陳璇 劉海霞 彭顯 鄒玲

口腔疾病研究國家重點實驗室??國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，成都?610041

利用框內(nèi)缺失法構(gòu)建變異鏈球菌srtA基因缺失株

陳璇 劉海霞 彭顯 鄒玲

口腔疾病研究國家重點實驗室??國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，成都?610041

目的 ??利用框內(nèi)缺失法，通過IFDC2基因盒及融合聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、同源重組技術(shù)構(gòu)建變異鏈球菌UA159菌株srtA基因缺失株。方法 ??PCR擴增變異鏈球菌UA159菌株srtA基因上下游同源片段及IFDC2基因盒，將這些片段連接、轉(zhuǎn)化入UA159，替換srtA基因同源片段，篩選、鑒定紅霉素抗性克??；PCR擴增、連接UA159?srtA基因上下游同源片段，將連接片段轉(zhuǎn)化入前述紅霉素抗性克隆中替換IFDC2同源片段，篩選、鑒定抗苯丙氨酸類似物p-chloro-phenylalanine（p-Cl-Phe）克隆。結(jié)果 ??PCR、瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序結(jié)果均證明srtA基因編碼區(qū)被完全刪除，上下游片段無縫連接，成功構(gòu)建UA159?srtA基因缺失株。結(jié)論 ??本研究成功構(gòu)建了無標記的變異鏈球菌UA159?srtA基因缺失株，為進一步研究該基因在生物膜中的作用及其調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

變異鏈球菌； srtA基因缺失； 框內(nèi)缺失法

齲病是發(fā)生在牙齒硬組織的慢性感染性疾病[1]。變異鏈球菌是公認的主要致齲菌之一[1-3]，其致齲毒力主要包括：促進細菌在牙齒表面的聚集和黏附、較強的產(chǎn)酸和耐酸能力等[3]。細菌黏附至牙齒表面并形成生物膜是齲病發(fā)生的必要條件[1,3]。變異鏈球菌表面蛋白P1、GpbC及WapA等都與其黏附能力緊密相關(guān)[1,4]，而這些蛋白都是由變異鏈球菌srtA基因編碼的分選酶sortase?A（SrtA）識別并共價錨定到菌細胞壁上發(fā)揮作用的[3,5]。變異鏈球菌srtA基因缺陷可導(dǎo)致其表面蛋白P1等的分布和功能障礙，從而抑制變異鏈球菌在牙面的黏附增殖和生物膜的形成，其致病能力也相應(yīng)減弱[1-2,6-7]。因此，SrtA是影響變異鏈球菌黏附能力的重要毒力因子。

以往研究中使用的srtA基因缺陷株多是采用插入突變和帶標記的等位同源突變兩種方法構(gòu)建的，這兩種技術(shù)中外源DNA片段的引入、明顯的極性效應(yīng)都可能影響研究結(jié)果的可信度[8-10]?？騼?nèi)缺失法是目前常用的構(gòu)建無標記基因缺失株的方法之一[9-10]，利用IFDC2基因盒及等位同源交換技術(shù)可以高效快捷地完成框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建。IFDC2基因盒最初由Xie等[10]設(shè)計，由啟動子ldh、突變的pheS基因片段（mpheS）及ermAM基因片段三部分構(gòu)成。本基因盒中的ermAM基因片段使轉(zhuǎn)化子帶有紅霉素抗性從而實現(xiàn)陽性篩選[10]。pheS基因編碼苯丙氨酸-tRNA合成酶α亞基，在其發(fā)生突變并整合入受體菌基因組后，可使轉(zhuǎn)化子對苯丙氨酸類似物p-chloro-phenylalanine（p-Cl-Phe）產(chǎn)生獲得性敏感[11]，利用此原理可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的陰性篩選從而獲得無標記的基因缺失株。本研究擬利用框內(nèi)缺失法，通過IFDC2基因盒及相關(guān)技術(shù)構(gòu)建無標記的變異鏈球菌srtA基因缺失株，為進一步研究srtA基因的功能性狀及其對變異鏈球菌致齲毒力的影響提供實驗菌株。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件、試劑及儀器

