丁唯嘉，周丹麗，陳 敏，宋高鵬，楊卓鴻，李春遠(yuǎn)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.材料與能源學(xué)院； b.公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 廣州 510642)

·實(shí)驗(yàn)教學(xué)與創(chuàng)新·

海洋芽孢桿菌中IturinA分離鑒定研究性實(shí)驗(yàn)教學(xué)探索

丁唯嘉a，周丹麗a，陳 敏b，宋高鵬a，楊卓鴻a，李春遠(yuǎn)a

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.材料與能源學(xué)院； b.公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 廣州 510642)

以一株海洋Bacillussp.細(xì)菌為對(duì)象，進(jìn)行天然藥物化學(xué)研究性實(shí)驗(yàn)的教學(xué)探索。通過優(yōu)化菌株發(fā)酵條件、改進(jìn)文獻(xiàn)提取分離純化方案，高效率地分離純化出目標(biāo)產(chǎn)物Iturin A，并指導(dǎo)學(xué)生綜合運(yùn)用質(zhì)譜，1HNMR結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。該實(shí)驗(yàn)合理使用制備高效液相色譜儀，液質(zhì)聯(lián)用儀、核磁共振儀等大型儀器設(shè)備，改進(jìn)了傳統(tǒng)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，實(shí)現(xiàn)了學(xué)生實(shí)驗(yàn)中微量天然產(chǎn)物快速、高效、可視化的分離與純化。實(shí)驗(yàn)有助于激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，使其全面深刻地認(rèn)識(shí)微生物天然產(chǎn)物的科學(xué)研究流程，了解掌握不同大型儀器的應(yīng)用范圍和操作技術(shù)，提升操作技能和創(chuàng)新能力。

研究性實(shí)驗(yàn)； 天然藥物化學(xué)； 海洋微生物； 芽孢桿菌

0 引 言

天然藥物化學(xué)是運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法研究天然產(chǎn)物活性成分的學(xué)科[1]，是中藥學(xué)、藥學(xué)、制藥工程、應(yīng)用化學(xué)等藥學(xué)或化學(xué)類相關(guān)專業(yè)本科或碩士研究生的一門專業(yè)課。其配套課程天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)主要包括天然產(chǎn)物有效成分提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定等內(nèi)容[2]。然而，目前國內(nèi)各高校開設(shè)的天然藥物成分提取分離實(shí)驗(yàn)主要以陸生植物為對(duì)象，缺乏關(guān)于微生物或海洋天然產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，與教材中增設(shè)的海洋天然產(chǎn)物章節(jié)及有關(guān)微生物代謝產(chǎn)物的知識(shí)內(nèi)容有所脫節(jié)[3-5]。另一方面，隨著大型儀器的普及、更新及新儀器的出現(xiàn)，天然藥物化學(xué)的科研流程逐漸走向微量化、高速化和可視化[6-8]，而目前的天然產(chǎn)物成分提取分離學(xué)生實(shí)驗(yàn)較少使用制備高效液相儀、液質(zhì)聯(lián)用儀等大型設(shè)備，缺乏對(duì)新技術(shù)、新方法的介紹和應(yīng)用，不利于符合社會(huì)需求的創(chuàng)新性人才的培養(yǎng)。伊枯草菌素(Iturin)是由芽孢桿菌產(chǎn)生的一類大環(huán)脂肽類化合物，其中Iturin A含量相對(duì)較高，包括8種化合物，具有強(qiáng)烈抗真菌活性，且低毒、抗菌譜廣，在醫(yī)藥，多種農(nóng)作物病害防治和果蔬保鮮方面有較高的應(yīng)用價(jià)值[9-11]。鑒于以上原因，在課題組科研項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，本文設(shè)計(jì)了一則以一株分離自湛江海岸泥沙的Bacillussp.ms12為對(duì)象快速分離純化Iturin A的研究性實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用了液質(zhì)聯(lián)用儀、制備高效液相儀、核磁共振儀等大型儀器設(shè)備和多種天然藥物化學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作，有利于培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能、創(chuàng)新能力和綜合運(yùn)用知識(shí)從事科學(xué)研究的能力，促進(jìn)學(xué)生對(duì)天然藥物化學(xué)新技術(shù)和相關(guān)章節(jié)知識(shí)更加全面深刻的認(rèn)識(shí)。

