魏月端 左金華 丁長玲 朱玉紅 王麗芳 宋冰 王晶

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科；2.藥學(xué)部；3.病理科；4.口腔內(nèi)科，濱州?256600

增殖細(xì)胞核抗原和P53在萎縮性腮腺再生中的表達(dá)及意義

魏月端1左金華1丁長玲2朱玉紅3王麗芳1宋冰1王晶4

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科；2.藥學(xué)部；3.病理科；4.口腔內(nèi)科，濱州?256600

目的 從基因和蛋白水平研究增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和P53在萎縮性腮腺再生過程中的表達(dá)及意義。方法 將102只Wistar大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，結(jié)扎實(shí)驗(yàn)組大鼠腮腺主導(dǎo)管，分別于結(jié)扎7?d（A組）、14?d（B組）后實(shí)現(xiàn)腮腺導(dǎo)管再通，并于再通后第0、3、5、7、10、14、21、28天處死大鼠獲取新鮮腮腺組織標(biāo)本。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察腮腺組織形態(tài)學(xué)變化，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western?blot法檢測兩組腮腺組織中PCNA和P53的表達(dá)。結(jié)果 兩實(shí)驗(yàn)組在腮腺導(dǎo)管結(jié)扎第7、14天，腺泡凋亡，導(dǎo)管細(xì)胞增殖，同組P53相對表達(dá)量高于PCNA；隨著再通時(shí)間延長，腺泡細(xì)胞逐漸增多，A組在導(dǎo)管再通后第3天、B組在導(dǎo)管再通后第5天，PCNA和P53相對表達(dá)量達(dá)到峰值，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；其后PCNA和P53相對表達(dá)量逐漸減少，A組于再通后第21天、B組于再通后第28天接近對照組。結(jié)論 腮腺導(dǎo)管結(jié)扎后，P53相對表達(dá)量增多，誘導(dǎo)腮腺腺泡凋亡；導(dǎo)管再通后，PCNA相對表達(dá)量逐漸增多，達(dá)峰值后減少，可促進(jìn)腺泡增殖。

腮腺；??萎縮；??再生；??增殖細(xì)胞核抗原；??P53

唾液腺導(dǎo)管結(jié)石是口腔頜面外科的常見病和多發(fā)病，如果治療不及時(shí)，會(huì)導(dǎo)致患者唾液腺分泌功能受累。唾液腺功能障礙大多是實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡損失以及不同程度的炎癥及纖維化造成的。雖然多數(shù)導(dǎo)管上皮細(xì)胞保持原形態(tài)，但是遲發(fā)性反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步損害周圍環(huán)境。由于唾液對消化、免疫、微環(huán)境具有調(diào)控等特殊功能，唾液缺乏可能會(huì)導(dǎo)致猛性齲、黏膜炎、口腔真菌感染、吞咽困難等，嚴(yán)重影響患者的口腔和全身健康[1]。如何誘導(dǎo)萎縮的腺體再生是治療阻塞性唾液腺疾病的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎大鼠腮腺主導(dǎo)管后實(shí)現(xiàn)再通以誘導(dǎo)萎縮的腮腺組織再生，并從分子機(jī)制出發(fā)，探索增殖細(xì)胞核抗原（proliferating?cell?nuclear?antigen，PCNA）和P53在萎縮性腮腺組織再生過程中的意義，為臨床治療腮腺萎縮提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）擴(kuò)增儀（Eppendorf公司，德國）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96型，Bio-Rad公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）和SYBR?Premix?Ex?Taq（RR420A）購自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗鼠PCNA多克隆抗體（Catalog?No：10205-2-AP）購于美國ProteinTech公司；兔抗鼠P53多克隆抗體（ab131442）購于美國Abcam公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒購于上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 建立動(dòng)物模型

清潔級(jí)Wistar大鼠102只，4周齡，體重（180±20）?g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。102只大鼠分為實(shí)驗(yàn)組（96只）和對照組（N組，6只）。結(jié)扎實(shí)驗(yàn)組大鼠腮腺導(dǎo)管，于結(jié)扎第7天（A組）、第14天（B組）實(shí)現(xiàn)腮腺導(dǎo)管再通，并分別于再通后第0、3、5、7、10、14、21、28天處死大鼠（根據(jù)處死時(shí)間，分別設(shè)為A0、A3、A5、A7、A10、A14、A21、A28及B0、B3、B5、B7、B10、B14、B21、B28組），每組6只，獲取新鮮腮腺組織標(biāo)本。一部分標(biāo)本立即投入液氮中，10?s后保存于-80?℃冰箱，以行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western?blot檢測；另一部分標(biāo)本采用4%多聚甲醛溶液固定，以備行病理切片觀察。N組只解剖分離出腮腺主導(dǎo)管，然后關(guān)閉創(chuàng)口。

