陶強(qiáng)，郭建榮，金孝岠

(1皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241001；2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院)

紅細(xì)胞微粒及其在機(jī)體生理病理過程中作用的研究進(jìn)展

陶強(qiáng)1,2，郭建榮2，金孝岠1

(1皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241001；2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院)

紅細(xì)胞微粒(RMPs)是一種由紅細(xì)胞釋放的直徑0.1～1 μm的磷脂囊泡，具有球形、管形以及大碎片狀三種形態(tài)，主要由游離Hb、脂質(zhì)以及參與各種生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)組成，氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、補(bǔ)體、高剪切力及溫度、pH值變化均可導(dǎo)致RMPs形成。RMPs的釋放被認(rèn)為是紅細(xì)胞擺脫特定的有害物質(zhì)侵襲并維持穩(wěn)態(tài)的一種方式。RMPs可參與細(xì)胞間信息傳遞、紅細(xì)胞老化清除、紅細(xì)胞貯存損傷、凝血及免疫反應(yīng)等生理病理過程。深入研究RMPs有助于明確體內(nèi)紅細(xì)胞衰亡過程、體外貯存損傷過程以及血液制品使用過程中對(duì)人體的影響，有助于減少輸血風(fēng)險(xiǎn)。

紅細(xì)胞微粒；貯存損傷；凝血功能

微粒是體內(nèi)各種細(xì)胞包括血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞釋放的直徑0.1～1 μm的磷脂囊泡，其中由紅細(xì)胞釋放的微粒稱為紅細(xì)胞微粒或微泡(RMPs)，活化和衰亡的紅細(xì)胞均可形成和釋放RMPs。一般情況下，紅細(xì)胞衰亡或受刺激時(shí)以出芽的形式從細(xì)胞膜上釋放RMPs，這個(gè)過程被認(rèn)為是一種對(duì)細(xì)胞應(yīng)激的原始應(yīng)答[1]。RMPs的形成被認(rèn)為是紅細(xì)胞擺脫特定有害物質(zhì)[變性Hb、C5b-9補(bǔ)體復(fù)合物、帶3蛋白(Band 3)的新抗原、免疫球蛋白G等]的侵襲，并維持組織穩(wěn)態(tài)的一種方式，但是RMPs對(duì)機(jī)體亦有不利的影響，如促進(jìn)血栓形成、激活炎癥反應(yīng)等。本文就RMPs的特點(diǎn)及其參與機(jī)體生理病理過程的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 RMPs的特點(diǎn)

1.1 RMPs的組成 Arraud等[2]研究表明，RMPs具有球形、管形以及大碎片狀三種形態(tài)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，RMPs所含蛋白質(zhì)與其親代細(xì)胞并不完全相同，RMPs膜表面在保留了紅細(xì)胞表面蛋白抗原(如血型糖蛋白A)的同時(shí)，其骨架相關(guān)分子數(shù)量相對(duì)減少，其他組分如Hb、Band 3、血型糖蛋白、補(bǔ)體受體、糖肌醇磷脂-錨定蛋白和脂筏標(biāo)記蛋白相對(duì)增多，RMPs磷脂酰絲氨酸(PS)和同源IgG6、7、17、19、20亦增多[3]。

