嚴(yán)超，牟建樓，陳志周，劉亞瓊，趙歡，齊曉茹

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000)

櫛孔扇貝酶解液制備條件優(yōu)化及其抗氧化性研究

嚴(yán)超，牟建樓*，陳志周，劉亞瓊，趙歡，齊曉茹

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000)

以櫛孔扇貝為原料，以水解度和DPPH自由基清除率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken方法，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解制備具有抗氧化性多肽的扇貝酶解液工藝，并對(duì)扇貝酶解液的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化活力和抗超氧陰離子活力進(jìn)行測(cè)定。研究了蛋白酶種類(lèi)、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量和固液比對(duì)櫛孔扇貝酶解液抗氧化性的影響。結(jié)果表明：扇貝最佳酶解條件為選擇中性蛋白酶、酶解時(shí)間4.7 h、酶解溫度43 ℃、加酶量3.5%、固液比(m/V)1∶5。在此條件下，DPPH自由基清除率達(dá)到68.21%，羥自由基清除率為33.74%，總抗氧化活力為0.086 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為106.27 U/g prot。

櫛孔扇貝；酶解；水解度；抗氧化性

櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、翼形亞(Pterimorphia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae)[1]，是我國(guó)重要的海產(chǎn)貝類(lèi)，其味道鮮美，受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。扇貝富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅包括蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有非常豐富的多不飽和脂肪酸及縮醛磷脂[2]；扇貝多肽有很多生理功能，具有天然的抗腫瘤成分活性和天然的抗氧化性，能夠阻擋紫外線的氧化損傷[3]。

扇貝通過(guò)酶解制備的酶解液中含有豐富的生物活性肽，生物活性肽具有免疫活性、抗氧化、抗高血脂、抗高血壓、抑制腫瘤等功能[4,5]。肽類(lèi)比同一氨基酸組成的蛋白質(zhì)的消化吸收率要高，且風(fēng)味優(yōu)于單個(gè)氨基酸[6]，同時(shí)多肽具有極易溶于水、粘度低、抗凝膠等特性，因此在食品和化妝品中有廣泛應(yīng)用[7]，而且扇貝酶解液具有天然的海鮮風(fēng)味，是理想的海鮮風(fēng)味調(diào)味品的基料[8]。因水產(chǎn)品中含有豐富的蛋白質(zhì)及其特殊的氨基酸組成，現(xiàn)在生物活性肽的制備方面具有廣泛應(yīng)用[9-12]。通過(guò)酶解制備的多肽酶解液具有抗氧化活性，制備的酶解液可以用于產(chǎn)品的抗氧化性質(zhì)的加強(qiáng)，開(kāi)拓了良好的食品、保健品市場(chǎng)。

本文以櫛孔扇貝為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了制備具有抗氧化性扇貝酶解液的條件，并對(duì)其體外抗氧化性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫛孔扇貝 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技市場(chǎng)，冷凍保存；蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；甲醛(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；DPPH 梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、抗超氧陰離子試劑盒(A052) 南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；79-2單、雙向磁力加熱攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；AR423CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；JJ-2組織勻漿機(jī) 金壇市億通電子有限公司；PHS-3C智型pH 計(jì) 上海虹益儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 扇貝預(yù)處理

將冷凍的扇貝解凍后，除雜，清洗，切成顆粒狀，再放入組織勻漿機(jī)搗成肉糜狀，放置冰箱冷凍備用。

1.2.2 扇貝酶解工藝流程

扇貝肉糜→加水勻漿→調(diào)節(jié)pH→加入蛋白酶→保溫酶解→100 ℃滅酶→4500 r/min離心15 min→取上清液→扇貝酶解液。

1.2.3 蛋白酶的選擇

其中溫度和pH均為推薦值，加酶量1%，酶解時(shí)間5 h，固液比1∶5，對(duì)扇貝進(jìn)行酶解。分別測(cè)定各種酶解液水解度和DPPH自由基清除率。試驗(yàn)重復(fù)3次，確定適宜的蛋白酶。各種蛋白酶最適的酶解條件見(jiàn)表1。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 The enzymatic conditions of different proteases