變異鏈球菌UA159菌株、IFDC2基因盒由Dr.?Justin?Merrit（俄克拉荷馬大學健康科學中心口腔生物學專業(yè)，美國）惠贈。菌株的培養(yǎng)條件為37?℃、5%CO2兼性厭氧培養(yǎng)。

細菌基因組DNA提取試劑盒[DP302型，天根生化科技（北京）有限公司]、?瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（2500-01型，Omega公司，美國），KODPlus?DNA高保真聚合酶試劑盒（KOD-201型，Toyobo公司，日本），瓊脂糖（Invitrogen公司，美國），細菌感受態(tài)刺激肽（competence?stimulating?peptide，CSP）（由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供），紅霉素（分裝，Amreso公司，美國），p-Cl-Phe（Sigma公司，美國），腦心浸液肉湯（brain?and?heart?infusion，BHI）培養(yǎng)基（Oxoid公司，英國），瓊脂（北京博奧拓達科技有限公司）。

細菌培養(yǎng)箱（Anaerobox?Ⅳ型，Gene?Science公司，美國），超凈工作臺（1300?Series?A2型，Thermo?Fisher?Scientific公司，美國），聚合酶鏈反應(yīng)?（polymerase?chain?reaction，PCR）儀（S1000?Thermo?cycler型）、瓊脂糖凝膠電泳儀（Sub-Cell?GT?Cell型）（Bio-rad公司，美國），分光光度計（Spectronic?200型，Thermo公司，美國）。

本研究所用引物合成、DNA測序均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 細菌培養(yǎng)及細菌基因組DNA（genome?DNA，gDNA）提取

將-80?℃保存的UA159菌株復(fù)蘇于BHI培養(yǎng)基，形態(tài)學和生化鑒定后將平板保存于4?℃作短期保種，并于平板上挑取單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基中，取過夜培養(yǎng)菌液按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取細菌gDNA，測定純度及濃度后-20?℃保存。

1.3 目的片段PCR擴增及連接

以提取所得細菌gDNA及IFDC2基因盒為模板，利用KOD-Plus?DNA聚合酶試劑盒PCR擴增UA159?srtA基因上游同源片段（記為up，大小約1?kb）、下游同源片段（記為down，大小約1?kb）、IFDC2片段（記為IFDC2，大小約2?kb）；引物根據(jù)srtA基因（GenBank?accession?no?NC_004350.2）與IFDC2序列[10]分別設(shè)計：upF/upR-IFDC2、ldhF/ermR與dnFIFDC2/dnR（引物序列見表?1），其中引物ldhF和ermR為IFDC2片段的上下游引物；為進行后續(xù)融合PCR，引物upR-IFDC2設(shè)計為srtA基因上游同源片段的特異性引物upR+ldhF部分反向互補片段，引物dnFIFDC2設(shè)計為ermR部分反向互補片段+srtA基因下游同源片段的特異性引物dnF。采用?PCR分別擴增，獲得片段up、IFDC2與down。反應(yīng)條件為94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15?s，55?℃退火30?s，68?℃分別延伸1?min、2?min?15?s、1?min，35個循環(huán)，68?℃再延伸4?min。4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，膠回收并測定產(chǎn)物濃度和純度，-20?℃保存。

以up、IFDC2、down三片段為模板，upF和dnR為引物，融合PCR連接上述三片段（記為up-IFDC2-dn，大小約4.1?kb）。反應(yīng)條件為94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15??s，55?℃退火30?s，68?℃延伸4?min?15?s，35個循環(huán)；68?℃再延伸4?min。4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定?PCR?擴增產(chǎn)物，-20?℃保存。

1.4 第一步轉(zhuǎn)化及篩選

從1.2中平板上挑取UA159單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基中，取過夜培養(yǎng)菌液按1∶20稀釋于BHI培養(yǎng)基后培養(yǎng)2~3?h，直到菌液OD600=0.2~0.3。取菌液按如下分組進行加樣，a組：500?μL菌液+5?μL?up-IFDC2-dn+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）[12]；b組：500?μL菌液+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）；c組（陰性對照）：500?μL菌液。加樣混合后培養(yǎng)2?h，取a、b、c三組菌液各200?μL分別于含有12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI瓊脂平板涂板培養(yǎng)48?h。隨機挑取a組平板上部分陽性單克隆接種于含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基中，以過夜培養(yǎng)菌液及UA159菌液（對照）為模板，加入引物checkF/checkR（引物序列見表1），PCR擴增后1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗第一步轉(zhuǎn)化結(jié)果，將陽性克隆-80?℃保種。

