陳卓，黃丹，于華，唐姣，羅雪，毛祥，唐平

(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

功能菌對(duì)泡菜風(fēng)味物質(zhì)形成的影響

陳卓，黃丹*，于華，唐姣，羅雪，毛祥，唐平

(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

以分離于自然發(fā)酵泡菜中的植物乳桿菌和酵母菌作為功能菌強(qiáng)化發(fā)酵制作泡菜；并研究功能菌對(duì)泡菜風(fēng)味物質(zhì)形成的影響。采用高效液相色譜法、頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)發(fā)酵泡菜中有機(jī)酸和揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析檢測(cè)，研究酵母菌不同接種量對(duì)泡菜風(fēng)味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：酵母菌接種量為0.5%時(shí)，泡菜中風(fēng)味物質(zhì)較多；自然發(fā)酵泡菜風(fēng)味與人工接種功能菌發(fā)酵泡菜風(fēng)味差異較大，不同發(fā)酵時(shí)間和接種量的泡菜風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量也有所差異，發(fā)酵過(guò)程中共檢出6種有機(jī)酸和41種揮發(fā)性成分，其中有機(jī)酸中草酸、乳酸含量較高，揮發(fā)性成分中酯類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)以及二甲基硫化物相對(duì)含量較高，是白蘿卜泡菜的特征風(fēng)味成分。

泡菜；功能菌；有機(jī)酸；揮發(fā)性成分

泡菜是我國(guó)一種傳統(tǒng)而大眾化的發(fā)酵食品，具有典型代表性，歷史悠久，工藝傳承千年，為中華傳統(tǒng)生物食品之瑰寶。其發(fā)酵原理是在自然條件下微生物利用原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，形成泡菜特殊的色澤和風(fēng)味[1]。其具有鮮酸可口、質(zhì)地脆嫩、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，經(jīng)常食用可達(dá)到防病治病、保健和延年益壽的功效，因此深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。目前我國(guó)泡菜的生產(chǎn)主要采用自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵2種方式[2]。自然發(fā)酵雖然口味醇厚，但其生產(chǎn)周期較長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、食用期較短，且易受腐敗菌污染等問(wèn)題，不能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求[3]，所以選擇合適的發(fā)酵劑進(jìn)行人工接種，使泡菜產(chǎn)品風(fēng)味與自然發(fā)酵泡菜的產(chǎn)品風(fēng)味相近，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)前景。

泡菜的風(fēng)味物質(zhì)除原料本身外，最主要來(lái)自微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。國(guó)內(nèi)外對(duì)泡菜風(fēng)味做了多方面的研究，Soon-Mi Shim等[4]研究了韓國(guó)泡菜低溫儲(chǔ)藏過(guò)程中有機(jī)酸的變化，發(fā)現(xiàn)乳酸和乙酸是主要的有機(jī)酸，蘋(píng)果酸在最初的儲(chǔ)藏階段迅速減少。劉春燕等[5]研究了不同乳酸菌接種對(duì)發(fā)酵泡菜風(fēng)味的影響，發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌發(fā)酵的泡菜揮發(fā)性成分及有機(jī)酸的種類(lèi)差異不顯著。徐丹萍等[6]對(duì)泡菜自然發(fā)酵過(guò)程中品質(zhì)及揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，結(jié)果得到硫氰酸甲酯、(E)-丁酸-4-己烯酯、乙酸己酯、葉醇、正己醇、β-蒎烯、二甲基二硫和二甲基三硫?qū)ε莶孙L(fēng)味形成影響較大。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法、頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)泡菜中的風(fēng)味成分進(jìn)行定性定量分析研究，比較自然發(fā)酵和人工接種功能菌發(fā)酵的泡菜的風(fēng)味成分，確定泡菜中的主體風(fēng)味成分，既可為功能菌發(fā)酵泡菜取代自然發(fā)酵泡菜提供理論依據(jù)，又可為提高泡菜產(chǎn)品質(zhì)量打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為泡菜工業(yè)化生產(chǎn)起指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

新鮮白蘿卜：自貢市沃爾瑪超市購(gòu)買(mǎi)；植物乳桿菌(L.plantarum)、維克漢姆酵母(Wickham yeast)：四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，分離于自然發(fā)酵泡菜中。

