孫為增，林國(guó)雄，林海

(海南省人民醫(yī)院，海口570311)

沉默鈣連蛋白對(duì)人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、JNK信號(hào)通路的影響

孫為增，林國(guó)雄，林海

(海南省人民醫(yī)院，海口570311)

目的探討沉默鈣連蛋白(Calnexin)對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、JNK信號(hào)通路的影響。方法將腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞分為對(duì)照組、空載體組、實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組正常培養(yǎng)不轉(zhuǎn)染?？蛰d體組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染Calnexin shRNA。轉(zhuǎn)染24 h后全部更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)各組Calnexin mRNA表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，Western blotting法檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、需肌醇酶1(IRE1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)、磷酸化凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(p-ASK1)、c-Jun N末端激酶(JNK)及磷酸化c-Jun N末端激酶(p-JNK)蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果Calnexin mRNA相對(duì)表達(dá)量：實(shí)驗(yàn)組、空載體組、對(duì)照組分別為0.28±0.01、1.01±0.06、1.00±0.08；實(shí)驗(yàn)組低于空載體組和對(duì)照組(P<0.05)，但空載體組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。AI：實(shí)驗(yàn)組、空載體組、對(duì)照組分別為32.86±3.72、5.46±0.68、5.26±0.17；實(shí)驗(yàn)組高于空載體組和對(duì)照組(P<0.05)，但空載體組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量：實(shí)驗(yàn)組高于空載體組和對(duì)照組(P均<0.05)，但空載體組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。結(jié)論沉默Calnexin 可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活JNK細(xì)胞凋亡通路，進(jìn)而促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞凋亡。

腎母細(xì)胞瘤；鈣連蛋白；細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；JNK信號(hào)通路

腎母細(xì)胞瘤占我國(guó)小兒惡性腫瘤的17.8%左右，目前主要采用手術(shù)+放化療等綜合療法治療，但Ⅲ、Ⅳ期腎母細(xì)胞瘤治療效果及預(yù)后不佳[1，2]。在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)普遍存在[3]，且ERS可選擇性的保留對(duì)ERS有拮抗傾向的細(xì)胞，使存活下的腫瘤細(xì)胞向更惡性的方向進(jìn)展[4]。鈣連蛋白(Calnexin)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ⅰ型跨膜蛋白，具有輔助糖蛋白折疊裝配、控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白質(zhì)量監(jiān)控、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和緩解ERS等作用[2]。本課題組提出下調(diào)Calnexin基因表達(dá)可使腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞無(wú)法調(diào)節(jié)及降解錯(cuò)誤折疊蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的科學(xué)假說(shuō)。為驗(yàn)證這一假說(shuō)，2016年6～10月，我們用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞Calnexin mRNA表達(dá)，并觀察了SK-NEP-1細(xì)胞ERS情況及下游JNK通路蛋白表達(dá)情況的變化。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SK-NEP-1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，用含有10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每2至3天傳代1次。鈣連蛋白短發(fā)夾RNA(Calnexin shRNA)為本實(shí)驗(yàn)室自行制備。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、需肌醇酶1(IRE1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)、磷酸化凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(p-ASK1)、c-Jun N末端激酶(JNK)及磷酸化c-Jun N末端激酶(p-JNK)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Boster公司。