1.3 HE染色

4%多聚甲醛溶液固定標(biāo)本后，經(jīng)沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后包埋，制成4 μm厚石蠟切片，按照HE染色說明書步驟進(jìn)行HE染色，最后置于顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

稱取適量組織，按照RNAiso?Plus說明書要求提取腮腺組織總RNA，將提取的RNA沉淀溶解于適量DEPC處理水，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，先去除基因組DNA，反應(yīng)體系如下：DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 1 μg，不含RNA酶dH2O補(bǔ)足至10 μL，42?℃?2?min；然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20 μL體系）：繼續(xù)加入PrimeScript?RT?Enzyme?Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript?Buffer?2液4 μL，不含RNA酶dH2O 4 μL，擴(kuò)增條件：37?℃?15?min，85?℃?5?s。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在避光條件下配制25 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix?Ex?Taq（Tli?RNaseH?Plus）（2×）12.5 μL，PCR正向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，PCR反向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，DNA?模板（lt;100?ng）2 μL，滅菌蒸餾水dH2O 9.5 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性?95?℃?30?s，PCR反應(yīng)95?℃??5?s，60?℃??30?s，重復(fù)39個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔，以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate?dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照，PCNA、P53以及GAPDH的引物序列見表1。

表1 ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列Tab1 Primer sequence for real-time fluorescence quantitative PCR

1.6 蛋白提取及Western?blot

稱取適量組織，加入含有苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl?sulfonylfluoride，PMSF）的RIPA裂解液充分裂解，提取的蛋白質(zhì)采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）測定各組質(zhì)量濃度后，按照每5 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液（6×）的比例混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液。配制10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium?dodecyl?sulfate-polyacrylamide?gel?electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣總蛋白30 μg。電泳條件：恒壓80?V?50?min，跑出濃縮膠后恒壓100?V?55?min，電泳完成后4?℃恒流250?mA?90?min，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene?fluoride，PVDF）膜，洗膜后5%脫脂牛奶在室溫下?lián)u床孵育1.5?h，PCNA、P53抗體稀釋到適量比例與蛋白樣品在4?℃過夜反應(yīng)，洗膜，室溫下結(jié)合二抗1?h，洗膜，避光條件下與超敏ECL化學(xué)發(fā)光夜反應(yīng)，壓片、曝光、拍照。以GAPDH為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS?13.0進(jìn)行處理，兩組之間差異的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

各組的組織學(xué)觀察結(jié)果見圖1。大鼠腮腺導(dǎo)管結(jié)扎第7天，腺體體積較N組減少，顏色較深，腺體之間連接較疏松，腺泡細(xì)胞減少，導(dǎo)管擴(kuò)張，再通后，腺體體積逐漸增大，顏色變淺，腺泡細(xì)胞逐漸增多，擴(kuò)張導(dǎo)管減少，A10、A14組腺體體積基本恢復(fù)，顏色轉(zhuǎn)為淡紅色，腺泡與導(dǎo)管細(xì)胞比例與N組無明顯差異；導(dǎo)管結(jié)扎第14天，腺體體積較N組和A0組明顯減小，腺體較疏松，連接不緊密，質(zhì)地較韌，與周圍組織分界逐漸模糊，腺泡細(xì)胞明顯減少，大量擴(kuò)張的導(dǎo)管占據(jù)大部分視野，隨著再通時(shí)間延長，腺體逐漸紅潤、充盈，光澤亮麗，腺泡細(xì)胞大量增殖，至B21組腺體體積、顏色、質(zhì)地與N組無明顯差異，腺小葉結(jié)構(gòu)完整，比例協(xié)調(diào)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

各組實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定結(jié)果見圖2。PCNA和P53?mRNA在N組大鼠腮腺中相對表達(dá)量較少（Plt;0.01）。導(dǎo)管結(jié)扎第7、14天，同組P53?mRNA相對表達(dá)量高于PCNA?mRNA，兩組P53?mRNA相比，B0gt;A0。隨著再通時(shí)間延長，A、B組相對表達(dá)量逐漸增多，PCNA?mRNA增多速率較P53?mRNA更快。兩者相對表達(dá)量分別于A3和B5組達(dá)到峰值（A3組：PCNA為6.02±0.82，P53為2.98±0.07；B5組：PCNA為11.97±0.29，P53為7.36±0.07；N組：PCNA和P53均為1）；此后隨著時(shí)間延長，PCNA?mRNA、P53?mRNA在兩實(shí)驗(yàn)組相對表達(dá)量逐漸降低，分別于A14、B21組恢復(fù)正常水平，與N組相比無明顯差異（Pgt;0.05）。

