田小菲 陳財(cái)良 高如陽 張建嶺 史滿金 張國(guó)徽

(河北北方學(xué)院法醫(yī)教研室，河北 張家口 075000)

pEGFP-N1-NUCB2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在SH-SY5Y細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

田小菲 陳財(cái)良 高如陽1張建嶺1史滿金 張國(guó)徽

(河北北方學(xué)院法醫(yī)教研室，河北 張家口 075000)

目的構(gòu)建pEGFP-N1-NUCB2重組子并比較Lipofectamine 2000和Xfect兩種轉(zhuǎn)染試劑在進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的轉(zhuǎn)染效率。方法構(gòu)建pEGFP-N1-NUCB2重組子，然后采用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，PEG-MgCl2進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化，最后將純化的質(zhì)粒DNA分別用兩種不同轉(zhuǎn)染試劑分別在HEK293細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果采用Lipofectamine 2000進(jìn)行pEGFP-N1-NUCB2重組子的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中可以轉(zhuǎn)染成功，但是在SH-SY5Y細(xì)胞中基本沒有熒光顯現(xiàn)；采用Xfect進(jìn)行pEGFP-N1-NUCB2重組子的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細(xì)胞中雖有熒光顯現(xiàn)，但是轉(zhuǎn)染效率非常低。結(jié)論Xfect的轉(zhuǎn)染效率高于Lipofectamine 2000，pEGFP-N1-NUCB2在SH-SY5Y細(xì)胞中采用脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染很難成功。

Lipofectamine 2000;Xfect；SH-SY5Y；細(xì)胞轉(zhuǎn)染

過表達(dá)研究是機(jī)體內(nèi)低表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分析的強(qiáng)有力手段。SH-SY5Y細(xì)胞系是帕金森病(PD)等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制研究中一種常見的體外模型，因其有多巴胺能神經(jīng)元的一些特性〔1〕，此細(xì)胞可分泌酪氨酸羥化酶(TH)、β-多巴胺羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；而且，此細(xì)胞株經(jīng)不同誘導(dǎo)作用后可以分化為帶有不同基因型和不同生物化學(xué)特征的成熟型神經(jīng)細(xì)胞。pEGFP-N1是常用的真核表達(dá)載體，其自身攜帶的GFP熒光標(biāo)記便于轉(zhuǎn)染結(jié)果的觀測(cè)和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。本研究構(gòu)建pEGFP-N1-NUCB2重組子，進(jìn)一步分析NUCB2過表達(dá)之后對(duì)百草枯引起的SH-SY5Y細(xì)胞死亡是否有抑制作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)購于中科院細(xì)胞中心(源自美國(guó)ATCC)；胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養(yǎng)基，Hyclone公司；Trizol試劑，Millpore公司；KpnⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶，連接酶，Takara；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，Invitrogen公司；Xfect轉(zhuǎn)染試劑，Takara公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞，天根公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)懸浮，以5×106個(gè)/ml密度接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃，5%CO2，濕化條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%左右時(shí)，常規(guī)胰酶消化傳代。

1.3pEGFP-N1-NUCB2重組子的構(gòu)建 NUCB2克隆引物的設(shè)計(jì)：上游引物5'-GAAGATCTTTTATTTACCTGCCTGAACATGAGGTGGA-3'，下游引物5'-GGGGTACCCAAATGTGTGGCTCAAACTTCAATTCTCC-3'，收取SH-SY5Y細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行NUCB2基因PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物和pEGFP-N1載體相同條件下采樣KpnⅠ和BglⅡ進(jìn)行酶切，純化后進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物在TOP10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取和純化，測(cè)序驗(yàn)證連接產(chǎn)物的序列。

1.4轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞種于35 mm培養(yǎng)皿中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，此步驟中用的培養(yǎng)基為DMEM/F12含10%FBS，不含抗生素。24 h內(nèi)做轉(zhuǎn)染處理，細(xì)胞換液，換雙無DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔加入4 μg質(zhì)粒DNA，8 μl轉(zhuǎn)染試劑，培養(yǎng)箱中孵育4～6 h。轉(zhuǎn)染試劑處理4～6 h之后，細(xì)胞換DMEM/F12含10%FBS，不含抗生素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育48 h。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果，并采集圖片。