1 優(yōu)化菌株發(fā)酵條件

為提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)的效率，提前采用正交法優(yōu)化確定了菌株Bacillussp.ms12的發(fā)酵條件：葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，NaCl 7 g/L，K2HPO45 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0，28℃下以200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d。在此條件下菌株發(fā)酵1 L所得Iturin A化合物的量可順利完成核磁共振和質(zhì)譜測試。同時(shí)發(fā)酵時(shí)間也適合學(xué)生研究性實(shí)驗(yàn)開設(shè)的周期要求。

2 提取、分離及純化方法的探索與優(yōu)化

2.1采用大孔吸附樹脂DM301進(jìn)行提取

早期報(bào)道Iturin A化合物提取主要采用飽和硫酸銨溶液鹽沉淀法[12]，需靜置過夜析出沉淀，且沉淀需經(jīng)過透析除鹽步驟，耗時(shí)較長?，F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室主要采用酸沉淀法，需將發(fā)酵液加HCl調(diào)pH到2后過夜沉淀，再將沉淀用甲醇懸浮，NaOH調(diào)pH到中性，甲醇多次萃取得到提取物[13]。然而對(duì)于學(xué)生實(shí)驗(yàn)而言，該方法等待沉淀時(shí)間仍然偏長，難以合理分配教學(xué)時(shí)間。近幾年有研究表明，Iturin A在S-8，AB-8等6種不同極性大孔樹脂中均能被完全吸附，其中以DM301的解吸效果相對(duì)最好[14]。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道基本符合，因此，從學(xué)生實(shí)驗(yàn)時(shí)效性考慮，采用了大孔吸附樹脂DM301提取法代替了酸或堿提取法。

2.2超聲波輔助動(dòng)靜態(tài)解吸結(jié)合對(duì)大孔樹脂吸附物進(jìn)行粗分離

文獻(xiàn)報(bào)道，使用無水乙醇可使大孔吸附樹脂中Iturin A的解吸率達(dá)到90%以上[14]。然而直接使用無水乙醇洗脫會(huì)導(dǎo)致樹脂中所吸附的糖類等大極性化合物與Iturin A一起解吸，影響后續(xù)分離純化工作，因此，有必要增加解吸劑極性段進(jìn)行粗分離。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，40%乙醇水混合溶劑對(duì)發(fā)酵液中Iturin A 基本沒有解吸作用，因此，實(shí)驗(yàn)先采用該溶劑洗去無關(guān)物質(zhì)后再用無水乙醇解吸出Iturin A粗產(chǎn)物。同時(shí)，在解吸過程中采用先將飽和樹脂置于三角瓶中超聲波輔助靜態(tài)解吸，再使用布氏漏斗進(jìn)行抽濾和動(dòng)態(tài)解吸的方法[15]，不僅大大提高了解吸速度和效率，而且所消耗溶劑也只有普通靜態(tài)或動(dòng)態(tài)解吸方法的1/3左右。

2.3液質(zhì)聯(lián)用指導(dǎo)下使用制備高效液相色譜進(jìn)行IturinA純化

制備高效液相色譜儀具有上樣量大、不破壞樣品、分離速度快、分離效能高、檢測器靈敏度高且分離過程可視化等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，Iturin A類似物多，產(chǎn)量低且分子量大，在低發(fā)酵量時(shí)采用常規(guī)分離方法很難得到純品。因此，使用制備高效液相色譜儀進(jìn)行純化成為首選。Iturin A的制備液相純化條件可使用分析型液相色譜進(jìn)行摸索。在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的情況下，設(shè)計(jì)了使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS)摸索純化條件的方法，所得LC色譜見圖1[LCMS液相色譜條件為C18色譜柱 (Diamonsil, 5 μm, 150×2.0 mm)，20%乙腈水—100%乙腈梯度洗脫，洗脫時(shí)間25 min，檢測波長215 nm, 流速1 mL/min]。使用液質(zhì)聯(lián)用儀配套軟件依次查看每個(gè)色譜峰所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰，發(fā)現(xiàn)Iturin A系列化合物的分子量出現(xiàn)在保留時(shí)間13.2和13.6 min左右的兩個(gè)吸收峰處，對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖分別見圖2和圖3。

