamyltranspeptidase 1), 胰凝乳蛋白酶 B(chymotrypsin B)等與蛋白、脂肪和糖代謝的相關(guān)基因mRNA的表達(dá)(Qinet al, 2017)。因此, 深入分析瓦氏黃顙魚(yú)高不飽和脂肪酸的生物合成能力有助于制定合理的飼料配方。

魚(yú)類(lèi)必需營(yíng)養(yǎng)素中的高度不飽和脂肪酸(high unsaturation fatty acids, HUFAs), 尤其是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acids, DHA), 它們對(duì)維持生物機(jī)體的正常機(jī)能, 促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖, 以及提高成活率等方面起著重要生理作用。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中大部分HUFAs的來(lái)源主要是魚(yú)油, 但由于其高昂的價(jià)格,增加了養(yǎng)殖成本, 導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益降低; 因而, 缺乏高不飽和脂肪酸的豆油等植物油被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料(覃川杰等, 2013)。一般而言, 魚(yú)類(lèi)可以通過(guò)n-3和/或n-6的途徑去飽和及碳鏈的延長(zhǎng)作用, 將植物產(chǎn)品中的18:3 n-3及18:2 n-6脂肪酸分別轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈高不飽和脂肪酸(Cooket al, 2002)。但不同魚(yú)類(lèi)合成HUFAs的能力相差比較明顯, 如淡水魚(yú)類(lèi)的高不飽和脂肪酸的合成能力明顯優(yōu)于海水魚(yú)類(lèi)(Tocheret al,1999, 2006)。因此, 了解和掌握養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成能力, 有助于在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中合理利用不同的脂肪源。研究表明, 脂肪酸去飽和酶Δ6和脂肪酸延伸酶 ELOVL5在動(dòng)物高效利用植物脂肪過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用(Xueet al, 2014), 且脂肪酸去飽和酶和延長(zhǎng)酶普遍存在于多數(shù)淡水魚(yú)類(lèi)中(Agabaet al, 2005)。目前, 只從少數(shù)幾種魚(yú)類(lèi)克隆了脂肪酸去飽和酶和延伸酶的 cDNA, 且主要集中在海水魚(yú)類(lèi), 如軍曹魚(yú)Rachycentron canadum, 大西洋鱈Gadus morhua等(許友卿等, 2010; Xueet al, 2014); 赤鱸Perca fluviatilis和草魚(yú)Ctenopharyngodon idellus等淡水魚(yú)類(lèi)中開(kāi)展了相關(guān)研究(杜嵇華等, 2011; Geayet al,2016)。作者在本文中對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)的 FAD2和ELOVL5 cDNA序列進(jìn)行克隆, 并分析該兩種基因在瓦氏黃顙魚(yú)中的表達(dá), 以期進(jìn)一步探討瓦氏黃顙魚(yú)合成HUFAs的可能性及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為鮮活瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrus vachellii) (體重約15g/尾), 購(gòu)于內(nèi)江某養(yǎng)殖場(chǎng)。將實(shí)驗(yàn)魚(yú)置于冰上麻醉, 然后處死, 同時(shí)將其肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腸道、腎臟、鰓和腦取出, 液氮速凍, 置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

按照 RNAiso Plus (TaKaRa)試劑操作步驟提取瓦氏黃顙魚(yú)肝臟總 RNA; 以肝臟總 RNA為模板,oligo(dT)20為逆轉(zhuǎn)錄引物, 按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。

1.3 瓦氏黃顙魚(yú)FAD2和ELOVL5基因cDNA克隆

根據(jù)人、豬以及魚(yú)等物種的 FAD2和 ELOVL5基因保守區(qū)域, 設(shè)計(jì)PCR簡(jiǎn)并引物(上海生工合成)。以瓦氏黃顙魚(yú)的肝臟cDNA為模板, 采用rTaq DNA聚合酶(TaKaRa), 以簡(jiǎn)并引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。用Biometra PCR儀擴(kuò)增, PCR反應(yīng)參數(shù)為: 94℃熱啟動(dòng)4min, 然后 94℃變性 30s, 50℃ (FAD2)和 52℃(ELOVL5)分別退火30s, 再72℃延伸1min, 30個(gè)循環(huán),72℃ 10min終止反應(yīng)。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳, 將含有目的 DNA片段的瓊脂糖凝膠切下, 然后使用 Tiangene DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。具體操作步驟按天根公司試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 擴(kuò)增片段的克隆與測(cè)序

將PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳純化后, 再經(jīng)HQ & Q.Gel Extraction Kit II (U-gene)回收后, 將其克隆至pMD 18-T載體上(TaKaRa), 轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109, 利用M13正、反向引物, 通過(guò)PCR反應(yīng),檢測(cè)得到陽(yáng)性克隆, 由上海生工公司測(cè)序。

1.5 基因片段的序列分析

將測(cè)序后所得的瓦氏黃顙魚(yú) FAD2和 ELOVL5 cDNA片段序列, 在BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行同源比較。提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)后, 再根據(jù)所得到的cDNA序列, 推導(dǎo)其FAD2和ELOVL5氨基酸序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi); 再采用Expert Protein Analysis System (http://us.expasy.org/)以及 ANTHEPROT 2000 V5.2軟件推導(dǎo)cDNA片段所得的FAD2和ELOVL5功能位點(diǎn)。

1.6 組織表達(dá)分析

按照RNAiso Plus (TaKaRa)試劑操作步驟分別提取9尾瓦氏黃顙魚(yú)肝臟、肌肉、腸道、心臟、脾臟、腎臟、鰓和腦總RNA后, 用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑合成cDNA。根據(jù)已獲得瓦氏黃顙魚(yú) FAD2和 ELOVL5 cDNA設(shè)計(jì)基因特異性引物分析組織表達(dá), 特異性序列見(jiàn)表 1。以β-actin為內(nèi)參基因(表 1)(Zhenget al,2010), 采 用 2–ΔΔct法(Livaket al, 2001), 按 照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑操作步驟和 Roche Light Cycler Nano (USA)熒光定量PCR儀分析檢測(cè)FAD2和ELOVL5 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示試驗(yàn)數(shù)據(jù),采用SPSS18.0軟件處理試驗(yàn)結(jié)果。基于單因方差分析基礎(chǔ)上, 采用 Duncan多重比較法對(duì)組間差異進(jìn)行檢驗(yàn), 當(dāng)P＜0.05則為存在顯著差異。