1.2.4 扇貝酶解液?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)

1.2.4.1 酶解時(shí)間的確定

選取中性蛋白酶，在固液比1∶5，加酶量1%，酶解溫度45 ℃的條件下，選取酶解時(shí)間分別為3.5，4，4.5，5.5，6 h。分別測(cè)定扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.2 酶解溫度的確定

選取中性蛋白酶，在固液比1∶5，加酶量1%，酶解時(shí)間4 h的條件下，選取酶解溫度分別為30，35，40，45，50 ℃。分別測(cè)定扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.3 加酶量的確定

選取中性蛋白酶，在固液比1∶5，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度45 ℃的條件下，選取加酶量分別為0.5%，1%，2%，3%，4%。分別測(cè)定扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.4 固液比的確定

選取中性蛋白酶，在酶解時(shí)間4 h，酶解溫度45 ℃，加酶量1%的條件下，選取固液比分別為1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7。分別測(cè)定蛋白酶的水解度和DPPH自由基清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以酶解時(shí)間(X1)、 酶解溫度(X2)、加酶量(X3)為變量進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 水解度的測(cè)定

總氮含量測(cè)定：采用GB 5009.5-2010中凱式定氮法；氨基酸態(tài)氮(AAN)含量測(cè)定：采用GB/T 5009.40-2003中甲醛值法；水解度(DH)計(jì)算公式[13]：

1.2.7 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Bae Song Hwan和劉媛等[14，15]的方法，并稍做修改。向具塞試管中依次加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，1 mL蒸餾水，1 mL待測(cè)液，振蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)20 min，在517 nm下測(cè)其吸光值A(chǔ)s；空白組為1 mL無(wú)水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)x；對(duì)照組為1 mL蒸餾水代替樣品，測(cè)定吸光值A(chǔ)0，并以等體積蒸餾水和無(wú)水乙醇混合液空白調(diào)零，DPPH自由基清除率(R)公式為：

1.2.8 羥自由基清除率的測(cè)定

參照田倩等[16]的方法，并稍做修改。向具塞試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)1 mL，待測(cè)樣品溶液1 mL及0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻后加入體積分?jǐn)?shù)為0.01%的H2O2溶液1 mL搖勻，37 ℃水浴1 h，在536 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A樣品)；用去離子水代替樣品溶液測(cè)定損傷管吸光度(A損傷)；用去離子水代替樣品溶液和H2O2測(cè)定未損傷管吸光度(A未損傷)；參照組為等體積的樣品溶液、磷酸鹽緩沖溶液和去離子水，測(cè)定吸光度(A參)；空白組為等體積的去離子水和磷酸鹽緩沖溶液，測(cè)定其吸光度(A空)。羥自由基清除率的計(jì)算公式為：

1.2.9 總抗氧化能力的測(cè)定

總抗氧化能力的測(cè)定依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)。以每分鐘每毫克的組織蛋白，在37 ℃條件下使得反應(yīng)體系的吸光度值每變大0.01時(shí)，作為1個(gè)總抗氧化能力單位，計(jì)算公式為：

1.2.10 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)。每克組織蛋白在37 ℃條件下，反應(yīng)40 min，所能抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 g的維生素C，所能抑制的該自由基的數(shù)量變化值，作為1個(gè)單位，計(jì)算公式為：

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳蛋白酶的選擇

不同蛋白酶對(duì)扇貝酶解效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同蛋白酶對(duì)扇貝酶解效果的影響Fig.1 Effect of protease types on hydrolysis efficiency of scallop

由圖1可知，不同蛋白酶對(duì)扇貝酶解液的效果不同，因?yàn)椴煌牡鞍酌杆獾鞍踪|(zhì)時(shí)，作用的位點(diǎn)不同，水解液的抗氧化活性就不同[17]。根據(jù)不同蛋白酶的最適作用條件對(duì)扇貝進(jìn)行酶解，其中中性蛋白酶對(duì)扇貝作用的水解度和DPPH自由基清除率分別為(30.88±0.77)%和(66.42±1.41)%。經(jīng)方差分析，水解度和DPPH自由基清除率都顯著高于其他3種酶(p<0.05)。因此，選擇中性蛋白酶為本試驗(yàn)水解酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 酶解時(shí)間的確定