表 ?1 ?研究所用引物序列Tab1 Primers used in the study

1.5 第二步轉(zhuǎn)化的目的片段PCR擴增及連接

以UA159細菌gDNA為模板，利用KOD-Plus?DNA聚合酶試劑盒PCR擴增UA159?srtA基因上游同源片段（記為upΔ，大小約1?kb）及下游同源片段（記為down，大小約1?kb）；引物為upF/updnR和dnF/dnR（引物序列見表1），為進行后續(xù)融合PCR，引物updnR設(shè)計為srtA基因上游同源片段的特異性引物upR+dnF部分反向互補片段。采用PCR分別擴增，獲得片段upΔ與down，反應(yīng)條件94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15?s，55?℃退火30?s，68?℃延伸1?min，35個循環(huán)；68?℃再延伸4?min。4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，膠回收并測定產(chǎn)物濃度和純度，-20?℃保存。

以upΔ、down兩片段為模板，upF和dnR為引物，融合PCR連接上述兩片段（記為upΔ-dn，大小約2?kb）。反應(yīng)條件94?℃預(yù)變性2?min；94?℃變性15?s，55?℃退火30?s，68?℃延伸2?min?15?s，35個循環(huán)；68?℃再延伸4?min，4?℃結(jié)束反應(yīng)后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，-20?℃保存。

1.6 第二步轉(zhuǎn)化及篩選

將第一步轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆接種至含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，于含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI瓊脂平板上劃線培養(yǎng)48?h，挑取單克隆接種于含12.5?μg·mL-1紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基，取過夜培養(yǎng)菌液按1∶20稀釋于不含紅霉素的BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3?h，直至菌液OD600=0.2~0.3。取菌液按如下分組進行加樣，a組：500?μL菌液+5 μL upΔ-dn+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）；b組：500?μL菌液+0.5?μL?CSP（1?μg·μL-1）；c組（陰性對照）：500?μL菌液；加樣混合后培養(yǎng)2?h，取a、b、c三組菌液各200?μL分別于含有4?mg·mL-1p-Cl-Phe的BHI瓊脂平板涂板培養(yǎng)48?h。隨機挑取a組平板上10個單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基中，以過夜培養(yǎng)菌液及第一步的陽性克隆菌液（對照）為模板，加入引物checkF/checkR（引物序列見表1），PCR擴增后1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗第二步轉(zhuǎn)化結(jié)果，并將瓊脂糖凝膠電泳觀察到的陽性克隆送DNA測序，將正確測序結(jié)果對應(yīng)的陽性克隆-80?℃保種。

2 結(jié)果

2.1 紅霉素抗性轉(zhuǎn)化子的鑒定

將1.4中a、b、c三組平板培養(yǎng)48?h后，僅a組有菌落生長，b、c組均無菌落長出，表明a組菌落獲得紅霉素抗性。隨機挑取a組部分單克隆培養(yǎng)后用引物checkF/checkR進行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果見圖1：以變異鏈球菌UA159為模板擴增出包含srtA基因的片段長度約為2.6?kb（對照），包含IFDC2的同源片段大小應(yīng)為4.1?kb，結(jié)果均與預(yù)期一致，未見非特異性擴增及拖尾現(xiàn)象，說明挑取的所有陽性克隆中srtA基因均被等位同源交換為IFDC2基因盒。

圖1 第一次轉(zhuǎn)化后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig ?1 The?gel?electrophoresis?results?of?the?first?transformation

2.2 無標記srtA基因缺失株的鑒定

將1.6中a、b、c三組平板培養(yǎng)48?h后，均有菌落長出，a組平板菌落數(shù)與b、c組相比無肉眼可見差異。隨機挑取a組平板10個單克隆培養(yǎng)以后用引物checkF/checkR進行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果見圖2：包含IFDC2基因盒的檢測片段長度應(yīng)為4.1?kb，敲除srtA基因后其上下游無縫連接的片段大小約為2?kb，結(jié)果示挑取的10個克隆中有3個其片段大小與預(yù)期一致；這3個克隆中有2個其DNA測序結(jié)果與已獲得的預(yù)期序列一致，表明其中srtA基因從起始密碼子至終止密碼子被完全刪除，上下游無縫連接（圖3），說明本研究成功構(gòu)建無標記的變異鏈球菌UA159菌株srtA基因缺失株。

