但茜，毛佳怡，曾海英

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽 550025)

豆瓣辣醬高酶活霉菌篩選及豆醅促熟性研究

但茜，毛佳怡，曾海英*

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽 550025)

以豆瓣辣醬微生物區(qū)系中已分離鑒定的5株優(yōu)勢霉菌M2～M6為試驗(yàn)菌株，通過篩選高產(chǎn)蛋白酶和肽酶菌株，并將之應(yīng)用于發(fā)酵豆醅，對比傳統(tǒng)發(fā)酵以探索其在縮短周期、促進(jìn)風(fēng)味及提高品質(zhì)等方面的應(yīng)用可行性。研究表明：M3產(chǎn)蛋白酶活力達(dá)到139.49 U/mL；M6肽酶活力達(dá)1.039 mg/dL。采用高酶活菌株進(jìn)行人工接種菌群強(qiáng)化發(fā)酵蠶豆，促熟效果顯著，發(fā)酵時(shí)間縮短至20天(傳統(tǒng)周期為60～90天)，M3組呈味氨基酸含量達(dá)56.63%，M6組為48.03%，而傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)CK組僅為45.23%，差異顯著(P<0.05)。

豆瓣辣醬；高蛋白酶；高肽酶；促熟；風(fēng)味

1 概述

近年來，由于人們保健意識(shí)逐漸提升，發(fā)酵食品因其高營養(yǎng)價(jià)值和生理功能，尤其是具有濃郁醬香和醇厚鮮美口感的豆瓣醬受到越來越多消費(fèi)者的喜愛[1]。然而傳統(tǒng)豆瓣辣醬成熟周期長、品質(zhì)不穩(wěn)定，已逐漸成為制約豆瓣辣醬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，故生產(chǎn)過程中的促熟、增香、提高營養(yǎng)價(jià)值日益成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展擬待解決的問題。微生物能使豆瓣辣醬發(fā)酵時(shí)間縮短、提高豆瓣辣醬營養(yǎng)價(jià)值等作用使其越發(fā)受人追捧[2-4]，因此，通過篩選高酶活菌株并且研究其特性，再應(yīng)用篩選后的高酶活菌株到產(chǎn)品中從而使豆瓣辣醬達(dá)到促熟、增香、提高品質(zhì)等目的是本研究的意義所在。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料與儀器

2.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌種：試驗(yàn)選用的5株霉菌均系貴州大學(xué)食品免疫與毒理評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室從豆瓣辣醬制品中分離而來的具有益酵益生作用的優(yōu)勢菌種，編號(hào)分別是M2平革菌科(Porostereumcrassum)，M3雜色曲霉(Aspergillusversicolor)，M4蠟葉枝孢霉(Cladosporiumsphaerospermum)，M5桔青霉(Penicilliumcitrinum)，M6阿姆斯特丹曲霉(Eurotiumamstelodami)，所有菌種使用前均進(jìn)行活化、純檢；發(fā)酵成熟豆瓣。

2.1.2 主要試劑

三氯乙酸、Na2CO3、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、干酪素、NaOH、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、脫脂奶粉、水合茚三酮試劑。

2.1.3 主要培養(yǎng)基

牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉2.5 g、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基0.401 g、蒸餾水100 mL，分裝，經(jīng)115 ℃ 20 min滅菌，備用。

蠶豆粉液體培養(yǎng)基：蠶豆粉3 g、葡萄糖0.8 g、蒸餾水100 mL。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，分裝，經(jīng)121 ℃ 20 min滅菌，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：取本品40.1 g，加蒸餾水1000 mL，加熱煮沸至完全溶解，分裝，經(jīng)121 ℃ 20 min滅菌，備用。

2.1.4 主要設(shè)備

PSHP-250型智能生化培養(yǎng)箱 上海光都儀器設(shè)備有限公司；CJ-1D超凈工作臺(tái) 天津市泰斯特儀器有限公司；TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

將菌種接種于蠶豆培養(yǎng)基中，(29±1) ℃條件下培養(yǎng)3～4天，使霉菌充分生長，反復(fù)轉(zhuǎn)接2～3次后，可將退化及衰老的細(xì)胞除去，使菌種達(dá)到生長旺盛、菌活量高的對數(shù)期。通過對菌株的反復(fù)連續(xù)培養(yǎng)，使菌體中保持原有典型性狀的單細(xì)胞恢復(fù)原有菌株典型性狀，可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)[5]。

2.2.2 待測酶液制備

將種子液接種于蠶豆培養(yǎng)基中，搖床參數(shù)設(shè)定180 r/min，30 ℃培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中于4 ℃，10000 r/min條件下離心5 min，收集上清液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

2.2.3.1 平板透明圈法[6]初篩選出具有產(chǎn)蛋白酶能力的菌株

用接種環(huán)刮取1環(huán)試驗(yàn)菌株孢子到裝液量20 mL/100 mL的大豆培養(yǎng)基中，設(shè)定參數(shù)30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)48 h。制備牛奶培養(yǎng)基，取發(fā)酵液10 mL，5000 r/min離心10 min，然后取上清液100 μL加入到初篩平板點(diǎn)樣孔中，28 ℃培養(yǎng)48 h后，比較水解圈大小[7]。所有試驗(yàn)均設(shè)3組平行。

