李莉，高勝利，2*，翟曉娟，郭任維，李樹峰

(1.山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院，山西 汾陽 032200；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200；3.中國醫(yī)學(xué) 科學(xué)院醫(yī)學(xué)信息研究所，北京 100020)

冠心病患者Hcy和SAH與外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化相關(guān)性研究〔1〕

李莉1，高勝利1，2*，翟曉娟1，郭任維1，李樹峰3

(1.山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院，山西 汾陽 032200；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200；3.中國醫(yī)學(xué) 科學(xué)院醫(yī)學(xué)信息研究所，北京 100020)

目的：探討冠心病患者血漿同型半胱氨酸(Hcy)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)與外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化水平的相關(guān)性。方法：選取山西省汾陽醫(yī)院心血管內(nèi)科冠心病患者70 例(觀察組)，另選取70 例健康人群為對照組，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿Hcy、SAH和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)水平。提取全血淋巴細(xì)胞DNA，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測淋巴細(xì)胞基因組甲基化水平。結(jié)果：與對照組比較，觀察組血漿Hcy含量、SAH含量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，觀察組血漿DNMTs含量、全基因組甲基化水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化與Hcy (r=-0.757，P<0.05)、SAH(r=-0.94，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，SAH與外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化相關(guān)性高于Hcy(Z=4.756，P<0.01)。DNMTs與Hcy(r=-0.537，P<0.05)、SAH(r=-0.672，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，SAH與DNMTs相關(guān)性高于Hcy(Z=7.745，P<0.01)。結(jié)論：冠心病患者外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化水平顯著降低，與Hcy和SAH呈負(fù)相關(guān)，且與SAH的相關(guān)性高于Hcy。

同型半胱氨酸；S-腺苷同型半胱氨酸；基因組甲基化

同型半胱氨酸(Hcy)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)都是蛋氨酸的代謝產(chǎn)物[1]，Hcy增高被認(rèn)為是冠心病(CAD)的高危因素之一[2]。然而大規(guī)模的使用維生素B和葉酸降低了血漿Hcy水平，卻未能改善血管損傷和減少動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。有學(xué)者提出Hcy并不是冠心病的直接致病原因，而是另外一個(gè)危險(xiǎn)因素SAH的標(biāo)志物，即Hcy的毒性來自于SAH的累積，但需要更多的證據(jù)來證實(shí)[5]。DNA甲基化是表觀遺傳的重要分子機(jī)制，基因組DNA甲基化水平改變是評價(jià)心血管疾病的指標(biāo)之一。研究顯示，外周血白細(xì)胞基因組甲基化水平下降與Hcy和SAH均呈負(fù)相關(guān)[6-8]。然而有關(guān)中國人群冠心病患者中Hcy和SAH與外周血白細(xì)胞基因組甲基化水平相關(guān)性的報(bào)道甚少，對此本文進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月—2016年6月山西省汾陽醫(yī)院心血管內(nèi)科冠心病患者70 例(觀察組)。冠心病診斷參照中國冠心病診療指南[9-11]，冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)其冠狀動(dòng)脈至少有一支狹窄度≥50%；排除糖尿病、感染性疾病、惡性腫瘤或嚴(yán)重肝腎功能不全者。對照組選擇某單位體檢排除冠心病的健康人群70 例。所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑

多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰)，UV755B分光光度計(jì)(蘇州萊頓)，Hcy和SAH酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(美國Arthus Biosystems)，人外周血淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶)，DNA提取試劑盒(大連博士德)，甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒和基因組DNA甲基化定量檢測試劑盒(美國Epigentek)。

1.3 臨床指標(biāo)檢測

測量兩組人群身高體重，計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)。連續(xù)3天同一時(shí)間測量血壓水平。Olympus2700生化分析儀測定血脂水平，包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白A1(APOA1)、載脂蛋白B(APOB)。

1.4 血漿Hcy、SAH和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶含量檢測

空腹靜脈采血5 mL放入EDTA抗凝管中，2 000～3 000r/min離心20min，分離出血漿，分裝并-20℃保存，采用酶聯(lián)免疫法測定以上指標(biāo)[12-13]。

