劉 驥，楊 帆，田萬帆，龍 虎，孫思雨，周玉珊，趙燕英，唐俊妮*

金黃色葡萄球菌M型腸毒素原核表達(dá)、純化、鑒定及溶液構(gòu)象分析

劉 驥，楊 帆，田萬帆，龍 虎，孫思雨，周玉珊，趙燕英，唐俊妮*

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

葡萄球菌腸毒素M是由金黃色葡萄球菌νSa基因島編碼的分泌型超抗原。本研究將截去N端信號肽的金黃色葡萄球菌M型腸毒素（staphylococcal enterotoxin M，SEM）蛋白編碼基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a（＋），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsem；隨后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli Rosetta（DE3）并探討融合蛋白最佳表達(dá)條件；利用Ni2＋-Sepharose 4 Fast Flow親合層析純化出His-ΔNspSEM融合蛋白；經(jīng)質(zhì)譜鑒定，純化的融合蛋白對SEM的氨基酸覆蓋率達(dá)96.3%；凝血酶切除6×His標(biāo)簽肽后，圓二色譜分析表明ΔNspSEM重組蛋白富含β-折疊（35%）和β-轉(zhuǎn)角（21%）以及較少α-螺旋（16%）等二級結(jié)構(gòu)；熒光發(fā)射譜揭示ΔNspSEM在278 nm和295 nm波長處激發(fā)時(shí)具有相同的Trp發(fā)射峰（341 nm）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分析表明ΔNspSEM重組蛋白表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明重組蛋白SEM表達(dá)成功，純化的ΔNspSEM重組蛋白溶液構(gòu)象緊密并具有接近天然狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，這為深入研究SEM蛋白的結(jié)構(gòu)與功能提供理論支持。

金黃色葡萄球菌M型腸毒素；原核表達(dá)；純化；質(zhì)譜；圓二色譜；熒光發(fā)射譜；熱穩(wěn)定性

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為一個(gè)重要的食源性病原菌，其抗生素抗性獲得[1-2]、生物被膜形成[3]和致熱性毒素超抗原的胞外分泌[4]是逃避藥物與機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的有效手段。其中，致熱性毒素超抗原是一類特殊的非糖基化、低分子質(zhì)量、在多肽鏈N-末端具有跨膜分泌型信號肽的細(xì)胞外毒素蛋白。當(dāng)其在信號肽引導(dǎo)分泌到胞外，其N-末端信號肽被切除，形成分子質(zhì)量范圍為19～30 kD的成熟肽段[5]，該家族的毒素具有過度活化免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致體液中大量產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子的異常免疫應(yīng)答，從而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征[6]。金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）和類腸毒素（staphylococcal-like enterotoxins，SEls）歸屬于上述的致熱性毒素超抗原家族。同時(shí)，SEs/SEls也是造成世界范圍內(nèi)葡萄球菌食物中毒的重要毒力因子[7-8]。

金黃色葡萄球菌M型腸毒素（staphylococcal enterotoxin M，SEM）歸屬于V型超抗原[9-11]，與其他各型腸毒素不同的是，M型超抗原具有一個(gè)附加的15 個(gè)氨基酸殘基形成的插入序列，該插入序列位于第3個(gè)α-螺旋和第8個(gè)β-折疊股之間，被命名為α3-β8環(huán)，這個(gè)環(huán)可能在與T淋巴細(xì)胞表面的Vβ-TCR相互作用時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。由于該型超抗原缺乏催吐活性所要求的胱氨酸環(huán)結(jié)構(gòu)，金黃色葡萄球菌超抗原國際命名委員會（International Nomenclature Committee for Staphylococcal Superantigens，INCSS）最初把SEM歸類于SEls中，記為SElM[13]。最近，Omoe等[14]通過獼猴喂飼實(shí)驗(yàn)證實(shí)SEM具有催吐活性，但相對于傳統(tǒng)的腸毒素活性弱，因此根據(jù)INCSS命名規(guī)則，建議將SElM稱為SEM更為恰當(dāng)。SEs具有顯著的熱穩(wěn)定性、蛋白酶降解穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性和干燥穩(wěn)定性等特點(diǎn)，這種超強(qiáng)的環(huán)境穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，使該家族蛋白中某些成員雖經(jīng)極端條件的食品加工處理步驟，仍保持一定的活性[14-15]。到目前為止，針對SEM的研究不多，主要體現(xiàn)在毒素功能[16-17]和快速檢測[18]上。特別是關(guān)于SEM高產(chǎn)原核表達(dá)體系建立、表達(dá)條件優(yōu)化、SEM溶液構(gòu)象及維持等相關(guān)研究報(bào)道較少。