氫氧化鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸等：以上藥品均為分析純；琥珀酸、草酸、蘋(píng)果酸、乙酸：以上藥品均為色譜純。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌的活化、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)；YPD培養(yǎng)基用于酵母菌的活化、培養(yǎng)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

土陶壇；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化儀器有限公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；BH200生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器有限公司；0.45 μm水系微孔濾膜 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；高效液相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó) Agilent公司；固相微萃取裝置：包括手柄、導(dǎo)向桿、85 μm CAR-PDMS萃取纖維頭 美國(guó)Supelco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子發(fā)酵劑

分別將實(shí)驗(yàn)室保藏的植物乳桿菌和維克漢姆酵母在相應(yīng)的MRS平板培養(yǎng)基、YPD平板培養(yǎng)基上活化，再取1環(huán)活化的菌種，接種于相應(yīng)的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，用生理鹽水洗下，計(jì)數(shù)，以此作為接種白蘿卜的種子發(fā)酵劑。

1.2.2 泡菜制備

1.2.2.1 自然發(fā)酵泡菜

新鮮蘿卜→清洗→切片→分裝→注水→8%食鹽→厭氧發(fā)酵6天。設(shè)為空白組。

1.2.2.2 功能菌強(qiáng)化發(fā)酵泡菜

新鮮蘿卜→清洗→切片→分裝→注水→8%食鹽→接功能菌(乳酸菌：0.375%接種量；酵母菌：不同水平0，0.25%，0.5%，0.75%接種量)→厭氧發(fā)酵6天。設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。乳酸菌以0.375%的接種量是根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)泡菜液中的總酸和降解亞硝酸鹽的能力確定的。

1.2.3 有機(jī)酸的分析

1.2.3.1 樣品前處理

取10 mL泡菜液于100 mL容量瓶中，加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液(10.6%)和2 mL硫酸鋅溶液(30%)，搖勻后，用超純水定容，靜置30 min后，先用雙層濾紙過(guò)濾，再用0.45 μL微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液用于高效液相色譜分析[7,8]。

1.2.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Gemini 5u C18110A柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，以5%色譜甲醇-95% 0.5%(NH4)2HPO4(用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.7)為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，柱溫35 ℃，柱壓75 bar，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3.3 分析步驟

a.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱量各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品1 g(或1 mL)以超純水溶解并定容至100 mL，即為10.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯藏液。

分別將貯藏液用超純水以5，10，15，20倍稀釋?zhuān)M(jìn)樣檢測(cè)，分別測(cè)定不同標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間及其不同濃度所對(duì)應(yīng)的峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

b.樣品測(cè)定

各待測(cè)樣品處理后上機(jī)檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照定量計(jì)算。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

1.2.4.1 固相微萃取萃取條件

將85 μm萃取頭于250 ℃下老化30 min，直至無(wú)干擾峰出現(xiàn)。取2 g泡菜碾碎，添加4 mL泡菜汁加入頂空進(jìn)樣瓶中，并加入2 g NaCl和攪拌子，50 ℃平衡15 min，將萃取頭插入瓶中，推出纖維頭，使之與液面保持1 cm的距離，保溫萃取30 min，攪拌速度為200 r/min，隨后抽回纖維頭，拔出，再插入氣相色譜進(jìn)樣口230 ℃解吸3 min。

1.2.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件[9]

色譜條件：進(jìn)樣口溫度230 ℃；柱流速為恒定流量1 mL/min；不分流進(jìn)樣模式：程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升到100 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升到230 ℃，保持7 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；數(shù)據(jù)采集模式為全掃描；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍33～450 amu。

定性方法：將得到的每個(gè)樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST Library對(duì)照相匹配，對(duì)匹配度大于80(最大為100)的鑒定結(jié)果予以確認(rèn)。

定量方法：利用圖譜庫(kù)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，求得各樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜的風(fēng)味成分

食品的風(fēng)味是食品中許多不同種類(lèi)、不同數(shù)量的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)人體感官的綜合效果[10]。影響泡菜風(fēng)味的成分包括揮發(fā)性成分和不揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分影響泡菜的香味，即人的嗅覺(jué)評(píng)價(jià)，不揮發(fā)性成分影響泡菜的口味，即人的味覺(jué)評(píng)價(jià)。