2.2.3.2 Folin-酚法復(fù)篩確定高產(chǎn)蛋白酶菌株

根據(jù)SB/T 10317-1999，稍做修改。

2.2.3.3 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)備6支無菌試管并編號(hào)，按表1調(diào)配不同濃度標(biāo)準(zhǔn)的酪氨酸溶液。

表1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Table 1 The making of standard curve of tyrosine

取16支干燥無菌的試管編號(hào)，將表1中配制的各濃度酪氨酸溶液分別取1 mL，分別加入0.4 mo1/mL Na2CO3溶液5 mL、Folin試劑溶液1 mL后，置于(40±2) ℃水浴中恒溫20 min。

在波長660 nm處，以0號(hào)試管為對照空白，測定吸光度。

建立回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量(μg)，即為吸光常數(shù)K值。

2.2.3.4 蛋白酶活力的測定

取待測酶液1.0 mL于20 mL刻度管中，(40±2) ℃預(yù)熱5 min，加入1.0 mL 2%酪蛋白溶液，于(40±2) ℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，加2.00 mL 0.4 mo1/L TCA溶液終止反應(yīng)，搖勻后10000 r/min離心10 min，再取上清液1 mL于試管中，相繼加入5 mL 0.4 mo1/L Na2CO3溶液，1 mL Folin-酚試劑稀釋液，混勻后于(40±2) ℃水浴中顯色20 min，加蒸餾水定容至20 mL。

空白對照：先在樣品中加入TCA使酶失活，再加入酪蛋白溶液，以后操作步驟參考上述方法。

在660 nm波長下測定OD值。

“古道”則是用典，用了《咸陽別李處士》“古道自迢迢，咸陽離別橋。”典故。古道是分別的最后一站，牽手走過的地方注定是預(yù)示著分別的存在，這使歌曲充滿了離愁別緒，牽手走過的道路也成為了離別的道路，這使歌曲充滿了戲劇化的魅力。

對蛋白酶活力的規(guī)定：1 mL酶液在40 ℃時(shí)1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸量，將此定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

粗酶液的蛋白酶活力(U)=(OD1-OD2)×K×V×N/t。

式中：OD1為樣品的吸光度值；OD2為空白對照的吸光度值；V為反應(yīng)試劑總體積；N為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間；K為由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的吸光常數(shù)，本試驗(yàn)所求的K=97。

2.2.4 高產(chǎn)肽酶菌株篩選[8]

2.2.4.1 亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

取8支20 mL具塞刻度試管并編號(hào)，參照文獻(xiàn)中操作步驟加入各種試劑，蓋上玻璃塞，混勻。再在100 ℃水浴中加熱15 min(加熱時(shí)封口)，取出后立即置于冷水中迅速冷卻。然后迅速向每管中加入5 mL 95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，此時(shí)溶液呈紫色。然后用60%乙醇稀釋至20 mL，以0號(hào)管為參比進(jìn)行調(diào)零，于570 nm波長處測定溶液的吸光度，重復(fù)3次，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程。

2.2.4.2 肽酶活力測定反應(yīng)體系

取待測酶液1 mL，加入質(zhì)量濃度2 g/dL的無菌大豆肽溶液1 mL，置于3 mL pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中反應(yīng)過夜，最后取反應(yīng)液1 mL，測定其中游離氨基酸總量。

2.2.4.3 反應(yīng)體系中游離氨基酸總量計(jì)算[9]

游離氨基酸總量(mg/dL)=(m1×V)/(Vs×m×1000)×100。

式中：m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的氨基酸的質(zhì)量(μg)；V為樣品提取液總體積(mL)；Vs為測定時(shí)所取樣品液體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。

2.2.5 氨基酸態(tài)氮含量測定

參照GB/T 5009.40-2003規(guī)定的方法測定。

2.2.6 游離氨基酸測定

本試驗(yàn)是測定發(fā)酵成熟的豆醅中游離氨基酸，選用了LC-20AT高效液相色譜儀測定；測定依據(jù)為GB/T 16631-2008《高效液相色譜法通則》。

3 結(jié)果分析

3.1 高酶活菌株篩選

3.1.1 高產(chǎn)蛋白酶菌株篩選

牛奶平板蛋白酶初篩結(jié)果見圖1。

圖1 牛奶平板蛋白酶初篩結(jié)果Fig.1 The initial screening results of protease by milk plate count method

將粗酶液置于牛奶平板上過夜培養(yǎng)，除M4無明顯產(chǎn)酶能力外，4株均顯示出具有產(chǎn)蛋白酶的能力。

按照2.2.3所述方法測定吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2?？芍野彼針?biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0103x-0.00129。

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of tyrosine

由圖3可知，M3菌株產(chǎn)蛋白酶活力與其余產(chǎn)蛋白酶菌株活力存在顯著差異，菌株M3蛋白酶活力最強(qiáng)，為139.49 U/mL。

3.1.2 高產(chǎn)肽酶菌株篩選

亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，利用一元線性回歸方程分析得到亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.181x+0.015，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，表明亮氨酸與OD570之間線性回歸比較顯著，可用于以大豆肽粉為底物測定菌株產(chǎn)肽酶活力。