RMPs主要由游離Hb、脂質(zhì)以及參與各種生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)組成。一項(xiàng)采用HbA1C作為細(xì)胞年齡標(biāo)記及其獲得片段的研究表明，在紅細(xì)胞的整個(gè)生命周期內(nèi)，RMPs的形成使得循環(huán)紅細(xì)胞失去20% Hb和細(xì)胞質(zhì)膜，說明RMPs中殘留的Hb大部分來自于循環(huán)紅細(xì)胞[4]。RMPs中的脂質(zhì)是以特異性口形脂筏的形式存在。脂筏是指膽固醇和鞘磷脂在真核細(xì)胞的質(zhì)膜表面構(gòu)成的微小、動(dòng)態(tài)、有序的結(jié)構(gòu)域，能夠影響質(zhì)膜組成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生物學(xué)過程[5]。研究表明，RMPs所含的脂筏主要由紅細(xì)胞膜整合蛋白構(gòu)成，并含有大量與鈣離子相關(guān)的會(huì)聯(lián)蛋白和抗藥蛋白[6]。RMPs的磷脂酸含量是完整紅細(xì)胞的10倍，磷脂酰乙醇胺含量較紅細(xì)胞稍降低，其余磷脂構(gòu)成和完整紅細(xì)胞相似；但由于缺乏血影蛋白，RMPs膜蛋白的磷含量只有完整紅細(xì)胞的一半[7]。RMPs中血型糖蛋白與膽固醇的含量與完整紅細(xì)胞胞膜一致，其主要組成蛋白質(zhì)的含量也與紅細(xì)胞類似[7]。

1.2 RMPs的形成 已知的一些特殊刺激，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、補(bǔ)體、高剪切力等均可以導(dǎo)致RMPs形成[8]。RMPs的形成機(jī)制目前主要有兩種，一種為鈣離子誘導(dǎo)RMPs形成，另一種則與Band 3有關(guān)。

當(dāng)pH為11時(shí)，紅細(xì)胞的雙層骨架相互作用減弱，在內(nèi)外膜之間形成一個(gè)不同于內(nèi)外膜的極端區(qū)域，此時(shí)RMPs呈游離狀態(tài)或通過一個(gè)狹窄的蒂與母細(xì)胞相連接[11]。隨著溫度升高，紅細(xì)胞釋放的RMPs也逐漸增多。研究表明，45 ℃條件下孵育新鮮人和兔紅細(xì)胞，并用EDTA和氯化鈣滴定，此時(shí)紅細(xì)胞以出芽的形式釋放出大小為0～1 nm的無細(xì)胞骨架的RMPs[12]。

1.3 RMPs的清除 RMPs的清除機(jī)制主要為：①通過與巨噬細(xì)胞起源器官的清除受體結(jié)合而被清除；②通過衰老的抗原特異性抗體被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除[13]。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的Kupffer細(xì)胞可在5 min內(nèi)快速清除RMPs[14]；心臟外科手術(shù)期間使用血液回收機(jī)也可清除RMPs[15]。

1.4 RMPs的檢測(cè) 目前檢測(cè)RMPs的技術(shù)較多，如流式細(xì)胞技術(shù)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、電子顯微鏡觀察、納米顆粒跟蹤分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜分析等。由于RMPs通常含有跨膜蛋白，如Band3、血型抗原和血型糖蛋白，因此大多數(shù)流式細(xì)胞儀能使用針對(duì)血型糖蛋白A、CD47或者其他血液類屬等特殊抗原的抗體進(jìn)行檢測(cè)。張寧潔等[16]研究顯示，使用“二次離心”方法和超濾離心管結(jié)合可明顯提高RMPs的獲得率。最近的一項(xiàng)研究證明，二醋酸羧基熒光素琥珀酰亞胺脂與血型糖蛋白A抗原結(jié)合可監(jiān)測(cè)和定量分析循環(huán)中的RMPs，相比單獨(dú)的血型糖蛋白A或者膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記檢測(cè)，可使檢測(cè)精確性提高4～7倍[17]。