圖2 第二次轉(zhuǎn)化后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig2 The?gel?electrophoresis?result?of?the?second?transformation

圖3 srtA基因缺失株上下游連接部分測序結(jié)果波形圖Fig3 The?DNA?sequencing?results?at?the?seam?of?the?constructed ??srtA-deletion?mutant

3 討論

SrtA是最早從金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的一類重要轉(zhuǎn)肽酶，在革蘭陽性菌細胞壁生物合成、生物膜形成及致病能力方面均有重要作用[6,13]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，srtA基因缺失的金黃色葡萄球菌毒力大幅減低，并且不能在組織中形成膿腫，在放線菌、鏈球菌、腸球菌、李斯特菌、芽孢桿菌等其他細菌中也有類似發(fā)現(xiàn)。在變異鏈球菌中，SrtA會識別P1、WapA、GbpC、Dex等表面蛋白C末端分選信號中的LPXTG基序，裂解其中蘇氨酸-甘氨酸之間的肽鍵，并將這些蛋白共價連接到菌細胞壁上[1-2,4-5,13-15]。srtA基因缺失會導(dǎo)致上述變異鏈球菌表面蛋白的分泌、分布及功能異常，影響變異鏈球菌的初始黏附和生物膜形成，進而減低其致齲性[1-2,6]，因此srtA作為變異鏈球菌重要的毒力基因備受關(guān)注。

目前研究變異鏈球菌基因定義突變的技術(shù)中，較成熟的主要有插入突變和帶標記的等位同源突變，但插入突變常產(chǎn)生不完全的蛋白產(chǎn)物、用于等位同源替換靶基因的抗性基因片段本身可能攜帶啟動子等因素都可能影響下游基因的表達及細菌表型[8-10]。無標記的基因缺失株構(gòu)建技術(shù)如框內(nèi)缺失法由于沒有引入外源基因標記，很好地規(guī)避了對下游基因的極性效應(yīng)，能更可靠地反映靶基因?qū)D(zhuǎn)錄代謝的影響[9]。Cre/loxP系統(tǒng)、溫度敏感質(zhì)粒或自殺質(zhì)粒等技術(shù)常用來完成無標記缺失株的構(gòu)建[9-10,12,16]，但Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建的基因缺失株仍會在細菌基因組中遺留一個loxP位點；溫度敏感質(zhì)粒和自殺質(zhì)粒的應(yīng)用則受到質(zhì)粒種類和靶基因結(jié)構(gòu)等多方面的限制，且上述方法都需要提取質(zhì)粒并進行擴增，相對耗時較長，還有學者[10]認為在大腸桿菌中引入異種同源DNA片段可能會產(chǎn)生相關(guān)毒性。本研究通過設(shè)計部分反向互補引物，應(yīng)用融合PCR構(gòu)建同源片段，不需要質(zhì)粒擴增，幾小時內(nèi)就可以獲得目的片段，有效地提高了實驗效率。

pheS基因在大腸桿菌中編碼苯丙氨酸-tRNA合成酶α亞基（PheS），1994年Kast[11]發(fā)現(xiàn)點突變的pheS基因（pheS*）編碼的產(chǎn)物PheS*在識別苯丙氨酸的同時還能?；奖彼犷愃莆铮╬-Cl-Phe），其?；a(chǎn)物會整合入菌細胞蛋白并產(chǎn)生細胞毒性，使pheS*轉(zhuǎn)化子對p-Cl-Phe產(chǎn)生獲得性敏感，這個特性隨后被應(yīng)用于突變株的陰性篩選[8,10-11,17]。Xie等[10]在分析變異鏈球菌PheS蛋白的氨基酸序列后，設(shè)計了變異鏈球菌特異性pheS突變基因——mpheS，并將其與變異鏈球菌強啟動子ldh、紅霉素抗性基因片段ermAM相連，構(gòu)成了IFDC2基因盒，可同時滿足陽性和陰性篩選的需求，為框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建提供了新方法。相較于Xie等[10]在第二步轉(zhuǎn)化中實現(xiàn)了93%~100%的陽性轉(zhuǎn)化率，本研究中成功率僅為20%，推測原因可能為：本研究涉及的srtA基因表達水平不及Xie等實驗中的靶基因nlmA等，在IFDC2基因盒替換srtA基因后，一些調(diào)控srtA表達的基因元件仍存在于染色體上，削弱了基因盒中mpheS的表達水平，使其蛋白產(chǎn)物不足以與受體菌正常產(chǎn)生的PheS競爭，一定程度逃避了p-Cl-Phe的細胞毒性，這也解釋了為何第二步轉(zhuǎn)化后，含有DNA片段組（a組）平板上菌落數(shù)與b、c組無明顯差異。綜上所述，在運用IFDC2技術(shù)構(gòu)建突變株時，若靶基因表達水平較低或不穩(wěn)定，在第二步轉(zhuǎn)化后對平板上的陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證以及DNA測序是必要的，可以避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