2 結(jié) 果

pEGFP-N1-NUCB2重組子構(gòu)建成功之后用酶切和測(cè)序兩種方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果均提示連接成功。首先用Lipofectamine 2000在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行重組子和空載體的轉(zhuǎn)染效率比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pEGFP-N1空載體在HEK293細(xì)胞中采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染效率很高，但是pEGFP-N1-NUCB2重組子的轉(zhuǎn)染效率明顯降低，再將pEGFP-N1-NUCB2重組子選用Lipofectamine 2000相同條件下在SH-SY5Y細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示在SH-SY5Y細(xì)胞中空載體的轉(zhuǎn)染效率非常低，重組子的轉(zhuǎn)染基本沒有成功，見圖1，此結(jié)果說明，用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，無論是HEK293細(xì)胞，還是SH-SY5Y細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染，重組子的轉(zhuǎn)染效率均較空載體低。進(jìn)一步采用Takara公司研發(fā)的Xfect轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行SH-SY5Y細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，重組子的轉(zhuǎn)染效率亦過低，但是明顯高于Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染效率，見圖2。

圖1 采用Lipofectamine 2000在HEK293、SH-SY5Y細(xì)胞中轉(zhuǎn)染(×400)

圖2 Xfect在SH-SY5Y中轉(zhuǎn)染(×400)

3 討 論

NUCB2可參與腫瘤壞死因子(TNF)-腫瘤壞死因子受體(TNFR1)系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程〔2〕，胞外TNFR1與NUCB2-Arts1(調(diào)節(jié)TNFR脫落的氨基肽酶)結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而影響其與TNF-α的結(jié)合，從而影響TNFα-TNFR1系統(tǒng)介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡過程的發(fā)生〔3〕。又有報(bào)道，細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的caspase能對(duì)NUCB2進(jìn)行裂解〔4〕。本研究顯示NUCB2的表達(dá)量降低〔5〕，可引起SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，這與上述NUCB2的作用機(jī)制吻合。因此本研究小組構(gòu)建了pEGFP-N1-NUCB2重組子，以期觀察NUCB2過表達(dá)之后的是否抑制了SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用脂質(zhì)體方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染在SH-SY5Y細(xì)胞中很難成功，雖然Xfect的轉(zhuǎn)染效果要優(yōu)于Lipofectamine 2000，但是這兩種試劑的轉(zhuǎn)染結(jié)果都很難進(jìn)行后續(xù)的過表達(dá)研究分析。雖然有報(bào)道，在SH-SY5Y細(xì)胞中pEGFP-N1載體所構(gòu)建的重組子進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)可以達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的轉(zhuǎn)染效率〔6〕，但是本研究數(shù)據(jù)提示，如果需要進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的過表達(dá)研究，應(yīng)該進(jìn)行除脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染外的其他轉(zhuǎn)染方法的嘗試。

1Chade AR,Kasten M,Tanner CM.Nongenetic causes of Parkinson's disease〔J〕.J Neural Transm Suppl,2006;(70):147-51.

2Roy DN,Mandal S,Sen G,etal.14-Deoxyandrographolide desensitizes hepatocytes to tumour necrosis factor-alpha-induced apoptosis through calcium-dependent tumour necrosis factor receptor superfamily member 1A release via the NO/cGMP pathway〔J〕.Br J Pharmacol,2010;160(7):1823-43.

3Aebischer J,Sturny R,Andrieu D,etal.Necdin protects embryonic motoneurons from programmed cell death〔J〕.PLoS One,2011;6(9):e23764.

4Islam A,Adamik B,Hawari FI,etal.Extracellular TNFR1 release requires the calcium-dependent formation of a nucleobindin 2-ARTS-1 complex〔J〕.J Biol Chem,2006;281(10):6860-73.

5田小菲，張 曉，張經(jīng)一，等.百草枯誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中核連蛋白2基因的表達(dá)變化〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2017；37(13)：3158-60.

6Yu XL,Gao DW.Overexpression of cytoglobin gene inhibits hypoxic injury to SH-SY5Y neuroblastoma cells〔J〕.Neural Regen Res,2013;8(23):2198-203.

〔2016-11-10修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

R39

A

1005-9202(2017)22-5545-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.025

河北省衛(wèi)計(jì)委基金項(xiàng)目(20170179)；河北北方學(xué)院創(chuàng)新人才培育基金項(xiàng)目(CXRC1323)

1 河北北方學(xué)院2012級(jí)法醫(yī)學(xué)本科1班

張國(guó)徽(1962-),男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事法醫(yī)學(xué)研究。

田小菲(1983-),女,講師,主要從事法醫(yī)學(xué)研究。