鑒于SEs引起的食物中毒普遍性和高發(fā)性，為了進(jìn)一步理解新型腸毒素結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，探討SEs高穩(wěn)定性原因，本研究通過優(yōu)化SEM原核表達(dá)體系獲得足量融合蛋白，進(jìn)而利用圓二色譜和熒光光譜對SEM溶液構(gòu)象及維持進(jìn)行研究，旨在揭示SEM溶液構(gòu)象及其維持的分子基礎(chǔ)，為探索破壞SEM結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的方法和建立更加高效合理的食品消毒工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保存于本實(shí)驗(yàn)室臨床分離的金黃色葡萄球菌SA003；感受態(tài)大腸桿菌（E. coli）菌株DH5α、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）以及高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase） 天根生化科技（北京）有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（＋） 美國Novagen公司；卡那霉素、氯霉素、牛血清白蛋白組分V（bovine albumin V，BSA） 美國Sigma公司；鎳親和層析介質(zhì)（Ni2＋-NTA-Sepharose） 美國GE Healthcare公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ 寶生物工程（大連）公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5804R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；WD800B型微波爐 中國格蘭仕集團(tuán)；TSNENEN031445型PCR儀、伯樂Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C型核酸電泳儀北京六一儀器廠；JY92-IIN型超聲破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Model 400圓二色譜儀 美國Aviv公司。

1.3 方法

1.3.1 引物合成與設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中報(bào)道的S. aureus 04-02981的sem基因序列（GenBank accession No. CP001844.1）和S. aureus strain H4的selm基因序列（登錄號：KT853047.1），利用SignalP 4.1 Server在線服務(wù)器預(yù)測信號肽序列。在預(yù)測的信號肽剪切位點(diǎn)，利用Premier 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，克隆不含信號肽的sem基因序列。不含信號肽的sem基因5’端引物序列：5’-CGTACGCATATGGATGTCGGAGTTTTGAA TCTT-3’（下劃線示出NdeⅠ酶切位點(diǎn)），3’端引物序列為：5’-CCGCTCGAGTTAACTTTCGTCCTTATAAGATA TT-3’（下劃線示出XhoⅠ酶切位點(diǎn)，加粗斜體為插入的終止密碼子）。

1.3.2 ΔNspSEM蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的微波加熱法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，以提取的1 ng SA003菌株的基因組DNA為模板，利用1.3.1節(jié)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，Mg2＋（25 mmol/L）5 μL，5?-引物（20 μmol/L）2.5 μL，3?-引物（20 μmol/L）2.5 μL，金黃色葡萄球菌基因組DNA模板1 μL，Pfu DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 34 μL，反應(yīng)體系共計(jì)50 μL。PCR參數(shù)為：94 ℃60 s；66 ℃ 60 s；72 ℃ 150 s，38 輪循環(huán)；第1次循環(huán)前先經(jīng)95 ℃變性4 min，最后1次循環(huán)后于72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增所得片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測及PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與質(zhì)粒載體pMD18-T進(jìn)行T-A連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，同時(shí)將空質(zhì)粒pET-28a（＋）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。分別將插入ΔNspsem基因的pMD18-T質(zhì)粒與空載質(zhì)粒pET-28a（＋）用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切（注：ΔN表示N端缺失，sp是信號肽signal peptide的縮寫），將上述雙酶切獲得的基因片段用T4 DNA連接酶連接，使得目的基因定向克隆至表達(dá)載體。將插入ΔNspsem基因的質(zhì)粒命名為pET-28a（＋）-ΔNspsem，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α擴(kuò)增，將提取到的質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsem進(jìn)行NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定。同時(shí)將提取到的質(zhì)粒送成都擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化