圖4 亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of leucine

圖5 菌株產(chǎn)肽酶酶活力Fig.5 Strains' producing peptidase enzyme activity

由圖5可知，試驗(yàn)菌株均具有產(chǎn)肽酶能力，但能力大小存在差異，總肽酶活力上菌株M6產(chǎn)肽酶能力最強(qiáng)，為1.039 mg/dL，M2次之，為0.928 mg/dL，其余菌株產(chǎn)肽酶能力均弱于這2株。

結(jié)合高產(chǎn)蛋白酶菌株篩選結(jié)果，確定高產(chǎn)肽酶菌株為M6，并對菌株M3，M6進(jìn)行菌株性能評(píng)定及應(yīng)用。

3.2 豆醅促熟性研究

3.2.1 豆醅氨基酸態(tài)氮含量測定

表2 氨基酸態(tài)氮含量Table 2 Amino acid nitrogen content

氨基酸態(tài)氮指以氨基酸形式存在的氮元素含量，是判定發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵程度的特性指標(biāo)，含量越高，鮮味越好。由表2可知，M6菌株強(qiáng)化菌群組氨基酸態(tài)氮的含量最為突出，含量高達(dá)0.748 g/100 g，在發(fā)酵過程中利用了更多的底物，使之分解為游離氨基酸，提高豆醅品質(zhì)。

3.2.2 豆醅游離氨基酸測定

表3 游離氨基酸含量表Table 3 Table of free amino acid content

表4 呈味氨基酸含量表Table 4 Table of flavor amino acid content

注：-表示未檢出。

決定豆瓣辣醬風(fēng)味的氨基酸主要為苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)及酪氨酸(Tyr)，由表3和表4可知，傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)CK組豆醅中的呈味氨基酸為77.682 mg/g，占總氨基酸的45.23%；加M3菌組豆瓣辣醬中的呈味氨基酸為82.9488 mg/g，占總氨基酸的56.63%；加M6菌組豆瓣辣醬中的呈味氨基酸為67.801 mg/g，占總氨基酸的48.03%?？芍簭?qiáng)化對于風(fēng)味氨基酸的產(chǎn)出是有利的，所占比重均比傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)CK組值大，這說明2株高產(chǎn)酶菌株對風(fēng)味有著明顯改善作用。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

對從豆瓣辣醬微生物區(qū)系中篩選且已鑒定的5株霉菌菌株M2～M6進(jìn)行高產(chǎn)蛋白酶菌株及高產(chǎn)肽酶菌株的篩選，結(jié)果表明：菌株M3產(chǎn)蛋白酶能力明顯，菌株M6產(chǎn)肽酶能力突出，因此確定這2株菌為目標(biāo)菌株，進(jìn)行引用。

將菌株應(yīng)用于發(fā)酵中，使發(fā)酵豆醅成為菌群強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)組，與傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)CK強(qiáng)化組比較，可明顯看出2株高酶活菌株具有一定的促熟、增香作用。且2株高酶活菌株應(yīng)用于發(fā)酵后，產(chǎn)品理化指標(biāo)均有部分優(yōu)化，這表明高酶活菌株應(yīng)用于生產(chǎn)上是切實(shí)可行的，具有優(yōu)勢。

4.2 討論

本試驗(yàn)所得結(jié)論證實(shí)了高酶活菌株對豆醅發(fā)酵起到促進(jìn)作用的預(yù)想，且證明了高酶活菌株應(yīng)用于產(chǎn)品中確實(shí)能改善產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值。但是，菌株如何高效使用和菌株的保存，以及工業(yè)化生產(chǎn)還是擬待解決的問題。同時(shí)，菌株的安全性測試還應(yīng)該繼續(xù)完善。傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的完美結(jié)合將是今后努力追求的目標(biāo)。

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ScreeningofHighEnzymeActivityStrainsfromBeanChiliSauceandResearchonRipeningPromotionofBeanFermentedGrains

DAN Qian, MAO Jia-yi, ZENG Hai-ying*

(College of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Take the five dominant moulds M2～M6 separated and identified from microflora of bean chili sauce as test strains, screen high-yield protease and peptidase strains and apply them for fermenting bean fermented grains, in order to explore the application feasibility of shortening fermentation period, promoting flavor and improving quality compared with the traditional fermentation. The protease activity of M3 reaches 139.49 U/mL and the peptidase activity of M6 reaches 1.039 mg/dL. The fermentation time is shortened to 20 days (the traditional fermentation period is 60～90 days). The content of amino acid in M3 group is 56.63% and that in M6 group is 48.03%.At the same time, that of the traditional high-quality CK group is only 45.23%, the difference is significant (P<0.05).

bean chili sauce；high proteinase；high peptidase；ripening promotion；flavor

TS264.29

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.010

1000-9973(2017)12-0050-04

2017-06-12 *通訊作者

曾海英(1978-)，女，貴州貴陽人，副教授，研究方向：食品發(fā)酵與安全。