圖1 組織學(xué)觀察 HE ×?400Fig1 Histological?results HE ×400

2.3 Western?blot結(jié)果

Western?blot結(jié)果見圖3、4。PCNA和P53蛋白在N組相對表達(dá)量較少（PCNA為0.15±0.02，P53為0.10±0.02）；導(dǎo)管結(jié)扎后第7、14天，同組PCNA蛋白相對表達(dá)量低于P53蛋白，A0組與B0組相比，B0組P53蛋白相對表達(dá)量明顯高于A0組。導(dǎo)管再通后，PCNA蛋白和P53蛋白相對表達(dá)量逐漸增多，兩組分別于A3組、B5組達(dá)到峰值，與N組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），其后兩蛋白相對表達(dá)量逐漸減少至接近N組水平（Pgt;0.05）。導(dǎo)管再通過程中，P53蛋白的相對表達(dá)量整體低于PCNA蛋白，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。

圖2 ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定結(jié)果Fig??2 ?Results?of?real-time?fluorescence?quantitative?PCR

圖3 ?PCNA和P53蛋白測定的Western?blot電泳圖Fig??3 ?Electrophoretograms?of?PCNA?and?P53?with?Western?blot

圖4 ?PCNA和P53蛋白相對表達(dá)量Fig??4 ?Relative?expression?of?PCNA?and?P53

3 討論

PCNA是一種位于細(xì)胞核中可調(diào)控細(xì)胞增殖的基因，在多種唾液腺腫瘤中高表達(dá)。P53[2]參與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種常見的抑癌基因，可以消除機(jī)體受損的細(xì)胞，若受損機(jī)體細(xì)胞中無P53基因表達(dá)，則DNA損傷被復(fù)制，從而導(dǎo)致惡性腫瘤出現(xiàn)，另外，與Bcl-2蛋白上調(diào)有關(guān)的P53功能喪失會(huì)給細(xì)胞帶來增殖并影響腫瘤行為的不利因素。有研究[3]指出，唾液腺導(dǎo)管細(xì)胞P53和P21蛋白共定位可以提供預(yù)留DNA修復(fù)時(shí)間，防止細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎腮腺導(dǎo)管后再通來建立腮腺萎縮后再生的模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎導(dǎo)管7、14?d后，腺泡凋亡，腺體萎縮，導(dǎo)管擴(kuò)張?jiān)鲋?，此點(diǎn)與劉多文等[4]研究結(jié)果相似，證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒ㄔ斐晒?。?dǎo)管再通后，萎縮的腮腺組織可恢復(fù)正常，PCNA、P53表達(dá)量增多和減少與腮腺的萎縮和再生的表現(xiàn)基本一致。在A3至A14、B5至B21階段，同組同時(shí)期PCNA相對表達(dá)量基本多于P53相對表達(dá)量，說明腺體組織基本處于增殖修復(fù)過程中。再通第0天，B組P53相對表達(dá)量多于A組，說明結(jié)扎導(dǎo)管時(shí)間越長，對腮腺組織造成的損傷越大，腮腺萎縮越嚴(yán)重，因此，臨床上腮腺全葉切除術(shù)后通常加壓包扎兩周。兩實(shí)驗(yàn)組PCNA達(dá)到峰值的時(shí)間不同，B組比A組時(shí)間延后，且B組PCNA峰值高于A組，表明腮腺組織受到不同程度的損傷后，損傷嚴(yán)重者誘導(dǎo)腮腺再生需要的PCNA含量相對越多，且恢復(fù)需要的時(shí)間也相應(yīng)延長。導(dǎo)管結(jié)扎7、14?d后，兩組腮腺分別于再通后第14、21天恢復(fù)正常，隨著導(dǎo)管損傷時(shí)間的延長，腮腺腺泡恢復(fù)到正常狀態(tài)所需的時(shí)間也越長。通過PCR與Western?blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在基因和蛋白水平上，PCNA和P53相對表達(dá)量的變化大體一致，但是在腮腺組織恢復(fù)正常后，PCNA仍然高于P53，腺體卻沒有增殖的表現(xiàn)，是因?yàn)槿俚奈s及再生過程并不是單一因素調(diào)控，還有許多其他因子和途徑，比如上皮調(diào)節(jié)蛋白[5]，F(xiàn)AS/FASL途徑[6]等，另外基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程也受多種機(jī)制共同調(diào)節(jié)。