本研究使用融合PCR構(gòu)建了包含IFDC2基因盒的srtA基因同源片段，在第一次轉(zhuǎn)化中用IFDC2基因盒替換srtA基因，使轉(zhuǎn)化子具有紅霉素抗性；然后構(gòu)建srtA基因上下游無縫連接的同源片段，在第二次轉(zhuǎn)化中替換含有IFDC2基因盒的同源片段，使轉(zhuǎn)化子能夠在p-Cl-Phe環(huán)境中生長。最后DNA測序證明本研究成功構(gòu)建了無標記的變異鏈球菌srtA基因缺失株，其中srtA基因編碼序列被完全刪除，實現(xiàn)了基因上下游片段的無縫連接，為進一步研究該基因在生物膜中的作用及其調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

[1]? Zhuang?PL,?Yu?LX,?Tao?Y,?et?al.?Effects?of?missense?mutations?in?sortase?A?gene?on?enzyme?activity?in?Streptococcus mutans[J].?BMC?Oral?Health,?2016,?16:47.

[2]? Liao?S,?Klein?MI,?Heim?KP,?et?al.?Streptococcus mutans?extracellular?DNA?is?upregulated?during?growth?in?biofilms,?actively?released?via?membrane?vesicles,?and?influenced?by?components?of?the?protein?secretion?machinery[J].?J?Bacteriol,?2014,?196(13):2355-2366.

[3]? Lévesque?CM,?Voronejskaia?E,?Huang?YC,?et?al.?Involvement?of?sortase?anchoring?of?cell?wall?proteins?in?biofilm?formation?by?Streptococcus mutans[J].?Infect?Immun,?2005,?73(6):3773-3777.

[4]? Li?MY,?Huang?RJ,?Zhou?XD,?et?al.?Role?of?sortase?in?Streptococcus mutans?under?the?effect?of?nicotine[J].?Int?J?Oral?Sci,?2013,?5(4):206-211.

[5]? Lapirattanakul?J,?Nomura?R,?Matsumoto-Nakano?M,?et?al.?Variation?of?expression?defects?in?cell?surface?190-kDa?protein?antigen?of?Streptococcus mutans[J].?Int?J?Med?Microbiol,?2015,?305(3):383-391.

[6]? Schneewind?O,?Missiakas?D.?Sec-secretion?and?sortasemediated?anchoring?of?proteins?in?Gram-positive?bacteria[J].?Biochim?Biophys?Acta,?2014,?1843(8):1687-1697.

[7]? Lee?SF,?Boran?TL.?Roles?of?sortase?in?surface?expression?of?the?major?protein?adhesin?P1,?saliva-induced?aggregation?and?adherence,?and?cariogenicity?of?Streptococcus mutans[J].?Infect?Immun,?2003,?71(2):676-681.

[8]? Kristich?CJ,?Chandler?JR,?Dunny?GM.?Development?of?a?host-genotype-independent?counterselectable?marker?and?a?high-frequency?conjugative?delivery?system?and?their?use?in?genetic?analysis?of?Enterococcus faecalis[J].?Plasmid,?2007,?57(2):131-144.

[9]? Merritt?J,?Tsang?P,?Zheng?L,?et?al.?Construction?of?a?counterselection-based?in-frame?deletion?system?for?genetic?studies?of?Streptococcus mutans[J].?Oral?Microbiol?Immunol,?2007,?22(2):95-102.