2.2 泡菜中有機(jī)酸的分析

2.2.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.3方法配制7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)，得到對(duì)應(yīng)的圖譜，見(jiàn)圖1。通過(guò)結(jié)合文獻(xiàn)和單標(biāo)結(jié)果綜合分析，得出峰1為草酸，峰2為酒石酸，峰3為蘋(píng)果酸，峰4為乳酸，峰5為冰乙酸，峰6為檸檬酸，峰7為琥珀酸。以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of organic acid standard sample

有機(jī)酸保留時(shí)間(min)回歸方程相關(guān)系數(shù)草酸5.786y=0.0217x-11.0030.9998酒石酸6.312y=0.0686x-5.09780.9997蘋(píng)果酸7.343y=0.1461x-4.80920.9997乳酸8.579y=0.2157x+0.75190.9999冰乙酸9.082y=0.1626x+48.7430.9929檸檬酸10.070y=0.106x+1.95370.9991琥珀酸11.710y=0.2579x-8.54290.9995

注：y為峰面積，x為各有機(jī)酸濃度(mg/dL)。

2.2.2 泡菜中有機(jī)酸含量分析

在相同測(cè)定條件下，通過(guò)高效液相色譜法對(duì)各發(fā)酵泡菜中的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相比較，確定其對(duì)應(yīng)的各種有機(jī)酸，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算有機(jī)酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵泡菜中有機(jī)酸的含量Table 2 Content of organic acids in fermented pickles

注：“-”表示未檢測(cè)出此物質(zhì)。

泡菜的不揮發(fā)性成分主要包括有機(jī)酸和氨基酸等。其品質(zhì)主要取決于各種有機(jī)酸、氨基酸和各種微量元素的含量，其中有機(jī)酸是影響泡菜風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)的主要物質(zhì)，在發(fā)酵泡菜中酒石酸未檢測(cè)出，其原因可能是含量過(guò)低，或者是被其他物質(zhì)干擾所致，檸檬酸、蘋(píng)果酸含量比自然發(fā)酵泡菜中相對(duì)較低，其中檸檬酸具有爽快的酸味，蘋(píng)果酸具有溫和爽快的酸味，略帶苦味，而稍有澀感，酸爽尖利的乳酸則含量較高，導(dǎo)致了發(fā)酵泡菜的酸味尖利，柔和感不高，琥珀酸是一種具有鮮味的有機(jī)酸，其鈉鹽具有獨(dú)特的鮮爽味，在泡菜中食鹽的鈉離子作用下呈現(xiàn)鮮味，人工接種發(fā)酵與自然發(fā)酵中其含量差異不大，可以推測(cè)出在鮮味上較為相似。草酸為泡菜中含量最高的有機(jī)酸，自然發(fā)酵與人工接種發(fā)酵泡菜中的含量差異不大。

2.3 泡菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量分析

將發(fā)酵泡菜處理后通過(guò)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)GC/MS檢測(cè)到的結(jié)果進(jìn)行分析，得到不同泡菜樣品中主要揮發(fā)性成分及相對(duì)含量。從5種泡菜樣品中共測(cè)定出41種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中酸類(lèi)物質(zhì)3種、酯類(lèi)物質(zhì)6種、醇類(lèi)物質(zhì)10種、二甲基硫化物2種、醚類(lèi)物質(zhì)3種、噻吩類(lèi)物質(zhì)1種、醛類(lèi)物質(zhì)1種、呋喃類(lèi)物質(zhì)1種、酚類(lèi)物質(zhì)6種、酮類(lèi)物質(zhì)1種、烴類(lèi)物質(zhì)3種、其他物質(zhì)4種，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 白蘿卜泡菜揮發(fā)性風(fēng)味成分含量Table 3 Content of volatile flavor components in white radish pickles