1.2 SK-NEP-1細(xì)胞分組及Calnexin shRNA轉(zhuǎn)染 將SK-NEP-1細(xì)胞懸濁液以5×104/孔的密度接種于24孔板，細(xì)胞融合80%～90%時(shí)將細(xì)胞分為對(duì)照組、空載體組、實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組正常培養(yǎng)不轉(zhuǎn)染?？蛰d體組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染Calnexin shRNA。每組6孔。轉(zhuǎn)染24 h后全部更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h[5]。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 Calnexin mRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。正向引物：5′-GAAGGGAAGTGGTTGCTGTG-3′，反向引物：5′-CGTCTTTCTTGGCTTTGGAT-3′。提取各組細(xì)胞全部RNA，反轉(zhuǎn)錄得到對(duì)應(yīng)的cDNA。在冰浴的無(wú)核酸酶的離心管中加入反應(yīng)混合物，加熱條件：70 ℃加熱5 min，冷卻2 min。離心后加入5×Buffer(4 μL)、RNasin(0.5 μL)、1 μL M-MLV，輕輕混勻。25 ℃溫浴10 min，42 ℃溫浴50 min，95 ℃加熱5 min，終止反應(yīng)。經(jīng)由PCR儀完成上述過(guò)程，可得20 μL cDNA，待PCR循環(huán)結(jié)束后，馬上升溫至95 ℃，維持10 min，再降至60 ℃，維持20 s；提升至72 ℃，維持30 s，最后降至4 ℃維持5 min，此過(guò)程循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算Calnexin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞凋亡情況 采用TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。收集各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)0.1%Trition X-100透化后，用PBS漂洗3次，每次漂洗5 min，再滴加3%H2O2200 μL，漂洗3次后，加入蛋白酶K工作液置于常溫下20 min；漂洗3次后加入TUNEL反應(yīng)液(TdT+熒光素標(biāo)記的dUTP)37 ℃恒溫箱中避光孵育60 min；PBS清洗3次后加入DAPI，再次應(yīng)用PBS漂洗3次，最后防熒光淬滅封片劑封片。隨機(jī)移動(dòng)組織切片，選取細(xì)胞分布較均勻的高倍視野計(jì)數(shù)1 000 個(gè)以上，在相鄰的10個(gè)視野下，藍(lán)色熒光為腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞核。凋亡指數(shù)(AI)=各視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.3 GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。于液氮條件下研碎細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)并定量檢測(cè)。于濃縮膠5%、分離膠10%條件下行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后恒流200 mA轉(zhuǎn)膜90min轉(zhuǎn)印至PVDF膜。P封閉1 h后孵育一抗。加入山羊抗大鼠多克隆HRP標(biāo)記二抗(1∶1 000)孵育2 h。經(jīng)ECL底物發(fā)光反應(yīng)后圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液[7]。各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 各組Calnexin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組、空載體組、對(duì)照組Calnexin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.28±0.01、1.01±0.06、1.00±0.08；實(shí)驗(yàn)組Calnexin mRNA相對(duì)表達(dá)量低于空載體組和對(duì)照組(P<0.05)，但空載體組和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 各組細(xì)胞AI比較 實(shí)驗(yàn)組、空載體組、對(duì)照組AI分別為32.86±3.72、5.46±0.68、5.26±0.17；實(shí)驗(yàn)組AI高于空載體組和對(duì)照組(P<0.05)，空載體組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3 各組GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空載體組和對(duì)照組(P均<0.05)，但空載體組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK和p-JNK相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較，*P<0.05。

3 討論

腎母細(xì)胞瘤是最早發(fā)現(xiàn)對(duì)化療藥物敏感的兒童惡性腫瘤，目前采用放療、化療及手術(shù)等綜合治療方案已將患兒生存率由30%提升至90%以上[8，9]，但放、化療對(duì)患兒產(chǎn)生的長(zhǎng)期影響尚無(wú)研究報(bào)告。尋找高效、靶向治療腎母細(xì)胞瘤的治療方法是目前研究熱點(diǎn)，更是亟待解決的問(wèn)題。ERS是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的指標(biāo)凋亡機(jī)制，現(xiàn)階段研究認(rèn)為ERS發(fā)生的主要原因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白功能異常，導(dǎo)致錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積[5]，短時(shí)間的ERS是細(xì)胞自我修復(fù)的一種方法，但長(zhǎng)期ERS發(fā)生即可引起細(xì)胞凋亡。

Calnexin/鈣網(wǎng)織蛋白(Calreticulin)循環(huán)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系的重要組成部分，對(duì)錯(cuò)誤折疊的糖蛋白重新折疊起關(guān)鍵作用，而難以糾正構(gòu)象的糖蛋白為避免在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度堆積造成危害，則在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶Ⅰ作用下從Calnexin/Calreticulin循環(huán)中釋放出來(lái)，與受體蛋白EDEM結(jié)合；后者通過(guò)Sec61p通道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在泛素-蛋白酶體系中將其降解，這一過(guò)程稱(chēng)為糖蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解[10]。研究證實(shí)，惡性腫瘤細(xì)胞已耐受缺氧所引發(fā)的ERS，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)ERS的耐受性，使腫瘤細(xì)胞更傾向于凋亡，可能成為治療腎母細(xì)胞瘤的新靶點(diǎn)[11，12]。JNK信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶家族中重要的通路之一，存在于多種生命活動(dòng)過(guò)程中且易受多種細(xì)胞外應(yīng)激因素激活并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有證據(jù)表明，JNK信號(hào)通路參與了過(guò)度ERS所引發(fā)的細(xì)胞凋亡[13，14]。因此，沉默Calnexin可能引發(fā)SK-NEP-1細(xì)胞加重ERS，打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耐受平衡，進(jìn)而激活JNK信號(hào)通路，介導(dǎo)SK-NEP-1細(xì)胞凋亡。