[10]?Xie?Z,?Okinaga?T,?Qi?F,?et?al.?Cloning-independent?and?counterselectable?markerless?mutagenesis?system?in?Streptococcus mutans[J].?Appl?Environ?Microbiol,?2011,?77(22):8025-8033.

[11]?Kast?P.?pKSS—A?second-generation?general?purpose?cloning?vector?for?efficient?positive?selection?of?recombinant?clones[J].?Gene,?1994,?138(1):109-114.

[12]?Petersen?FC,?Scheie?AA.?Natural?transformation?of?oral?streptococci[J].?Methods?Mol?Biol,?2010,?666:167-180.

[13]?Gianella?P,?Snapp?EL,?Levy?M.?An?in vitro?compartmentalization-based?method?for?the?selection?of?bond-forming?enzymes?from?large?libraries[J].?Biotechnol?Bioeng,?2016,?113(8):1647-1657.

[14]?Marraffini?LA,?Dedent?AC,?Schneewind?O.?Sortases?and?the?art?of?anchoring?proteins?to?the?envelopes?of?gram-positive?bacteria[J].?Microbiol?Mol?Biol?Rev,?2006,?70(1):192-221.[15]?Abraham?WR.?Going?beyond?the?control?of?quorum-sensing?to?combat?biofilm?infections[J].?Antibiotics,?2016,?5(1):3.

[16]?Shimshek?DR,?Kim?J,?Hübner?MR,?et?al.?Codon-improved?Cre?recombinase?(iCre)?expression?in?the?mouse[J].?Genesis,?2002,?32(1):19-26.

[17]?Zhou?C,?Shi?L,?Ye?B,?et?al.?pheS*,?an?effective?host-genotypeindependent?counter-selectable?marker?for?marker-free?chromosome?deletion?in?Bacillus amyloliquefaciens[J].?Appl?Microbiol?Biotechnol,?2017,?101(1):217-227.

Construction of srtA-deletion mutant of Streptococcus mutans by an in-frame deletion system

Chen Xuan, Liu Haixia, Peng Xian, Zou Ling.
(State Key Laboratory of Oral Diseases amp; Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, National Clinical Research Center for Oral Diseases amp; West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81570974); The Key Project of the Science and Technology Department of Sichuan Province (2015JY0260). Correspondence: Zou Ling, E-mail: zouling@scu.edu.cn.

Objective ??To?construct?srtA-gene?deletion?mutant?of?Streptococcus mutans?(S. mutans)?UA159?with?IFDC2?cassette?through?overlapping?polymerase?chain?reaction?(PCR)?and?allelic?homologous?recombination. Methods ??First,?the?upstream?and?downstream?fragments?surrounding?the?srtA?and?IFDC2?cassette?were?PCR?amplified?and?ligated?through?overlapping?PCR.?The?resulting?amplicon?was?transformed?into?UA159,?and?positive?transformants?were?selected?on?BHI?plates?containing?erythromycin.?Second,?upstream?and?downstream?fragments?of?srtA?with?overlap?regions?were?generated?by?PCR?and were overlapped to create upΔ–down amplicon. Then, the upΔ–down amplicon was transformed into the aforementioned positive?transformants?and?selected?on?BHI?plates?containing?p-Cl-Phe.?Results ??The?PCR?analysis?and?DNA?sequencing?results?indicated?that?the?coding?region?of?the?srtA?was?completely?deleted,?and?the?upstream?and?downstream?regions?flanking?the?srtA?were?ligated?seamlessly.?Conclusion ??The?markerless?srtA-deletion?mutant?of?S. mutans?was?constructed?successfully,?which?laid?a?foundation?for?further?study?of?its?biological?function?and?influence?on?the?biofilm?formation?of?S. mutans.

Streptococcus mutans;??srtA-deletion?mutant;??in-frame?deletion?system

Q?781

A

10.7518/hxkq.2017.06.005

2017-03-28；

2017-05-10

國家自然科學基金（81570974）；四川省科技計劃項目基金（2015JY0260）

陳璇，碩士，E-mail：252132611@qq.com

鄒玲，副教授，博士，E-mail：zouling@scu.edu.cn

（本文編輯 ??李彩）