表1 PCR引物序列Tab.1 The PCR primer sequences

2 結(jié)果與討論

動(dòng)物體內(nèi)可通過(guò)n-6和n-3途徑合成HUFAs。以n-3途徑合成高不飽和脂肪酸, 首先第一步反應(yīng)是由α-亞麻酸(α-linolenic acid, ALA, 18:3n-3)轉(zhuǎn)化為十八碳四烯酸(octadecatetraenoic acid, OTA, 18:4n-3); 而n-6途徑則是由前體物質(zhì)亞油酸(linoleic acid, LA,18:2n-6)轉(zhuǎn) 化 為 γ-亞 麻 酸 (γ-linolenic acid, GLA,18:3n-6); 第一步轉(zhuǎn)化的脫氫反應(yīng)是 n-3和 n-6 合成途徑的限速步驟, Δ6脂肪酸去飽和酶能將 α-亞麻酸和亞油酸分別轉(zhuǎn)化成十八碳四烯酸和亞麻酸, 是由亞油酸和亞麻酸合成高不飽和脂肪酸的限速酶(Tocheret al, 2006)。如果動(dòng)物體內(nèi)缺乏Δ6去飽和酶,或該酶活性受到抑制, 就會(huì)妨礙機(jī)體內(nèi)亞油酸向γ-亞麻酸(n-6途徑)和α-亞麻酸向十八碳四烯酸(n-3途徑)的轉(zhuǎn)化, 影響HUFAs的生物合成(Bellet al, 2009)。然而, 不同魚(yú)類(lèi)Δ6脂肪酸去飽和酶的差異較大; 在大西洋鮭(Salmo salar)等洄游魚(yú)類(lèi)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩種FAD的存在, 它們分別具有Δ5和Δ6的活性(Hastingset al,2005; Zhenget al, 2005), 而斑馬魚(yú)(Danio rerio)FAD則同時(shí)具有Δ5和Δ6活性(Hastingset al, 2001)。本實(shí)驗(yàn)采用 RT-PCR方法獲得瓦氏黃顙魚(yú) FAD基因的cDNA片段, FAD基因cDNA序列片段1904bp, 包括86bp的5’-UTR、480bp的3’-UTR和1338bp的ORF(圖1)。ORF分析獲得 FAD完整的 446個(gè)氨基酸。經(jīng)BLASTp比對(duì)分析發(fā)現(xiàn), 瓦氏黃顙魚(yú)的FAD2氨基酸序列與其他物種的 FAD2氨基酸序列有著高相似性(圖 2)。瓦氏黃顙魚(yú) FAD2氨基酸與虎頭鯊Pangasianodon hypophthalmus(88%, AFN21428.1)、黃顙魚(yú)P.fulvidraco(80%, AJQ20793.1)、墨西哥脂鯉Astyanax mexicanus(76%, XP_007235183.1)、金錢(qián)魚(yú)Scatophagus argus(68%, AHA62794.1)等 FAD2均有很高的同源性(表2)。因此可以推斷所克隆到的cDNA為 FAD2基因片段, 將所得該基因片段提交至GenBank, 登錄號(hào)分別為KY853758。瓦氏黃顙魚(yú)FAD氨基酸序列含有多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(圖 2), 與草魚(yú)C.idellus、刀鱭Coilia nasus、軍曹魚(yú)R.canadum、黃鱔Monopterus albus、黃顙魚(yú)P.fulvidraco等相似(杜嵇華等, 2011; 周秋白等, 2011; 魏廣蓮等, 2014; Songet al, 2015), 含有八個(gè)保守的組氨酸殘基, 構(gòu)成三個(gè)保守組氨酸富集區(qū)(histidine-richregion), 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式表示為HX(3-4)H、HX(2-3)HH、(H/Q)X(2-3)HH (Zhenget al, 2005), 3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)和1個(gè)Fe2＋結(jié)合形成催化活性中心, 還包括亞鐵血紅素結(jié)合基序(HPGG)的類(lèi)似細(xì)胞色素 b5結(jié)構(gòu)域等(Zhenget al,2009)。Δ6脂肪酸去飽和酶是一種膜結(jié)合脂肪酸去飽和酶, 它以細(xì)胞色素b5氧化還原酶和NADH作為電子供體, 用來(lái)催化甘油酯中的脂肪酸脫氫(Sprecheret al, 1995)。此外, NADH-細(xì)胞色素b5還原酶可以通過(guò)FAD中的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域直接向FAD蛋白催化位點(diǎn)傳遞電子, 催化甘油酯中的脂肪酸脫氫, 而不需要細(xì)胞色素b5蛋白參與(Guillouet al, 2010)。前兩個(gè)組氨酸簇位于2個(gè)跨膜區(qū)之間, 第三個(gè)組氨酸簇位于第二個(gè)跨膜區(qū)的后面, 這樣三個(gè)保守的組氨酸簇與鐵離子共同構(gòu)成了 FAD發(fā)揮催化活性的催化中心。2個(gè)跨膜區(qū)對(duì)于它們的細(xì)胞定位和形成適合的空間結(jié)構(gòu)十分重要(Loset al, 1998)。