1.5 全基因組甲基化分析

空腹靜脈采血5 mL放入EDTA抗凝管，采用密度法分離淋巴細(xì)胞，依據(jù)試劑盒說明書提取淋巴細(xì)胞DNA，采用Epigentek公司甲基化試劑盒檢測全基因組DNA甲基化水平[14]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組患者性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓、舒張壓、吸煙史等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血漿Hcy、SAH、DNMTs及外周血淋巴細(xì)胞全基因組甲基化水平比較

與對照組比較，觀察組血漿Hcy含量、SAH含量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，觀察組血漿DNMTs含量、全基因組甲基化水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組血漿Hcy、SAH、DNMTs及外周血淋巴細(xì)胞全基因組甲基化水平比較

2.3 相關(guān)性分析

對照組Hcy與SAH無相關(guān)性(r=0.236 5，P=0.235)；觀察組Hcy與SAH呈正相關(guān)(r=0.857 0，P<0.05)。觀察組Hcy與外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.757，P<0.05)，SAH與外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.94，P<0.05)，相關(guān)系數(shù)比較SAH與外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化水平的相關(guān)性要高于Hcy(Z=4.756，P<0.01)。觀察組Hcy與DNMTs呈負(fù)相關(guān)(r=-0.537，P<0.01)，SAH與DNMTs呈負(fù)相關(guān)(r=-0.672，P<0.01)，相關(guān)系數(shù)比較SAH與DNMTs的相關(guān)性高于Hcy(Z=7.745，P<0.01)(見表3)。

表3 兩組Hcy、SAH與DNMTs、外周血淋巴細(xì)胞甲基化水平相關(guān)性分析

3 討 論

Hcy增高被認(rèn)為是冠心病的獨(dú)立高危因素之一，對于這一觀點(diǎn)目前仍存在爭議。來自維生素干預(yù)腦卒中預(yù)防試驗(yàn)(VISP)、挪威維生素試驗(yàn)(NORVIT)、心臟結(jié)局預(yù)防評估試驗(yàn)2(HOPE-2)等研究提示，通過補(bǔ)充維生素B和葉酸降低了血漿Hcy水平，但對冠心病危險(xiǎn)沒有明顯影響[3-4]。在一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究中，在校正Hcy后，SAH與心臟事件風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，而校正SAH后，Hcy與心血管事件風(fēng)險(xiǎn)并無相關(guān)性[15]，因此有人提出Hcy的毒性來自于SAH的積累，Hcy可能是冠心病的標(biāo)志物而不是原因，對于冠心病的預(yù)測SAH比Hcy更為敏感[16]。SAH是Hcy的前體物質(zhì)，在SAH水解酶(SAHH)作用下轉(zhuǎn)變成Hcy，該反應(yīng)是可逆的，Hcy增高可使反應(yīng)向SAH合成的方向進(jìn)行導(dǎo)致其增高[17]。在本研究中，與對照組相比，觀察組血漿Hcy水平和血漿SAH水平均顯著增高，相關(guān)性分析提示Hcy與SAH呈正相關(guān)性。

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以SAM為甲基供體，將活化的甲基引入胞嘧啶的第五位碳原子上，在不改變DNA堿基序列的基礎(chǔ)上使DNA修飾發(fā)生變化從而調(diào)控基因的表達(dá)。多項(xiàng)研究證實(shí)，冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與基因組DNA甲基化改變有關(guān)，然而研究結(jié)果不盡相同。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，高蛋氨酸飼養(yǎng)載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠的外周血細(xì)胞基因組DNA甲基化水平降低，與Hcy呈負(fù)相關(guān)[6]。還有研究顯示，高蛋氨酸喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)活性和DNA基因組甲基化水平與其血漿SAH水平呈負(fù)相關(guān)[7]，提示基因組DNA甲基化水平與Hcy和SAH均有關(guān)。Castro等[8]對17 例心血管疾病患者(8 例腦卒中和9 例心肌梗死患者)研究發(fā)現(xiàn)，外周血白細(xì)胞基因組甲基化水平明顯下降，并且與Hcy和SAH均呈負(fù)相關(guān)。在新加坡華人中的研究表明，基因組DNA甲基化水平的升高與冠心病密切相關(guān)[18]。印度人群的冠心病患者與正常健康人相比，冠心病患者的總體DNA甲基化程度要明顯高于對照組，而且冠心病患者血清中的同型半胱氨酸水平明顯高于對照組[19]。