本研究用Calnexin shRNA沉默Calnexin基因表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Calnexin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，驗(yàn)證了沉默效果。用TUNEL法觀察各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡明顯增多，與本研究團(tuán)隊(duì)提出的假說(shuō)相符，也與Ryan的研究結(jié)果相似[15]。為探討沉默Calnexin誘導(dǎo)SK-NEP-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究進(jìn)一步采用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中ERS標(biāo)志物GRP78及JNK信號(hào)通路相關(guān)蛋白R(shí)E1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK、p-JNK表達(dá)，結(jié)果顯示，沉默Calnexin的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK表達(dá)升高，這說(shuō)明沉默Calnexin可使細(xì)胞內(nèi)ERS標(biāo)志物GRP78表達(dá)增高，并激活JNK信號(hào)通路的表達(dá)，打破腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞原本對(duì)ERS耐受的平衡，增加JNK信號(hào)通路的活化及磷酸化水平，誘導(dǎo)腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究團(tuán)隊(duì)提出的假說(shuō)。

綜上所述，本研究雖然證實(shí)沉默Calnexin可通過(guò) IRE1/TRAF2/ASK1/p-ASK1/JNK/ p-JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞凋亡。但ERS所引發(fā)的信號(hào)通路較多[16]，沉默Calnexin對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞其他凋亡通路的影響尚不得而知。下一步的研究將更深入的探討Calnexin和腎母細(xì)胞瘤的關(guān)系，為腎母細(xì)胞瘤的臨床治療提供新靶點(diǎn)和新思路。

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Effectsofsilencingcalnexinonapoptosis,endoplasmicreticulumstress,andJNKsignalingpathwayofhumannephroblastomacells

SUNWeizeng,LINGuoxiong,LINHai

(HainanProvincialPeople′sHospital,Haikou570311,China)

ObjectiveTo investigate the effects of silencing calnexin on the apoptosis, endoplasmic reticulum stress, and JNK signaling pathway of human nephroblastoma cells.MethodsThe nephroblastoma SK-NEP-1 cells were divided into the control group, empty vector group, and experimental group. The cells in the control group were not transfected. The cells in the empty vector group were transfected with the blank plasmid, and the experimental group with Calnexin shRNA. After 24-hour transfection, all were replaced with normal culture medium and then were cultured for 48 h. The expression of Calnexin mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The apoptotic index (AI) was detected by TUNEL method. Western blotting was used to detect the relative expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78), inositol-requiring enzyme 1 (IRE1), tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 (TRAF2), apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1), p-ASK1, c-Jun N-terminal kinase (JNK) and phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) protein.ResultsThe relative expression of calnexin mRNA was 0.28±0.01, 1.01±0.06, and 1.00±0.08 in the experimental group, empty vector group, and control group, respectively. The experimental group was lower than the empty vector group and the control group (P<0.05), but there was no significant difference between the empty vector group and the control group (P>0.05). AI in the experimental group, empty vector group, and control group were 32.86±3.72, 5.46±0.68, and 5.26±0.17; the experimental group was higher than the empty vector group and the control group (P<0.05), but there was no significant difference between the empty vector group and the control group (P>0.05). The relative expression levels of GRP78, IRE1, TRAF2, ASK1, p-ASK1, JNK and p-JNK were higher in the experimental group than those in the empty vector group and the control group (allP<0.05), but there was no significant difference between the empty vector group and the control group (P>0.05).ConclusionSilencing calnexin can lead to endoplasmic reticulum stress and activate JNK cell apoptosis pathway, and thus promote the apoptosis of nephroblastoma SK-NEP-1 cells.

nephroblastoma; calnexin; apoptosis; endoplasmic reticulum stress; JNK signaling pathway

海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20168283)。

孫為增(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：小兒外科常見(jiàn)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療。E-mail： HNsunweizeng@163.com

林海(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：腎母細(xì)胞瘤的治療。E-mail： linhai2317@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.006

R737.11

A

1002-266X(2017)40-0022-04

2016-11-01)