2 RMPs在機(jī)體生理病理過程中的作用

2.1 參與細(xì)胞間信息傳遞 細(xì)胞間信息傳遞主要通過細(xì)胞間物質(zhì)的轉(zhuǎn)移完成。RMPs能介導(dǎo)細(xì)胞間生物活性材料的運(yùn)輸和交換，包括轉(zhuǎn)移肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)成分、miRNAs、mRNA和DNA[18]。研究表明，RMPs是控制瘧原蟲生命周期中階段轉(zhuǎn)換的一個(gè)重要組成部分，瘧原蟲感染時(shí)RMPs的釋放和調(diào)度對(duì)于患者的預(yù)后具有重要影響。嚴(yán)重瘧疾患者體內(nèi)高濃度的RMPs對(duì)于細(xì)胞間通訊是必不可少的，瘧原蟲可劫持RMPs系統(tǒng)以便進(jìn)行細(xì)胞間的交叉通訊。RMPs已經(jīng)被確定與瘧原蟲DNA轉(zhuǎn)錄和密度調(diào)控有關(guān)[19]。在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿患者中，細(xì)胞與細(xì)胞之間通過RMPs完成兩種糖基磷脂酞肌醇錨蛋白、CD55和CD59轉(zhuǎn)移。RMPs在紅細(xì)胞溶解時(shí)可將PS轉(zhuǎn)移到有核細(xì)胞的表面，并將其“標(biāo)記”為假陽性衰亡細(xì)胞[20]。由于儲(chǔ)血袋里含有很多RMPs，因此輸血可能潛在導(dǎo)致輸血者CD55和CD59水平升高[21]。

2.2 參與紅細(xì)胞老化清除 成熟紅細(xì)胞沒有線粒體和細(xì)胞核，其在活體內(nèi)老化的終點(diǎn)是衰亡，這是一種類似于有核細(xì)胞程序性死亡的過程。而在紅細(xì)胞成熟老化及衰亡過程中，其細(xì)胞膜會(huì)不斷形成RMPs。體內(nèi)的RMPs形成不僅使紅細(xì)胞膜及Hb隨著微泡化的發(fā)生而不斷丟失，還可自動(dòng)調(diào)節(jié)和清除細(xì)胞內(nèi)變性的Hb及其他失去功能的蛋白，使紅細(xì)胞不會(huì)過早被清除。早期隨著RMPs的形成及脫落，紅細(xì)胞體積減小、數(shù)量增加，后期老化程度高的紅細(xì)胞微泡化作用加強(qiáng)，形成的RMPs含有更多Hb，紅細(xì)胞本身Hb含量下降。不斷的微泡化使紅細(xì)胞的變形能力減弱，細(xì)胞膜彈性下降，這種改變是體內(nèi)紅細(xì)胞衰亡的主要因素。因此，紅細(xì)胞釋放RMPs受到精細(xì)調(diào)節(jié)，并與衰老紅細(xì)胞的清除有重要關(guān)系。

RMPs可通過調(diào)控紅細(xì)胞表面CD47表達(dá)而介導(dǎo)紅細(xì)胞清除。CD47是一種紅細(xì)胞膜表面蛋白，巨噬細(xì)胞可識(shí)別CD47并且不會(huì)被激活，當(dāng)紅細(xì)胞衰老或損傷使RMPs釋放增多，其細(xì)胞膜表面CD47表達(dá)減少，將會(huì)激活巨噬細(xì)胞的清除作用[22]。誘導(dǎo)RMPs形成的體外代謝和機(jī)械應(yīng)力可導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂不對(duì)稱性降低，使得PS外化，而外化的PS將作為網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞的信號(hào)，參與介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[23]。

2.3 參與紅細(xì)胞貯存損傷 體外貯存的紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列包括生物化學(xué)、代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面的損傷，稱為貯存損傷。研究顯示，體外貯存過程中影響微泡釋放的因素較多，包括貯存相關(guān)紅細(xì)胞蛋白的分解和氧化應(yīng)激，細(xì)胞新陳代謝(能量損耗)，生物力學(xué)性能及鈣、神經(jīng)酰胺、PS暴露水平等。Almizraq等[23]研究發(fā)現(xiàn)，濃縮紅細(xì)胞體外貯存前10天RMPs水平基本不變，第10～15天RMPs水平急速升高，然后一直緩慢升高，5～8周趨于穩(wěn)定；該研究同時(shí)觀察到隨著紅細(xì)胞體外貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，RMPs水平及紅細(xì)胞溶血率均逐漸升高，而ATP、Hb水平及紅細(xì)胞變形能力均顯著下降，紅細(xì)胞膜磷脂(包括磷脂酰乙醇胺、PS、磷脂酰膽堿)和總脂質(zhì)含量也逐漸降低。細(xì)胞內(nèi)ATP等能量缺乏可使細(xì)胞抗氧化防御能力降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞貯存損傷，而這些變化可能會(huì)引起輸血不良反應(yīng)。因此，明確體外RMPs形成的原因?qū)τ诋?dāng)前血液制品的貯存和使用是十分重要的。在小鼠輸血模型中，在貯存紅細(xì)胞中添加抗壞血酸能顯著減少RMPs形成[24]，說明添加抗壞血酸(或其他抗氧化劑)可能對(duì)于紅細(xì)胞的儲(chǔ)存以及減少輸血不良反應(yīng)具有重要意義。