Yi等[7]從唾液腺分泌單位提取到干細(xì)胞，并將其植入經(jīng)放射線損傷的萎縮唾液腺小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)腺體分泌功能恢復(fù)。在頜下腺組織萎縮過程中，Nagai等[5]發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖形成導(dǎo)管狀結(jié)構(gòu)，這些增生的細(xì)胞具有分化形成腺泡細(xì)胞的潛力。這些研究說明導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖在頜下腺再生啟動(dòng)中占重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)管再通早期，導(dǎo)管管腔擴(kuò)張，數(shù)量較多，腺泡細(xì)胞減少，隨著再通時(shí)間延長，導(dǎo)管管腔逐漸縮小，數(shù)量減少，腺泡數(shù)量增多，可能是由于導(dǎo)管阻力解除，大量具有分化潛力的、增殖的導(dǎo)管細(xì)胞分化形成腺泡細(xì)胞導(dǎo)致。由此看來，導(dǎo)管再通后早期階段對腺泡細(xì)胞再生至關(guān)重要。雖然造成唾液腺萎縮的因素不同，但是研究結(jié)果揭示萎縮的腺體有轉(zhuǎn)歸的可能，具體機(jī)制有待探討。臨床治療中，有時(shí)需要做腺體部分切除術(shù)，術(shù)后患者沒有觀察到腺體明顯再生，有可能是由于受損的腺體未經(jīng)過萎縮過程[8]。

綜上所述，腮腺導(dǎo)管結(jié)扎可誘導(dǎo)腺體組織萎縮，導(dǎo)管再通后，具有分化潛力的導(dǎo)管細(xì)胞可分化形成新的腺泡，促進(jìn)腺體再生。這為治療腮腺萎縮性疾病提供了研究基礎(chǔ)，有可能成為再生組織工程的研究熱點(diǎn)。

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Significance of the expression of proliferating cell nuclear antigen and P53 in the regeneration process of an atrophic parotid gland

Wei Yueduan1, Zuo Jinhua1, Ding Changling2, Zhu Yuhong3, Wang Lifang1, Song Bing1, Wang Jing4.
(1. Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China; 2. Dept. of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China; 3. Dept. of Pathology, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China; 4. Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China)
Supported by: Shandong Medicine and Health Science and Technology Development Plan (2011HW004, 2015WS0487).Correspondence: Zuo Jinhua, E-mail: jinhua256603@163.com.

Objective This?research?aims?to?further?explore?the?expression?and?significance?of?proliferating?cell?nuclear?antigen?(PCNA)?and?P53?in?regenerating?rat?atrophy?parotid?gland?from?the?gene?and?protein?levels.?Methods One?hundred?and?two?Wistar?rats?were?randomly?divided?into?experimental?and?control?groups;?the?former?group’s?duct?was?ligated?and?then?released?respectively?in?7?(Group?A)?and?14?days?(Group?B).??Fresh?parotid?specimens?were?obtained?at?0,?3,?5,?7,?10,?14,?21,?and?28?days?after?being?released.?Hematoxylin-eosin?staining?method?was?used?to?observe?the?morphological?changes?of?the?parotid?gland.?The?significance?of?P53?and?PCNA?in?two?groups?was?resolved?by?real-time?fluorescence?quantitative?polymerase?china?reaction?and?Western?blot.?Results Acinar?cells?aoptosis?and?duct?cells?proliferation?occurred?when?the?occlusion?of?the?parotid?duct?was?reversed?on?days?7?and?14.?The?expression?of?P53?was?higher?than?that?of?PCNA,?and?they?reached?the?peak?at?the?third?and?fifth?days?after?groups?A?and?B?regenerated,?respectively.?This?finding?was?significantly?different?compared?with?the?control?(Plt;0.01).??P53?and?PCNA?contents?decreased?gradually;?acinar?and?duct?gradually?returned?to?normal?morphology;?PCNA?and?P53?contents?gradually?close?to?the?normal?control?group.?Conclusion After?ligating?the?parotid?duct,?P53?was?highly?expressed,?and?induced?parotid?gland?atrophy.?Meanwhile,?PCNA?was?highly?expressed,?which?then?decreased?inducing?gland?recovery.

parotid?gland; ?atrophy; ?regeneration;?proliferating?cell?nuclear?antigen; ?P53

R?781.7

A

10.7518/hxkq.2017.06.004

2017-06-15；

2017-09-12

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃（2011HW004，2015WS0-487）

魏月端，碩士，E-mail：1363686792@qq.com

左金華，教授，博士，E-mail：jinhua256603@163.com

（本文編輯 ??吳愛華）