將經(jīng)過測序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsem分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和Rosetta（DE3），在相應(yīng)的抗生素抗性平板上隨機(jī)挑取含有重組質(zhì)粒的單克隆，分別過夜培養(yǎng)后，按1∶50的比例擴(kuò)大至含相應(yīng)抗生素抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，然后加入適當(dāng)濃度誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）后，繼續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，離心收集菌體，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）檢測蛋白表達(dá)情況。選擇高表達(dá)菌株，分別進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)間梯度（37 ℃，0.5 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)4、8、16 h），誘導(dǎo)用IPTG濃度梯度（37 ℃，8 h，IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）和誘導(dǎo)溫度（8 h，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度分別為17、27、37 ℃）優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.3.4 His-ΔNspSEM蛋白分離純化及質(zhì)譜鑒定

根據(jù)1.3.3節(jié)確定的最優(yōu)表達(dá)菌株為出發(fā)菌種接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。次日將種子液轉(zhuǎn)接到500 mL LB中按照1.3.3節(jié)確定的最佳表達(dá)條件擴(kuò)大培養(yǎng)，監(jiān)測菌液A600nm至0.6～0.7時(shí)，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體，菌體經(jīng)PBS緩沖液洗滌后重懸浮于20 mL Buffer A緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）中，冰浴超聲破壁，離心收集上清液。將制備的His-ΔNspSEM蛋白粗提液上樣于事先用含Buffer A緩沖液平衡好鎳親合層析柱。先以Buffer A緩沖液和含50 mmol/L咪唑的Buffer A緩沖液除去大部分雜蛋白，再以含500 mmol/L咪唑的Buffer A洗脫目的蛋白，SDS-PAGE分析純度。將純化的His-ΔNspSEM進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色直徑3 mm以上，切下染色后的條帶，送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.5 凝血酶去除6×His標(biāo)簽肽及ΔNspSEM重組蛋白純化

將按1.3.4節(jié)中純化的His-ΔNspSEM融合蛋白用截留分子質(zhì)量10 kD、容量15 mL的millipore超濾管脫鹽至6 mmol/L Britton-Robinson緩沖液（pH 7.0）中，作為凝血酶的酶切底物，配制為1 IU/μL Thrombin儲液，按10 IU Thrombin/mg目標(biāo)蛋白的酶與底物比例，恒溫20 ℃分別進(jìn)行0、0.5、1、2 h酶切。按上述方案酶切后的樣品經(jīng)鎳親和層析柱吸附6×His標(biāo)簽肽，收集穿透液再次超濾濃縮至6 mmol/L pH 7.0 Britton-Robinson緩沖液，調(diào)節(jié)超濾后ΔNspSEM融合蛋白的280 nm波長處吸光度使之與超濾前樣品一致，SDS-PAGE驗(yàn)證酶切效率與純化所得ΔNspSEM重組蛋白純度。

1.3.6 圓二色譜測定

將1.3.5節(jié)純化的ΔNspSEM重組蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為0.089 5 mg/mL，在Model 400型圓二色譜儀上測定遠(yuǎn)紫外圓二色譜的掃描范圍為190～260 nm。激發(fā)光和發(fā)射光狹縫均設(shè)為1 nm，掃描速度設(shè)為中速，光譜校正設(shè)為開啟以消除光柵和檢測器響應(yīng)的波長依賴性。每個(gè)樣品掃描3 次取平均值，3 次掃描差別較大時(shí)再掃描一次，測試在25 ℃條件下進(jìn)行。采用DichroWeb在線分析軟件，選擇CDSSTR擬合方案，采用圓二色譜參考數(shù)據(jù)集SMP180，190～240 nm波長范圍內(nèi)對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算溶液中ΔNspSEM蛋白二級結(jié)構(gòu)含量[19]。