脂肪酸碳鏈的延伸主要發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)、過(guò)氧化物酶體(peroxisome)和線粒體(mitochondrion)中。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,以脂酰CoA (fatty acyl-CoA)作為起點(diǎn), 通過(guò)縮合、還原、脫水、再還原四個(gè)步驟循環(huán)完成碳鏈的延伸, 合成超長(zhǎng)鏈脂肪酸(very long chain fatty acid, VLCFA)(Leonardet al, 2004)。超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶(elongase of very long chain fatty acid, ELOVL)家族正是催化超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成循環(huán)反應(yīng)中的第一個(gè)限速縮合步驟的酶類(lèi)(Sprecher, 2000)。該家族的蛋白質(zhì)序列中均含有KxxExxDT、HxxHH、HxxMYxYY、TxxQxxQ等相似的結(jié)構(gòu)域。哺乳動(dòng)物體內(nèi)ELOVL家族包含7個(gè)成員, 其中ELOVL5參與延長(zhǎng)單不飽和脂肪酸(C16、C18)和多不飽和脂肪酸(C18、C20、C22)。它能調(diào)控肝臟脂肪及碳水化合物的代謝, 從而影響機(jī)體血脂、血糖濃度(Wanget al, 2008)。目前魚(yú)類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ELOVL5, 并成為HUFA合成代謝研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn),采用RT-PCR克隆得到ELOVL5 cDNA片段1164bp,包括 70bp的 5’-UTR、212bp的 3’-UTR 和 882bp的ORF(圖3); ORF編碼294個(gè)氨基酸, BLASTp比對(duì)分析表明, 該氨基酸序列與其他魚(yú)類(lèi) ELOVL5的氨基酸序列具有較高的相似性(圖 4)。因此可以推斷所克隆到的cDNA片段為瓦氏黃顙魚(yú)ELOVL5基因, 將所得該基因片段提交至 GenBank, 登錄號(hào)分別為KY853759。瓦氏黃顙魚(yú) ELOVL5氨基酸與拉氏巨鯰Pangasius larnaudii(88%, AGR45586.1)、非洲鯰(C.gariepinus, 86%, AAT81405.1)、草魚(yú)(C.idella,81%, ADU04500.1)、墨西哥麗脂鯉(A.mexicanus, 78%,XP_007240116.1)等均有很高的同源性(表2)。瓦氏黃顙魚(yú)ELOVL5基因含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留信號(hào)(K, R)、高度保守的氧化還原中心組氨酸簇(HxxHH, 位于第 2個(gè)跨膜區(qū)內(nèi))以及跨膜區(qū)(QxxFLHxYHH, KxxExxDT,TxxQxxQ, NxxxHxxNYxYY)等結(jié)構(gòu)功能域(圖4)。同樣, 黃顙魚(yú)P.fulvidraco、草魚(yú)C.idella、黃鱔M.albus等魚(yú)類(lèi) ELOVL5基因均含有組氨酸簇、碳末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留信號(hào)、多個(gè)跨膜區(qū)域等, 且在不同魚(yú)類(lèi)中高度保守(杜嵇華等, 2011; 周秋白等, 2011; Songet al,2015), 以上這些結(jié)構(gòu)域?qū)π纬珊线m構(gòu)型和其細(xì)胞定位有著重要的作用(Loset al, 1998)。

圖1 瓦氏黃顙魚(yú)FAD2基因cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequences of FAD2 cDNA and deduced amino acid sequence of P.vachellii

圖2 瓦氏黃顙魚(yú)FAD2基因氨基酸序列與其他物種FADS2基因的氨基酸序列多重比較Fig.2 Alignment of FAD2 of P.vachellii with other homologues using Clustal W program

表2 物種名稱(chēng)、序列號(hào)和相似性Tab.2 Accession number, scientific name and identity of the members of FAD2 and ELOVL5 amino sequences

圖3 瓦氏黃顙魚(yú)ELOVL5基因cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequences of ELOVL5 cDNA and deduced amino acid sequence of P.vachellii

圖4 瓦氏黃顙魚(yú)ELOVL5基因氨基酸序列與其他物種ELOVL5基因的氨基酸序列多重比較Fig.4 Alignment of ELOVL5 of P.vachellii with other homologues using Clustal W program