續(xù) 表

注：“-”表示未檢測(cè)出此物質(zhì)。

泡菜的香氣成分對(duì)品質(zhì)的評(píng)價(jià)起著重要的作用。泡菜中的香氣成分主要來(lái)源于原料與發(fā)酵過(guò)程，由于發(fā)酵工藝不同其產(chǎn)品香氣成分及感官鑒定結(jié)果截然不同。在上述泡菜樣品中，酵母菌接種量為0.5%時(shí)，風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)最多，含量也相對(duì)較高，檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要有酯類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)、醚類(lèi)、烴類(lèi)等，其中檢測(cè)到的硫化物主要是二甲基二硫、二甲基三硫，且含量相對(duì)較高，其閾值很低，低含量就能產(chǎn)生很濃的香味，是泡菜具有獨(dú)特風(fēng)味的主要原因。醇類(lèi)是常見(jiàn)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，泡菜中的醇類(lèi)可能跟微生物發(fā)酵相關(guān)。白蘿卜泡菜中醇類(lèi)占揮發(fā)性成分的比例最高，其中主要以乙醇為主體，人工接種功能菌中，乙醇相對(duì)含量低于自然發(fā)酵中的乙醇相對(duì)含量。酯類(lèi)是具有香氣的揮發(fā)性液體，是構(gòu)成泡菜特殊風(fēng)味的重要組成部分，在上述泡菜樣品中，酯類(lèi)在揮發(fā)性成分中所占的比例僅次于醇類(lèi)，以1-異硫代氰酸丁酯、乙酸乙酯為主，人工接種發(fā)酵泡菜中酯類(lèi)種類(lèi)及含量明顯高于自然發(fā)酵泡菜，其原因可能是接種后乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所致。酚類(lèi)也是該泡菜樣品的主要成分，影響著泡菜的風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)。2-甲基四氫噻吩、2,3-二氫苯并呋喃均未在自然發(fā)酵泡菜中檢測(cè)出，但在人工接種發(fā)酵泡菜中檢測(cè)出，且相對(duì)含量較高。

總體而言，人工接種發(fā)酵泡菜比自然發(fā)酵泡菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)更多，相對(duì)含量更高，其風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)源于原料本身和微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)論

本研究是以高降解亞硝酸鹽乳酸菌和高產(chǎn)酯類(lèi)酵母菌為人工接種發(fā)酵泡菜的發(fā)酵劑，在泡菜制作過(guò)程中添加不同的接種量制作泡菜，采用高效液相色譜法、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)泡菜中的有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果顯示酵母菌接種量為0.5%時(shí)，風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)及含量相對(duì)較多，有6種有機(jī)酸和41種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)被檢測(cè)出來(lái)，其中有機(jī)酸中草酸、乳酸含量較高，揮發(fā)性成分中乙酸乙酯、1-異硫代氰酸丁酯、乙醇、二甲基二硫、二甲基三硫相對(duì)含量較高，是構(gòu)成泡菜風(fēng)味的主要組成部分，與自然發(fā)酵泡菜相比，人工接種發(fā)酵泡菜中風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)更多，相對(duì)含量更高，無(wú)論是從感官評(píng)定還是含量分析中均能得出人工接種發(fā)酵泡菜優(yōu)于自然發(fā)酵泡菜，此研究為接種功能菌對(duì)泡菜風(fēng)味的影響奠定了基礎(chǔ)，對(duì)在工業(yè)上提升泡菜發(fā)酵工藝具有重要的意義。

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EffectofFunctionalBacteriaontheFormationofFlavorSubstancesinPickles

CHEN Zhuo, HUANG Dan*, YU Hua, TANG Jiao, LUO Xue, MAO Xiang, TANG Ping

(College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000, China)

UseLactobacillusplantarumand yeast isolated from natural fermented pickles as functional bacteria to strengthen the production of pickles' fermentation, and the effect of functional bacteria on the formation of flavor substances in pickles is studied.The organic acids and volatiles in fermented pickles are detected and analyzed by high performance liquid chromatography with headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry.The effects of different inoculation amount of yeast on the flavor compounds of pickled are also studied.The results show that when the inoculation amount of yeast is 0.5%, the flavor substances of the pickles are more, the natural fermented pickles are very different from artificial inoculated functional bacteria fermented pickles in flavor. The types and levels of pickles' flavor substances in different fermentation time and inoculation amount are also different. And 6 kinds of organic acids and 41 kinds of volatile components are detected in the fermentation process, the content of oxalic acid and lactic acid in organic acid is high, the relative content of esters, alcohols, phenols and dimethylsulfides in volatile components is higher. They are the characteristic flavor ingredients of the white radish pickles.

pickles；functional bacteria；organic acid；volatile components

TS255.54

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.014

1000-9973(2017)12-0066-05

2017-06-15 *通訊作者

四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(2015GTY010)；四川省富順縣科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(201512)

陳卓(1991-)，男，山東濟(jì)寧人，碩士，主要從事固態(tài)釀造功能微生物方面的研究；

黃丹(1968-)，女，教授，主要從事微生物及應(yīng)用方面的研究。