酶解時(shí)間對(duì)扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH clearance rate

由圖2可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸增大；DPPH自由基清除率先增大后逐漸降低，在酶解時(shí)間為4.5 h時(shí)，達(dá)到最大值(65.87±0.62)%。可能是因?yàn)榈孜餄舛鹊臏p少或pH改變使酶活力逐漸降低，或水解產(chǎn)物的抑制作用等因素所致，且當(dāng)酶解時(shí)間短時(shí)酶解反應(yīng)不徹底，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能出現(xiàn)過(guò)度水解，從而影響酶解液的抗氧化活性。經(jīng)方差分析，不同酶解時(shí)間對(duì)扇貝酶解液DPPH自由基清除率的影響差異顯著(p<0.05)，綜合考慮，選取適宜的酶解時(shí)間為4.5 h。

2.2.2 酶解溫度的確定

酶解溫度對(duì)扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on DH and DPPH clearance rate

由圖3可知，隨著酶解溫度的增大，扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率都出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且在45 ℃時(shí)，水解度和DPPH清除率都達(dá)到最高值，分別為(33.25±0.45)%和(52.64±1.06)%。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)溫度升高，反應(yīng)速度加快，酶解效率提高，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)使蛋白酶變性，酶解效率隨之降低[18]。經(jīng)方差分析，不同酶解溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響差異均顯著(p<0.05)，故選擇適宜的酶解溫度為45 ℃。

2.2.3 加酶量的確定

加酶量對(duì)扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 加酶量對(duì)扇貝酶解液水解度和 DPPH自由基消除率的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on DH and DPPH clearance rate

由圖4可知，扇貝酶解液的水解度和DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加而緩慢升高，當(dāng)加酶量為3%時(shí)，二者都達(dá)到最大值，分別為(30.28±0.56)%和(68.86±0.97)%。而隨著加酶量繼續(xù)增加，水解度和DPPH清除能力逐漸降低。這是因?yàn)殡S著加酶量的增加，與底物作用的活性基團(tuán)增加，加速酶促反應(yīng)；繼續(xù)增加酶量，底物達(dá)到飽和或水解過(guò)度，使抗氧化活性降低[19]。經(jīng)方差分析，加酶量為2%，3%，4%時(shí)，對(duì)水解度的影響差異不顯著，但在加酶量3%時(shí)，DPPH自由基清除率顯著高于其他處理(p<0.05)，綜合考慮選擇適宜的加酶量為3%。

2.2.4 固液比的確定

固液比對(duì)扇貝酶解液水解度和DPPH自由基清除率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 固液比對(duì)扇貝酶解液水解度和 DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of the ratio of solid-liquid on DH and DPPH clearance rate

由圖5可知，水解度和DPPH自由基清除率都隨著液體比例的增加先增加后降低，在固液比為1∶5時(shí)達(dá)到最大值，分別為(32.17±0.46)%和(67.67±1.20)%。這是因?yàn)樗獬潭入S底物濃度的增大而增大，但底物濃度太高時(shí)不利于酶與底物的充分接觸，只有在合適的底物濃度時(shí)，蛋白酶才能充分發(fā)揮作用[20]。經(jīng)方差分析，不同固液比對(duì)扇貝水解度的影響差異顯著(p<0.05)，且考慮到成本問(wèn)題，選擇適宜的固液比為1∶5。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量為變量，DPPH自由基清除率為因變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

利用Design Expert 8.6軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得擬合二次多項(xiàng)式方程：Y=-79.34995+32.40125X1+3.03863X2+2.45780X3-0.042250X1X2+0.42000X1X3-0.043000X2X3-3.37375X12-0.030838X22-0.36580X32。

對(duì)該模型及系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Regression model significance test results