圖1 LCMS測試所得的HPLC圖

圖2 LCMS的HPLC譜中tR=13.2 min對(duì)應(yīng)的化合物(Iturin A2)的質(zhì)譜圖

圖3 LCMS的HPLC圖中tR=13.6 min對(duì)應(yīng)的化合物(Iturin A5)的質(zhì)譜圖

通常制備柱上樣量和分析柱上樣量的比值和兩者柱徑比值的平方成正比，兩者流速或流量也滿足相同的關(guān)系[16]。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的制備柱，計(jì)算出后續(xù)純化所用制備液相分離的流速和上樣量，成功通過制備液相在和LCMS接近的保留時(shí)間處純化得到兩個(gè)Iturin A系列的單體化合物。所得化合物質(zhì)譜圖分別和圖2及圖3一致。

3 質(zhì)譜、核磁共振氫譜與文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)合鑒定所得化合物結(jié)構(gòu)

目前，Iturin A 系列化合物絕大多數(shù)是通過質(zhì)譜方法進(jìn)行鑒定的[17]，故可引導(dǎo)學(xué)生通過文獻(xiàn)質(zhì)譜調(diào)研嘗試結(jié)構(gòu)解析。學(xué)生通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Iturin存在 Iturin A1、A2和 A6 3個(gè)同系物，m/z分別為 1 029.5, 1 043.5 和 1 071.5，而m/z為 1 057.5 可能是 Iturin A3、A4或 A5的同系物，它們?nèi)叩膍/z相同，通過質(zhì)譜分析很難將它們區(qū)分開[18]。由此學(xué)生通過圖2質(zhì)譜分子離子峰1 043.6[M+H]+、 1 065.6[M+Na]+很快確定液相中保留時(shí)間13.2 min處吸收峰所對(duì)應(yīng)的化合物為Iturin A2(結(jié)構(gòu)式見圖5)。另一個(gè)化合物的鑒定還需要通過核磁共振氫譜(1HNMR)輔助進(jìn)行，用0.5 mL氘代二甲基亞砜將其溶解，加入核磁管中，加塞。將核磁管插入轉(zhuǎn)子，用量規(guī)使處于合適高度后，放入核磁共振儀，經(jīng)進(jìn)樣，勻場、鎖場、采樣等操作命令后可得其1HNMR譜，見圖4。

在分析圖譜之前，先組織學(xué)生根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研得到的Iturin A3、A4和A5的結(jié)構(gòu)式(見圖5)進(jìn)行對(duì)比討論，從積分高度與質(zhì)子數(shù)、化學(xué)位移數(shù)值與官能團(tuán)、裂分與偶合情況關(guān)系等預(yù)測它們核磁共振氫譜可能的不同之處。學(xué)生經(jīng)過對(duì)比得出結(jié)論：Iturin A3的甲基信號(hào)應(yīng)該是積分為6的三重峰和二重峰疊加；Iturin A4的甲基信號(hào)應(yīng)該是積分為6的二重峰；Iturin A5的信號(hào)則應(yīng)該是積分為3的三重峰。再進(jìn)一步與圖4所測HNMR對(duì)比，發(fā)現(xiàn)0.74～0.87的甲基具有三重峰，由此確定所得另一個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)為Iturin A5。至此，實(shí)驗(yàn)得到圓滿成功，共分離鑒定了為Iturin A2 和A5兩個(gè)純凈的單體化合物。

圖4 所分離化合物(Iturin A5，LCMS中保留時(shí)間13.6 min的吸收峰)1HNMR譜

IturinA-2R=(CH2)11CH3
IturinA-3R=(CH2)8CH(CH3)CH2CH3
IturinA-4R=(CH2)9CH(CH3)2
IturinA-5R=(CH2)11CH3