1.3.7 熒光光譜分析

將1.3.5節(jié)純化的ΔNspSEM重組蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為25 μg/mL，使用F-7000熒光光譜儀進(jìn)行測定，激發(fā)波長分別為278 nm和295 nm，發(fā)射譜波長掃描范圍為300～400 nm，掃描速率為1200 nm/min，所有掃描激發(fā)光和發(fā)射光狹縫均設(shè)為5 nm，PMT電壓均設(shè)為700 V，光譜校正均設(shè)為開啟以消除光柵和檢測器響應(yīng)的波長依賴性。每個(gè)樣品掃描3 次取平均值，3 次掃描差別較大時(shí)再掃描一次，測試在25 ℃進(jìn)行。

1.3.8 ΔNspSEM重組蛋白熱穩(wěn)定性分析

分別將去除6×His標(biāo)簽肽的ΔNspSEM重組蛋白、BSA和商品化高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）進(jìn)行100 ℃熱處理1 h，間隔15 min采樣，將離心所得上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（＋）-ΔNspsem的基因測序鑒定

將重組表達(dá)質(zhì)粒ΔNspsem基因測序，得到長度為651 bp的片段，利用NCBI BLAST多序列比對發(fā)現(xiàn)克隆到的ΔNspsem基因序列與來源于S. aureus strain H4的SElM蛋白基因序列（登錄號：KT853047.1）的第67～717位堿基序列具有100%的相似度。如圖1A所示，利用SignalP 4.1 Server在線服務(wù)器預(yù)測，被截去的第1～66位堿基為SEM編碼信號肽的堿基序列。圖1B表明，含組氨酸標(biāo)簽并截去N端信號肽的SEM融合蛋白（His-ΔNspSEM）表達(dá)載體被成功構(gòu)建。

圖1 SEM蛋白編碼基因和氨基酸序列的比對Fig. 1 Analysis of the full-length DNA and amino acids sequences of SEM

2.2 ΔNspsem基因在大腸桿菌中的表達(dá)條件優(yōu)化及純化

2.2.1 編碼ΔNspSEM蛋白的基因在不同大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化

圖2 編碼ΔNspSEM蛋白的基因在不同大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化Fig. 2 Influence of expression vector and induction conditions on expression efficiency of ΔNspsem gene

編碼ΔNspSEM蛋白的基因在不同大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化時(shí)，如圖2A所示，ΔNspSEM蛋白在BL21（DE3）菌株無明顯表達(dá)；圖2B表明在BL21（DE3）pLysS菌株中融合蛋白呈現(xiàn)較低的表達(dá)量；圖2C顯示ΔNspSEM蛋白在Rosetta（DE3）菌株中表達(dá)量普遍較高。因此，選取表達(dá)量最高的Rosetta（DE3）菌株為后續(xù)表達(dá)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的菌種。由圖2C可見，6 個(gè)重組子均能表達(dá)分子質(zhì)量約為30 kD的蛋白帶，與理論計(jì)算的His-ΔNspSEM蛋白分子質(zhì)量接近。

進(jìn)一步探討融合蛋白的最佳表達(dá)條件，如圖2D所示，誘導(dǎo)時(shí)間超過4 h融合蛋白表達(dá)量下降；圖2E顯示，融合蛋白表達(dá)量在IPTG濃度0.4～0.6 mmol/L時(shí)最高；圖2F表明，37 ℃時(shí)誘導(dǎo)融合蛋白產(chǎn)量最高。確定最優(yōu)表達(dá)條件為：4 h、IPTG 0.5 mmol/L、誘導(dǎo)溫度37 ℃。

2.2.2 最優(yōu)條件下His-ΔNspSEM蛋白的表達(dá)與純化及6×His標(biāo)簽肽的凝血酶切除

圖3 最優(yōu)條件下His-ΔNspSEM蛋白的可溶性表達(dá)驗(yàn)證與純化Fig. 3 Soluble expression and purification of His-ΔNspSEM protein under the optimal conditions