2.4 參與凝血 RMPs表面PS外翻的暴露可促使凝血酶形成，為凝血反應(yīng)提供了一個(gè)適宜的表面[25]。斯科特綜合征是一種罕見的先天性出血性疾病，其原因是血小板和紅細(xì)胞囊泡形成障礙，不能使PS從膜的內(nèi)面外翻到膜表面而促進(jìn)凝血[25]。斯科特綜合征說明RMPs的形成能夠促進(jìn)凝血過程，其形成障礙可導(dǎo)致出血的發(fā)生。

Rubin等[26]研究表明，RMPs有XI因子依賴的促凝功能，可促進(jìn)凝血酶的生成而不依賴組織因子。Zecher等[27]也證實(shí)，RMPs能誘發(fā)補(bǔ)體活化，通過凝血酶依賴機(jī)制，而非依賴經(jīng)典途徑、凝集素途徑或旁路途徑參與凝血過程。一項(xiàng)對(duì)鐮刀形紅細(xì)胞貧血病的研究表明，RMPs通過增加患者體內(nèi)血漿D-二聚體水平而導(dǎo)致血液高凝狀態(tài)[28]。然而RMPs對(duì)于凝血的作用在臨床仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的問題。RMPs的促凝作用對(duì)于臨床手術(shù)止血具有重要意義，但部分學(xué)者認(rèn)為血液中過多的RMPs可增加血液高凝狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)，也可能會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生率的升高。Koshiar等[25]認(rèn)為，RMPs可以促進(jìn)蛋白C系統(tǒng)的抗凝反應(yīng)，并可能對(duì)維持凝血反應(yīng)和抗凝血作用之間的平衡具有重要作用。

2.5 參與免疫反應(yīng) 輸血可抑制輸血者的免疫功能，接受去白細(xì)胞的紅細(xì)胞輸血患者可發(fā)生明顯的輸血相關(guān)免疫抑制反應(yīng)。Schifferli等[29]研究證明，RMPs在輸血后免疫抑制的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。衰老紅細(xì)胞喪失的紅細(xì)胞膜補(bǔ)體受體1型分子(CR1)和CD55分子均積聚于RMPs，且RMPs能夠結(jié)合補(bǔ)體分子C1q，激活C3片段結(jié)合的補(bǔ)體經(jīng)典途徑。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RMPs能夠通過活化酵母多糖A和LPS而顯著抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)，并減少TNF-α和IL-8釋放，RMPs的這種抑制作用可持續(xù)至少24 h，表明RMPs可能參與免疫抑制過程[30]。

綜上所述，RMPs可參與細(xì)胞間信息傳遞、紅細(xì)胞老化清除、紅細(xì)胞貯存損傷、凝血及免疫反應(yīng)等生理病理過程。目前對(duì)RMPs的研究尚不深入，其生成過程及作用機(jī)制也并不完全清楚。深入研究RMPs有助于明確體內(nèi)紅細(xì)胞衰亡過程、體外貯存損傷過程以及血液制品使用過程中對(duì)人體的影響，對(duì)保障輸血安全具有重要意義。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81671919)；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(201440456)；上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金項(xiàng)目(PKJ2012-Y54)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科群建設(shè)項(xiàng)目(PWZxq2017-10)。

郭建榮(E-mail： jianrguo@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.035

R446.11

A

1002-266X(2017)40-0104-04

2016-11-29)