脂肪酸去飽和酶基因在瓦氏黃顙魚(yú)的 8種組織中均有表達(dá)。在肝臟和腦部的表達(dá)量最高, 其次為心、腸道、腎、脾、鰓, 而在皮膚和肌肉的表達(dá)量相對(duì)較低, 見(jiàn)圖 5。類(lèi)似地, 刀鱭 FAD6在腦、腸道、肌肉、肝臟、腎臟、心、鰓等組織中具有表達(dá), 且刀鱭FAD6基因在腦中的表達(dá)量最高, 并且極顯著地高于其他組織(P＜0.01), 其次是腸道(魏廣蓮等, 2014)。非洲鯰C.gariepinus和赤鱸Perca fluviatilis的FAD2在肝臟和腦中的表達(dá)量也顯著高于腸道、脾臟、腎臟等組織(Geayet al, 2016; Obohet al, 2016)。黃顙魚(yú)P.fulvidracoFAD2 mRNA在肝臟和腦的表達(dá)水平顯著高于肌肉、脾臟和鰓組織, 但顯著低于腸道(Songet al,2015)。類(lèi)似地, 大西洋鱈Gadus morhuaΔ6去飽和酶基因在腦中的表達(dá)量最高, 其次是肝、腎和腸(Tocheret al, 2006)。虹鱒Oncorhynchus mykiss的Δ6 FAD2基因在肝臟、腦、腸道等組織中有著較高的表達(dá)量(Seiliezet al, 2003)。有研究表明, 在幼魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵階段, 魚(yú)體的神經(jīng)組織特別在腦和視網(wǎng)膜中含有高濃度的DHA, 并且DHA和n-3 HUFA的總含量高于其他非神經(jīng)組織中的含量(Tocheret al, 2006)。FAD2在多種魚(yú)類(lèi)的腦中均顯著高于腸道、肝臟等營(yíng)養(yǎng)代謝器官, 究其原因, 可能是腦中需要合成或攝取較多的高不飽和脂肪酸, 用以維持其正常的代謝功能的緣故(Naughton, 1981)。

圖5 FAD2和ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚(yú)組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Distribution of FAD2 and ELOVL5 mRNA in tissues of P.vachellii

脂肪酸延伸酶基因 ELOVL5在瓦氏黃顙魚(yú)的 8種組織中也均有表達(dá), 其中 ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚(yú)腦和肝臟中的表達(dá)量最高, 其次是垂體和腸道, 肌肉和血液中的表達(dá)水平較低(圖 5)。類(lèi)似地,ELOVL5在非洲鯰C.gariepinus和大西洋鱈G.morhua的組織中均有表達(dá)(Xueet al, 2014; Obohet al,2016)。ELOVL5 mRNA在大西洋鱈的腦和鰓組織中的表達(dá)水平要高于肌肉、血液、肝臟和心臟; 而ELOVL5a和ELOVL5b mRNA在大西洋鱈中腸道(幽門(mén)盲囊), 肝臟和腦的表達(dá)水平最高。類(lèi)似于其他多種淡水魚(yú)類(lèi), FAD2和ELOVL2 mRNAs的組織表達(dá)水平表明, 肝臟是魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸生物合成的主要場(chǎng)所(Moraiset al, 2009)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了瓦氏黃顙魚(yú)ELOVL5和FAD2基因cDNA序列, 瓦氏黃顙魚(yú)ELOVL5和FAD2氨基酸序列與其它魚(yú)類(lèi)ELOVL5和FAD2的氨基酸序列具有較高的相似性, 且含有高度保守的結(jié)構(gòu)域。FAD2和ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚(yú)腦、肝臟的表達(dá)量顯著高于腸道、脾臟、腎臟、鰓等組織。結(jié)果表明, 瓦氏黃顙魚(yú)具有合成高不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶FAD2和ELOVL5, 且肝臟可能為合成高不飽和脂肪酸的主要場(chǎng)所。

丁瑞華, 1994.四川魚(yú)類(lèi)志.成都: 四川科學(xué)技術(shù)出版社, 451許友卿, 鄭一民, 丁兆坤, 2010.軍曹魚(yú)Δ6脂肪酸去飽和酶的cDNA序列克隆與基因表達(dá).中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 17(6):1183—1191

杜嵇華, 梁旭方, 程佳齊等, 2011.草魚(yú)脂肪酸去飽和酶和延長(zhǎng)酶基因 cDNA全序列的克隆與分析.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 32(5): 513—520

吳代武, 何 杰, 葉元土等, 2017.日糧中魚(yú)蛋白水解物對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)、體成分和血清生理指標(biāo)的影響.水產(chǎn)學(xué)報(bào),41(3): 415—427