如圖3A所示，利用2.2.1節(jié)確定的最優(yōu)表達(dá)條件對Rosetta（DE3）宿主菌2號單克隆進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證，3 次平行實(shí)驗(yàn)均獲得了His-ΔNspSEM蛋白高產(chǎn)量表達(dá)。將1 mL菌液離心收集菌體經(jīng)過Buffer A緩沖液重懸后超聲破碎，裂解液離心所得上清液（圖3B泳道1）和沉淀（圖3B泳道2）分別上樣于SDS-PAGE，結(jié)果表明融合蛋白為可溶性表達(dá)。將擴(kuò)大培養(yǎng)所得融合蛋白超聲破碎粗提液進(jìn)行鎳親合層析純化，得純度大于98%的His-ΔNspSEM融合蛋白。經(jīng)軟件分析目的蛋白分子質(zhì)量約30 kD，與預(yù)期相符合（圖3B泳道8）。按照1.3.5節(jié)方案凝血酶切割6×His標(biāo)簽肽，如圖3C所示，對于1 mg融合蛋白2 h即可完全除去標(biāo)簽肽。進(jìn)一步，將酶切后的樣品經(jīng)鎳親和層析柱吸附6×His標(biāo)簽肽，收集穿透液再次超濾濃縮至6 mmol/L pH 7.0 Britton-Robinson緩沖液，調(diào)節(jié)超濾后ΔNspSEM融合蛋白的280 nm波長處吸光度使之與超濾前一致，SDS-PAGE表明（圖3C泳道5），除去His標(biāo)簽肽的電泳純ΔNspSEM重組蛋白純度大于95%，滿足后續(xù)光譜學(xué)測定要求。

2.3 純化的His-ΔNspSEM質(zhì)譜鑒定

圖4 His-ΔNspSEM重組蛋白的質(zhì)譜分析Fig. 4 Identification of purified His-ΔNspSEM recombinant fusion protein by mass spectrometry

純化的融合蛋白通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，圖4A表明，離子得分大于28的肽片段可信，圖4B說明通過與金葡菌基因組數(shù)據(jù)庫比對，鑒定的融合蛋白得分（大于75 000）與其他可能的蛋白得分相差10 000 倍以上，圖4C顯示，純化的蛋白與來自金黃色葡萄球菌的M型腸毒素（NCBI編號：D0K667）氨基酸覆蓋率在扣除了信號肽之后，高達(dá)96.3%，圖4D是隨機(jī)選擇的一段肽段的指紋圖譜。質(zhì)譜鑒定表明，目標(biāo)蛋白純化成功。

2.4 純化的ΔNspSEM重組蛋白圓二色譜與熒光發(fā)射譜測定

圖5 ΔNspSEM重組蛋白遠(yuǎn)紫外圓二色譜（A）與室溫?zé)晒獍l(fā)射譜（B）Fig. 5 Far-UV circular dichroism spectrum and room temperature fluorescence emission spectrum of ΔNspSEM fusion protein

圖5 A所示為ΔNspSEM重組蛋白的遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色譜，表現(xiàn)為192 nm強(qiáng)正峰和208 nm強(qiáng)負(fù)峰信號，215 nm與222 nm波長處肩峰使負(fù)峰展寬。采用DichroWeb在線分析軟件，計(jì)算出溶液中ΔNspSEM重組蛋白二級結(jié)構(gòu)含量為：α-螺旋16%、β-折疊35%、β-轉(zhuǎn)角21%和無規(guī)卷曲29%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與擬合數(shù)據(jù)之間的誤差在可接受范圍之內(nèi)。圖5B所示為ΔNspSEM重組蛋白的熒光發(fā)射譜，表現(xiàn)為278 nm激發(fā)和295 nm激發(fā)時(shí)，具有相同的341 nm色氨酸熒光發(fā)射峰。色氨酸的熒光發(fā)射峰位相對于親水環(huán)境中的354 nm發(fā)射峰藍(lán)移了13 nm，說明ΔNspSEM重組蛋白中色氨酸并未完全暴露于極性水環(huán)境中，重組蛋白具有折疊態(tài)的三級結(jié)構(gòu)。

2.5 純化的ΔNspSEM重組蛋白熱穩(wěn)定性分析

圖6 100 ℃熱處理對BSA（A）、SEM（B）和Pfu DNA Polymerase（C）穩(wěn)定性的影響Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the effect of incubation at 100 ℃ on stability of BSA, SEM and Pfu DNA polymerase