基因組甲基化水平與Hcy和SAH水平有關(guān)。SAM脫去甲基后轉(zhuǎn)化為SAH，SAH可結(jié)合到DNMTs的催化區(qū)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變、活性降低，繼而影響了DNA的甲基化水平。本研究觀察組基因組甲基化水平與Hcy和SAH呈負(fù)相關(guān)，且SAH與基因組甲基化水平的相關(guān)性高于Hcy；觀察組DNMTs降低，與Hcy和SAH呈負(fù)相關(guān)，且SAH與DNMT1的相關(guān)性高于Hcy，由此可見，在冠心病患者中，SAH與外周血淋巴細(xì)胞的基因組甲基化相關(guān)性強(qiáng)于Hcy，與累積的SAH直接抑制DNMTs有關(guān)，SAH是比Hcy更為敏感的指標(biāo)。

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2017-07-10

(本文編輯：王作利)

TherelationshipbetweenperipheralbloodlymphocytesglobalDNAmethylationandplasmaHcyandSAHinpatientswithcoronaryarterydisease

LI Li1，GAO Shengli1，2，ZAI Xiaojuan1，GUO Renwei1，LI Shufeng3

(1.Affiliated Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China；2.Fenyang College of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China；3.Chinese Academy of Medical Sciences in Institute of Medical Information，Beijing 100020，China)

Objective：To research the correlation between peripheral blood lymphocytes global DNA methylation and plasma homocysteine(Hcy) and S-adenosyl hom ocysteine(SAH) in patients with coronary artery disease.Methods：All 70 cases of patients with coronary heart disease were come form in Cardiovascular Medicine in Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，70 cases of control group were healthy people.Plasma Hcy，SAH and DNMTs levels was detectsd by enzyme-linked immunosorbent assay.Extracting whole blood lymphocyte DNA and Global DNA methylation was detectsd by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：Compared with control group，in coronary artery disease group，plasma Hcy levels was significantly increased of coronary heart disease (P<0.05)，the level of SAH was increased significantly (P<0.05)，the content of DNMTs was decreased significantly (P<0.05)，peripheral blood lymphocyte DNA methylation was significantly decreased (P<0.05).In coronary artery disease group，peripheral blood lymphocytes global DNA methylation and Hcy were negatively correlated(r=-0.757，P<0.05)，negatively correlated with SAH (r=-0.94，P<0.01).The correlation of SAH and peripheral blood lymphocytes global DNA methylation is higher than that of Hcy (Z=4.756，P<0.01).DNMTs and Hcy was negatively correlated (r=-0.537，P<0.05)，with SAH was negatively correlated(r=-0.672，P<0.01).The correlation of SAH and DNMTs is higher than that of Hcy (Z=7.745，P<0.01).Conclusion：Peripheral blood lymphocyte Global DNA methylation level was significantly decreased in patients with coronary heart disease，and negatively correlated with Hcy and SAH，The correlation of between SAH and Global DNA methylation is stronger than that of Hcy.

homocysteine；s-adenosylhomocysteine；global dna methylation

R541.4

A

1671-8631(2017)12-0899-05

〔1〕本課題為山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院校級(jí)基金(課題編號(hào)：1406)

*本文通訊作者：高勝利

李莉(1968— )，女，山西省汾陽市人，學(xué)士學(xué)位，主任醫(yī)師。研究方向：冠心病表觀遺傳機(jī)制與治療。