邵 婷, 覃川杰, 袁登越等, 2017.再投喂魚(yú)油對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)肌肉脂肪酸組成的影響.水生生物學(xué)報(bào), 41(1): 139—145

周秋白, 朱長(zhǎng)生, 鄭 宇等, 2011.黃鱔脂肪酸去飽和酶及延長(zhǎng)酶基因cDNA的克隆與表達(dá).江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 34(1):134—140

覃川杰, 頡 江, 王永明等, 2013.植物油替代魚(yú)油影響魚(yú)類(lèi)脂肪代謝的研究進(jìn)展.海洋湖沼通報(bào), (4): 89—100

魏廣蓮, 徐鋼春, 顧若波等, 2014.刀鱭 Δ6脂肪酸去飽和酶cDNA的克隆與組織表達(dá)檢測(cè).南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 37(3):138—144

Agaba M K, Tocher D R, Zheng X Zet al, 2005.Cloning and functional characterisation of polyunsaturated fatty acid elongases of marine and freshwater teleost fish.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology, 142(3): 342—352

Bell M V, Tocher D R, 2009.Biosynthesis of polyunsaturated fatty acids in aquatic ecosystems: general pathways and new directions.In: Kainz M, Brett M T, Arts M T eds.Lipids in Aquatic Ecosystems.New York: Springer, 211—236

Cook H W, McMaster C R, 2002.Fatty acid desaturation and chain elongation in eukaryotes.In: Vance D E, Vance J E.New Comprehensive Biochemistry Volume 36:Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes.4th ed.Amsterdam: Elsevier, 181—204

Geay F, Tinti E, Mellery Jet al, 2016.Cloning and functional characterization of Δ6 fatty acid desaturase (FADS2) in Eurasian perch (Percafluviatilis).Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 191: 112—125

Guillou H, Zadravec D, Martin P G Pet al, 2010.The key roles of elongases and desaturases in mammalian fatty acid metabolism: Insights from transgenic mice.Progress in Lipid Research, 49(2): 186—199

Hastings N, Agaba M, Tocher D Ret al, 2001.A vertebrate fatty acid desaturase with Δ5 and Δ6 activities.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(25): 14304—14309

Hastings N, Agaba M K, Tocher D Ret al, 2005.Molecular cloning and functional characterization of fatty acyl desaturase and elongase cDNAs involved in the production of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids from α-linolenic acid in Atlantic salmon (Salmo salar).Mar Biotechnol, 6: 463—474

Leonard A E, Pereira S L, Sprecher Het al, 2004.Elongation of long-chain fatty acids.Progress in Lipid Research, 43(1):36—54

Livak K J, Schmittgen T D, 2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod.Methods, 25(4): 402—408

Los D A, Muratan N, 1998.Structure and expression of fatty acid desaturases.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism, 1394(1): 3—15

Morais S, Monroig O, Zheng X Zet al, 2009.Highly unsaturated fatty acid synthesis in Atlantic salmon: characterization of ELOVL5- and ELOVL2-like elongases.Marine Biotechnology, 11(5): 627—639

Naughton J M, 1981.Supply of polyenoic fatty acids to the mammalian brain: the ease of conversion of the short-chain essential fatty acids to their longer chain polyunsaturated metabolites in liver, brain, placenta and blood.International Journal of Biochemistry, 13(1): 21—32

Oboh A, Betancor M B, Tocher D Ret al, 2016.Biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids in the African catfishClarias gariepinus: Molecular cloning and functional characterisation of fatty acyl desaturase (fads2) and elongase(elovl2) cDNAs7.Aquaculture, 462: 70—79

Qin C J, Gong Q, Wen Z Yet al, 2017.Comparative analysis of the liver transcriptome ofPelteobagrus vachelliiwith an alternative feeding time.Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 22: 131—138

Seiliez I, Panserat S, Corraze Get al, 2003.Cloning and nutritional regulation of a Δ6-desaturase-like enzyme in the marine teleost gilthead seabream (Sparus aurata).Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology, 135(3): 449—460

Song Y F, Luo Z, Pan Y Xet al, 2015.Three unsaturated fatty acid biosynthesis-related genes in yellow catfishPelteobagrus fulvidraco: Molecular characterization, tissue expression and transcriptional regulation by leptin.Gene,563(1): 1—9