續(xù) 表

注：R2=0.9781; RAdj2=0.9500; **表示極顯著; *表示顯著;-表示不顯著。

由表4可知，該二次多項(xiàng)式模型具有高度顯著性(p<0.0001)。R2為0.9781，表明該回歸方程回歸效果比較好，可用模型解釋DPPH自由基清除率響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)不顯著(p=0.2313>0.05)，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合程度良好。分析各模型系數(shù)的p值，可知A，B2，C2，AB，AC和BC項(xiàng)的影響顯著，說(shuō)明酶解溫度、酶解時(shí)間和加酶量之間均存在交互作用。

各因素之間交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6～圖8。

圖6 溫度與時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of temperature and time on the scavenging ratio of DPPH radical

圖7 時(shí)間與加酶量對(duì)DPPH自由基清除率的影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of time and enzyme amount on the scavenging ratio of DPPH radical

圖8 溫度與加酶量對(duì)DPPH自由基清除率的影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of temperature and enzyme amount on the scavenging ratio of DPPH radical

由圖6～圖8可知，在所選因素水平范圍內(nèi)，響應(yīng)值有最大值。通過(guò)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)最優(yōu)的酶解條件為：酶解時(shí)間4.75 h、酶解溫度43.56 ℃、加酶量3.53%，此時(shí)DPPH自由基清除率最大值為68.09%。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的可行性，選取酶解時(shí)間4.70 h、酶解溫度43 ℃、加酶量3.50%、固液比1∶5進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)得試驗(yàn)結(jié)果的DPPH自由基清除率為68.21%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為0.12%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后得出的回歸方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

2.5 抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

在最佳酶解工藝條件下制備酶解液，測(cè)定扇貝酶解液的抗氧化指標(biāo)，蛋白濃度為17.97 mg prot/mL的扇貝酶解液的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力、抗超氧陰離子活力分別為(68.21±0.63)%，(33.74±0.85)%，(0.086±0.05) U/mg prot，(106.27±3.71) U/g prot。

3 結(jié)論

試驗(yàn)確定了采用中性蛋白酶制備抗氧化性扇貝酶解液的條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取試驗(yàn)因素和水平，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析，對(duì)酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，建立了酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量三者與DPPH自由基清除率之間的數(shù)學(xué)模型，模型的回歸效果顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有良好的預(yù)測(cè)性。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化的酶解條件為：酶解時(shí)間4.7 h、酶解溫度43 ℃、加酶量3.50%、固液比1∶5。在此條件下，DPPH自由基清除率達(dá)到68.21%，羥自由基清除率為33.74%，總抗氧化活力為0.086 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為106.27 U/g prot，說(shuō)明采用中性蛋白酶制備的扇貝酶解液具有良好的抗氧化能力。

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StudyonOptimizationofPreparationConditionsandAntioxidantActivityofEnzymaticHydrolysateofChlamysfarreri

YAN Chao, MU Jian-lou*, CHEN Zhi-zhou, LIU Ya-qiong, ZHAO Huan, QI Xiao-ru

(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000，China)

WithChlamysfarrerias raw material, degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate are used as indicators. Based on the single factor test, the Box-Behnken method is used to optimize the enzymatic hydrolysis of scallop hydrolysate with antioxidative polypeptide by response surface test. DPPH free radical scavenging rate, hydroxyl radical scavenging rate, total antioxidant activity and anti-superoxide anion activity are measured. The effects of protease types, enzymolysis time, enzymolysis temperature, enzyme amount and solid-liquid ratio on the antioxidant activity of enzymatic hydrolysate ofChlamysfarreriare studied. The results show that the optimal parameters of enzymolysis are as follows: using neutral protease, the enzymolysis time is 4.7 h, the enzymolysis temperature is 43 ℃, the enzyme amount is 3.5%, the solid-liquid ratio (m/V) is 1∶5. Under the optimum conditions, the scavenging rate of DPPH free radical and hydroxyl radical is 68.21% and 33.74% respectively, the total antioxidant activity is 0.086 U/mg prot, the anti-superoxide anion radical activity is 106.27 U/g prot.

Chlamysfarreri;enzymolysis;degree of hydrolysis;antioxidant activity

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.001

1000-9973(2017)12-0001-06

2017-06-22 *通訊作者

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(14273205D)

嚴(yán)超(1992-)，女，碩士，研究方向：食品加工與安全。