將去除His標(biāo)簽肽的ΔNspSEM重組蛋白100 ℃熱處理，間隔15 min采樣，將離心所得上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖6所示，15～45 min范圍內(nèi)，主要在上清液中檢測到ΔNspSEM重組蛋白，同時(shí)在沉淀中出現(xiàn)少量重組蛋白；經(jīng)過1 h熱處理后，沉淀中重組蛋白顯著增加，但上清液和沉淀中重組蛋白總和基本不變。上述結(jié)果表明，經(jīng)過100 ℃熱處理1 h后，ΔNspSEM重組蛋白并未發(fā)生顯著降解，而是產(chǎn)生了沉淀。對比溶解于相同緩沖液的BSA而言，經(jīng)過15 min熱處理，BSA形成大量可溶性高分子質(zhì)量聚合體（有些聚合體分子質(zhì)量高到沉積于加樣孔，而不能進(jìn)入4%濃縮膠內(nèi)）；30 min熱處理后，可溶性BSA及其聚合體顯著降解，同時(shí)在熱處理過程中基本不產(chǎn)生沉淀。與之形成鮮明對比的是，商品化高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）在100 ℃加熱1 h過程中，既不降解也不形成沉淀，具有很高熱穩(wěn)定性，這與該酶用于PCR循環(huán)過程中，需要94 ℃變性雙鏈DNA所需高熱穩(wěn)定性要求是一致的。

3 討 論

本研究首先采用經(jīng)典的BL21（DE3）原核表達(dá)系統(tǒng)[20-22]，對His-ΔNspSEM蛋白編碼的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDSPAGE表明目標(biāo)蛋白表達(dá)量極低，因此，改用能有效抑制外源基因本底水平表達(dá)的BL21（DE3）pLysS系統(tǒng)[23-25]，雖然實(shí)現(xiàn)了His-ΔNspSEM蛋白原核表達(dá)，但表達(dá)量較低。由此推測，BL21（DE3）原核表達(dá)系統(tǒng)對融合蛋白表達(dá)量低的原因是外源基因本底水平轉(zhuǎn)錄和表達(dá)降低了宿主系統(tǒng)的蛋白生產(chǎn)能力。進(jìn)一步利用http∶//www.doe-mbi.ucla.edu/～sumchan/caltor.html在線分析，發(fā)現(xiàn)ΔNspSEM蛋白編碼基因存在21個(gè)稀有密碼子，分別為編碼精氨酸的AGG（1 個(gè)）和AGA（4 個(gè)）、編碼甘氨酸的GGA（9 個(gè)）、編碼異亮氨酸的AUA（5 個(gè)）和編碼亮氨酸的CUA（2 個(gè)）。稀有密碼子的存在可能是造成表達(dá)量低的原因之一，為了提高融合蛋白表達(dá)量，將編碼His-ΔNspSEM蛋白的基因轉(zhuǎn)化到能夠高效表達(dá)稀有密碼子的Rosetta（DE3）菌株[26-27]中，由于該型菌株補(bǔ)充了上述5種稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量顯著提高。

通過圓二色譜分析揭示，ΔNspSEM重組蛋白溶液構(gòu)象β-折疊為35%。王小紅[28]研究表明，B型腸毒素具有高達(dá)40.4%的β-折疊，經(jīng)過121 ℃處理30 min后，仍具有39.9%的β-折疊含量，表明高β-折疊對B型腸毒素?zé)岱€(wěn)定性維持具有關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)M型腸毒素與B型高度同源，因此可以推測ΔNspSEM重組蛋白溶液構(gòu)象及維持也依賴于其高含量的β-折疊。