Sprecher H, Luthria D L, Mohammed B Set al, 1995.Reevaluation of the pathways for the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids.Journal of Lipid Research,36(12): 2471—2477

Sprecher H, 2000.Metabolism of highly unsaturatedn-3 andn-6 fatty acids.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 1486(2): 219—231

Tocher D R, Ghioni C, 1999.Fatty acid metabolism in marine fish: Low activity of fatty acyl Δ5 desaturation in gilthead sea bream (Sparus aurata) cells.Lipids, 34(5): 433—434

Tocher D R, Zheng X Z, Schlechtriem Cet al, 2006.Highly unsaturated fatty acid synthesis in marine fish: cloning,functional characterization, and nutritional regulation of fatty acyl Δ6 desaturase of Atlantic cod (Gadus morhua L.).Lipids, 41(11): 1003—1016

Wang Y, Torres-Gonzalez M, Tripathy Set al, 2008.Elevated hepatic fatty acid elongase-5 activity affects multiple pathways controlling hepatic lipid and carbohydrate composition.Journal of Lipid Research, 49(7): 1538—1552

Xue X, Feng C Y, Hixson S Met al, 2014.Rise Characterization of the fatty acyl elongase (elovl) gene family, and hepatic elovl and delta-6 fatty acyl desaturase transcript expression and fatty acid responses to diets containing camelina oil in Atlantic cod (Gadus morhua).Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology,175: 9—22

Zheng X Z, Ding Z K, Xu Y Qet al, 2009.Physiological roles of fatty acyl desaturases and elongases in marine fish:Characterisation of cDNAs of fatty acyl Δ6 desaturase andelovl5elongase of cobia (Rachycentron canadum).Aquaculture, 290(1—2): 122—131

Zheng X Z, Tocher D R, Dickson C Aet al, 2005.Highly unsaturated fatty acid synthesis in vertebrates: new insights with the cloning and characterization of a Δ6 desaturase of Atlantic salmon.Lipids, 40(1): 13—24

Zheng K K, Zhu X M, Han Det al, 2010.Effects of dietary lipid levels on growth, survival and lipid metabolism during early ontogeny ofPelteobagrus vachellilarvae.Aquaculture,299(1—4): 121—127

MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION OF FATTY ACID DESATURASE AND ELONGASE GENES IN DARKBARBEL CATFISHPELTEOBAGRUS VACHELLII

QIN Chuan-Jie1, WEN Zheng-Yong1, YUAN Deng-Yue1, SHAO Ting1, GONG Quan2
(1.Key Laboratory of Sichuan Province for Fishes Conservation and Utilization in the Upper Reaches of the Yangtze River,Neijiang Normal University,Neijiang641112,China; 2.Fisheries Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu611731,China)

Understanding the endogenous synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids is of benefit to fish feed formulation.A FADS2 and an ELOVL5 cDNA were cloned containing open reading frames (ORF) of 1338 base pair (bp)and 864 bp specifying proteins of 447 and 294 amino acids, respectively.The deduced amino acid sequence ofPelteobagrus vachelliiFADS2 possessed conserved motif and included the histidine boxes, cytochrome b5 domain,transmembrane regions, and ELOVL 5 containing histidine boxes, endoplasmic reticulum retention signal domain, and transmembrane regions.In addition, FADS2 and ELOVL 5 mRNA distributed mainly in the brain and liver, and expressed significantly higher than that of intestine, spleen, kidney, gill, heart and muscle.These results indicate thatP.vachelliipossessed the desaturase and elongase, and the liver was the main tissues for synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids.

fatty acid desaturase; fatty acid elongase;Pelteobagrus vachellii; cDNA

Q789

10.11693/hyhz20170400088

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 31402305號(hào); 四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目, 2017JY0161號(hào); 四川省“十三五”育種攻關(guān)項(xiàng)目,2016NYZ0024號(hào)。覃川杰, 博士, 副教授, E-mail: qinchuanjie@126.com

2017-04-07, 收修改稿日期: 2017-04-25