圖5 Iturin A2、A3、A4和A5的結(jié)構(gòu)式

4 結(jié) 語

當(dāng)前各高校的天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)均偏重植物有效成分的提取分離，而忽視了微生物活性代謝產(chǎn)物的研究，不利于學(xué)生全面理解掌握天然藥物化學(xué)各類不同對(duì)象的不同研究方法。產(chǎn)生上述問題的主要原因在于微生物需要人工發(fā)酵培養(yǎng)，代謝產(chǎn)物種類復(fù)雜繁多且產(chǎn)量低，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)工作量大，分離純化相對(duì)困難等。針對(duì)這些問題，本文依托于自身科研項(xiàng)目，精選所需發(fā)酵量少，發(fā)酵時(shí)間短的Bacillussp.細(xì)菌為對(duì)象，分離其具有強(qiáng)烈抗真菌活性的主要產(chǎn)物Iturin A，通過優(yōu)化菌株發(fā)酵條件、改進(jìn)文獻(xiàn)提取分離純化方案，高效率地分離純化出目標(biāo)產(chǎn)物，并指導(dǎo)學(xué)生綜合運(yùn)用質(zhì)譜，1HNMR結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)有助于激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，使其全面深刻地認(rèn)識(shí)微生物天然藥物化學(xué)的科學(xué)研究流程，提升操作技能和創(chuàng)新能力。另一方面，目前國內(nèi)許多高校各類大型儀器設(shè)備已初步實(shí)現(xiàn)了普及，如何使大型儀器設(shè)備在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中充分發(fā)揮作用已成為高等學(xué)校急需面對(duì)的重要現(xiàn)實(shí)課題[19]。在此形勢下，根據(jù)自身設(shè)備條件，合理改革傳統(tǒng)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，運(yùn)用制備高效液相色譜儀，液質(zhì)聯(lián)用儀、核磁共振儀等大型儀器設(shè)備，實(shí)現(xiàn)了學(xué)生實(shí)驗(yàn)中微量天然產(chǎn)物快速、高效、可視化的分離與純化。實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握了相關(guān)大型儀器的應(yīng)用范圍和操作技術(shù)，對(duì)其更好地適應(yīng)當(dāng)今社會(huì)科技高速發(fā)展的現(xiàn)狀，提升就業(yè)能力起到了積極作用。實(shí)驗(yàn)所積累的Iturin A是目前抗植物病原真菌農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)化合物，后續(xù)可以作為大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目的原料，衍生出新的創(chuàng)新內(nèi)容。

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TeachingExplorationofaResearchExperimentfortheIsolationandIdentificationofIturinAfromaMarineBacillussp.

DINGWeijiaa,ZHOUDanlia,CHENMinb,SONGGaopenga,YANGZhuohonga，LIChunyuana

(a.College of Materials and Energy； b.Center of Experimental Teaching for Basic Courses;South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

A research experiment of natural medicinal chemistry was designed by using a Bacillus sp.which belongs to marine bacteria.The target was efficiently to isolate product Iturin A by optimizing fermentation conditions, improving the methods of extraction and separation presented in previous references.Moreover, under teachers’ guidance the structures of the product were elucidated by the students using MS,1HNMR and document investigation.In this experiment, the large-scale instruments including preparative HPLC spectrometer, LCMS spectrometer, and NMR spectrometer were reasonably used and the traditional teaching contents in natural medicinal chemical experiments werere formed.The fast, efficient and visual separation and purification of micro-scale natural products was achieved in the experiment.The experiment helps students to enhancethe interest of study, deepen the understanding of the scientific research procedures of marine microbial natural product chemistry, grasp the application scope and operation technology of these large-scale instruments, and improve the operating skill and innovation ability.

research experiments; natural medicinal chemistry; marine microorganism;bacillus

G 642.0

A

1006-7167(2017)10-0173-04

2016-08-29

國家自然科學(xué)基金(21102049)；廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313405)；廣東省科技計(jì)劃公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)基金(2016A020222019)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金([2015]311)；廣東省高等學(xué)校教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項(xiàng)目(GDJG20142098)；廣東省高等教育學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)室管理專業(yè)委員會(huì)基金項(xiàng)目(GDJ2014069)；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育教學(xué)改革與研究項(xiàng)目(JG16060，JG10109)；廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(201610564225)

丁唯嘉(1979-)，女，河南周口人，博士，講師，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究。Tel.:15919670749; E-mail:dwjzsu@scau.edu.cn

李春遠(yuǎn)(1978-)，男，河南扶溝人，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。Tel.:13570598356; E-mail:chunyuan-li@163.com