對ΔNspSEM重組蛋白的熒光發(fā)射譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)278 nm波長激發(fā)時(shí)未見顯著的303 nm酪氨酸熒光發(fā)射峰，同時(shí)呈現(xiàn)特征性的341 nm色氨酸熒光發(fā)射主峰。該峰位與295 nm單獨(dú)激發(fā)色氨酸殘基時(shí)，產(chǎn)生的熒光發(fā)射峰接近，說明重組蛋白分子中酪氨酸吸收的能量通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移給色氨酸[29]，形成了341 nm的色氨酸熒光發(fā)射峰。因此，根據(jù)蛋白質(zhì)分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移有效性和色氨酸熒光峰位相對于極性水環(huán)境（354 nm發(fā)射峰）的顯著藍(lán)移[30]，可以推測純化的重組蛋白處于構(gòu)象緊密的天然折疊狀態(tài)。

分別以BSA和Pfu DNA Polymerase為100 ℃熱處理負(fù)對照和正對照，ΔNspSEM重組蛋白表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性，這與天然SEM具有類似的性質(zhì)。

綜上，本研究成功構(gòu)建了高產(chǎn)融合蛋白His-ΔNspSEM的可溶性原核表達(dá)體系，經(jīng)該表達(dá)體系純化并切除標(biāo)簽肽之后的重組蛋白溶液構(gòu)象緊密，其溶液構(gòu)象的維持依賴于二級結(jié)構(gòu)中的高含量的β-折疊，這為進(jìn)一步研究SEM的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供了理論支持。

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Prokaryotic Expression, Purification, Identification and Solution Conformation of Staphylococcal Enterotoxin M

LIU Ji, YANG Fan, TIAN Wanfan, LONG Hu, SUN Siyu, ZHOU Yushan, ZHAO Yanying, TANG Junni*
(College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China)

Staphylococcal enterotoxin M (SEM) is a secretory superantigen encoded by the νSa genomic islands of Staphylococcus aureus. In this study, the sem gene from S. aureus without N-terminal signal peptide was subcloned into the prokaryotic expression vector pET-28a (+) to construct the recombinant plasmid pET-28a (+)-ΔNspsem and the recombinant expression plasmid was then transformed into E. coli Rosetta (DE3) competent cells. The positive clones, induced by IPTG, effectively expressed His-tag containing soluble ΔNspSEM fusion protein in E. coli Rosetta (DE3). The expression conditions including expression vector, time, IPTG concentration and temperature were optimized. Purified His-ΔNspSEM fusion protein was obtained by Ni2+-Sepharose affinity chromatography. Mass spectrometric analysis indicated that the amino acid sequence of the fusion protein was 96.3% similar to that of SEM. Circular dichroism revealed ΔNspSEM, whose 6 × His sequence was cleaved by thrombin, was rich in β-sheet (35%) and β-turn (21%) but low in α-helix (16%). The fluorescence emission spectrum of ΔNspSEM exhibited identical tryptophan emission peak (341 nm) with excitation at 278 and 295 nm.The time-dependent thermal stability of ΔNspSEM obtained at 100 ℃ by SDS-PAGE indicated that the recombinant protein had relatively high thermal stability. To conclude, our results showed that the ΔNspSEM recombinant protein was successfully expressed and that the purified protein exhibited a compact conformation similar to the natural one in solution,which can provide a basis for insight into the structure and function of SEM protein.

staphylococcal enterotoxin M; prokaryotic expression; purification; mass spectrometry; circular dichroism;fluorescence emission spectroscopy; thermal stability

10.7506/spkx1002-6630-201724007

TS201.1

A

1002-6630（2017）24-0040-07

2016-11-12

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371781）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2014JY0253）；

西南民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610656053）；四川省教育廳項(xiàng)目（15ZB0482）作者簡介：劉驥（1978—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称放c生物技術(shù)。E-mail：liuji965@aliyun.com

*通信作者：唐俊妮（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品微生物。E-mail：junneytang@aliyun.com

劉驥, 楊帆, 田萬帆, 等. 金黃色葡萄球菌M型腸毒素原核表達(dá)、純化、鑒定及溶液構(gòu)象分析[J]. 食品科學(xué), 2017,38(24): 40-46.

10.7506/spkx1002-6630-201724007. http∶//www.spkx.net.cn

LIU Ji, YANG Fan, TIAN Wanfan, et al. Prokaryotic expression, purification, identification and solution conformation of staphylococcal enterotoxin M[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 40-46. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724007. http∶//www.spkx.net.cn