魏 鳳，李 峰，張文通，苗立中，沈志強(qiáng)，

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

一例豬圓環(huán)病毒3型病料的PCR檢測(cè)

魏 鳳1，李 峰1，張文通2，苗立中1，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

為弄清引起山東省沾化縣某養(yǎng)豬場(chǎng)病豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原，采用PCR檢測(cè)及序列測(cè)序分析，確診病原含有豬圓環(huán)病毒3型。這個(gè)病例的確診，顯示該區(qū)域有豬圓環(huán)病毒3型的流行，為當(dāng)?shù)胤酪卟块T(mén)開(kāi)展針對(duì)該病防控提供理論依據(jù)。

豬圓環(huán)病毒3型；PCR；檢測(cè)

2015年6月，研究人員從美國(guó)北卡羅萊納州某養(yǎng)豬場(chǎng)利用宏基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種新型豬圓環(huán)病毒，即豬圓環(huán)病毒3型（porcine circovirus type 3,PCV3）[1]。2016年至今，我國(guó)多個(gè)研究機(jī)構(gòu)如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家生豬育種工程中心、山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所等都報(bào)道了豬圓環(huán)病毒3型在我國(guó)流行的情況[2]。

PCV3基因組有2 000個(gè)堿基組成，主要編碼Cap和Rep兩個(gè)基因。PCV3 Cap基因編碼214個(gè)氨基酸殘基，Rep基因編碼297個(gè)氨基酸殘基[3]。PCV3 Cap基因編碼的氨基酸殘基較PCV2少19~20個(gè)。PCV3毒株主要分為3a和3b兩群，其中3a和美國(guó)報(bào)道PCV3毒株處于同一進(jìn)化分支[4]。

目前研究表明，PCV3在我國(guó)豬場(chǎng)抗原陽(yáng)性率高達(dá)12.7%，而血清陽(yáng)性率高達(dá)48.02%[4]。PCV3對(duì)豬致病性及PCV2疫苗能否阻止PCV3的侵襲已成為從事生豬疫病研究人員迫切需要研究的課題。筆者于2017年9月10日，利用PCR及測(cè)序，確診了從山東省沾化縣某豬場(chǎng)送檢濱州畜牧獸醫(yī)研究院門(mén)診的病死豬組織中含有PCV3。

1 材料與方法

1.1 病料

山東省沾化縣某豬場(chǎng)病死豬（約60日齡）肺臟及腹股溝淋巴結(jié)。

1.2 主要試劑

病毒DNA基因組提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；TaKaRa Ex Taq、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mixture、pMD18-T、BamHI、HindШ 載 體 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；DH5a菌種由濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[5]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成PCV3檢測(cè)引物，PCR擴(kuò)增核苷酸預(yù)期為338 bp。引物序列為：P1：5′-CCACAGAAGGCGCTAT GTC-3′，P2：5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′。

1.4 PCV3的PCR鑒定

將無(wú)菌采集的病料組織，按照1∶3比例添加滅菌的0.85%氯化鈉水溶液，用勻漿器進(jìn)行研磨；懸液反復(fù)凍融3次；然后以12 000 r/min離心處理；離心的上清液用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌并保存?zhèn)溆谩＿^(guò)濾后的菌液一部分用作提取DNA基因組的模板。

取部分濾液用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以該基因組為模板，用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增 25 μL 體系，具體為：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture（20 mmol/L）1 μL、P1 和 P2（引物濃度均 20 μmol/L） 各 0.5 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、模板DNA 5 μL，添加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 PCV3的PCR產(chǎn)物克隆及序列分析

將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將回收到的PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體上，經(jīng)BamHⅠ和HindШ雙酶切鑒定正確后，送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank上報(bào)道的PCV2基因核苷酸序列同源性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV3的PCR鑒定結(jié)果

疑似PCV3感染病料的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增到了與預(yù)期大小338 bp相符的片段，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)PCR鑒定結(jié)果初步判定該豬場(chǎng)的病料為PCV3陽(yáng)性。

圖1 PCV3的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCV3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

將鑒定正確克隆質(zhì)粒送去上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示：PCV3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物338 bp，序列如下：CGACGATTCCACAGAAGGCGCTATGTCAGA AGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGC ACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAAC GTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGC CCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAA CGAATGGGAAACTGCGATTAGCTTTGAATATTAT AAGATACTAAAGATGAAAGTTACACTCAGCCCT GTAATTTCTCCGGCTCAGCAAACAAAAACTATGT TCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCT GGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTA TGCGGA；將測(cè)序結(jié)果在 NCBI里進(jìn)行 Blast，該核苷酸序列與搜索到的其他PCV同源性在97%~99%。

3 討論

利用PCR及測(cè)序確診感染PCV3的養(yǎng)豬場(chǎng)來(lái)自山東省沾化縣。該養(yǎng)豬場(chǎng)規(guī)模50多頭母豬，發(fā)病豬零星死亡，多保育階段仔豬死亡。剖檢病變主要為腹股溝淋巴結(jié)腫大，切面嚴(yán)重出血；肺臟間質(zhì)性肺炎；腎臟有壞死點(diǎn)。使用多種抗生素治療無(wú)效。該豬場(chǎng)未進(jìn)行PCV2苗的免疫。

下一步工作：一是需要弄清該豬場(chǎng)PCV3的來(lái)源；二是跟蹤調(diào)查附近區(qū)域豬場(chǎng)PCV3流行情況；三是開(kāi)展PCV3分離及全基因組測(cè)序研究。開(kāi)展下一步工作的同時(shí)，需向有關(guān)部門(mén)通報(bào)PCV3的研究結(jié)果，以引起豬場(chǎng)及行業(yè)主管的重視。

[1] 翁善鋼.一種新的豬圓環(huán)病毒—豬圓環(huán)病毒3型[J].養(yǎng)豬，2017（4）：64.

[2] 賀會(huì)利，李軍，潘艷，等.廣西首例豬圓環(huán)病毒3型的發(fā)現(xiàn)及其衣殼蛋白序列分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017（8）：1499-1503.

[3] 湛洋，王東亮，王乃東，等.豬圓環(huán)病毒3型檢測(cè)及其Cap結(jié)構(gòu)序列和抗原性預(yù)測(cè)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，48（6）：1076-1084.

[4] 咸文，梁海英，曾智勇，摘譯.豬圓環(huán)病毒3型的鑒定與遺傳特征分析[J].豬業(yè)科學(xué)，2017，34（7）：32-33.

[5] Palinski R,Pi?eyro P,Shang P,et al.A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J/OL].J Virol,2016,doi:10.1128/JVI.01879-16.

PCR Detection for One Case of Porcine Circovirus Type 3

WEI Feng1,LI Feng1,ZHANG Wentong2,MIAO Lizhong1,SHEN Zhiqiang1,2
(1.Shandong Binzhou Animal Science＆Veterinary Medicine Academe,Binzhou 256600,China;2.Shandong LvDu Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)

To find out pathogen of multisystem failure case from a scale pig farm in Zhanhua county,Shandong Province,the pathogen was diagnosed with porcine circovirus type 3 by polymerase chain reaction diagnosis and sequence sequencing analysis.The diagnosis of this case shows that the area has the prevalence of porcine circovirus 3 and provides a theoretical basis for the prevention and control of the disease in the local epidemic prevention department.

porcine circovirus type 3;polymerase chain reaction;detection

S858.282.65+9.2

A

1002-1957(2017)06-0099-02

2017-10-10

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）

魏 鳳（1979-），女，河南遂平人，助理研究員，碩士，主要從事獸用生物制品研究.E-mail:hzndzwt1@163.com

（編輯：富春妮）