鄧士兵 夏 豪 周忠泉

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

姜黃素通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路對高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

鄧士兵 夏 豪 周忠泉

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

目的探討姜黃素對高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞生物學(xué)特性影響。方法以心肌細(xì)胞HCM為研究對象，分別用高糖和低糖細(xì)胞生長液培養(yǎng)心肌細(xì)胞，同時在細(xì)胞生長液中加入姜黃素。MTT檢測作用24 h、48 h、72 h的細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞儀檢測48 h的心肌細(xì)胞凋亡情況。DCFH-DA探針檢測心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果高糖組心肌細(xì)胞增殖與對照組相比明顯受到抑制(Plt;0.01)。實(shí)驗(yàn)組中心肌細(xì)胞增殖情況明顯高于高糖組(Plt;0.01)。高糖組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組(Plt;0.01)。高糖組心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯低于對照組(Plt;0.01)；高糖組心肌細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平明顯高于對照組(Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平明顯低于高糖組(Plt;0.01)。高糖組心肌細(xì)胞中熒光強(qiáng)度明顯高于對照組(Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中熒光強(qiáng)度明顯低于高糖組(Plt;0.01)。對照組、高糖組和實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中JAK2、STAT3表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。高糖組心肌細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平顯著低于對照組(Plt;0.01)。實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)。結(jié)論高糖對心肌細(xì)胞增殖具有抑制作用，對細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。姜黃素可以通過作用于JAK2/STAT3信號通路改善高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞損傷。

心肌細(xì)胞；姜黃素；增殖；活性氧

糖尿病性心肌病變是一種發(fā)生于糖尿病患者的特殊的心肌性疾病，主要表現(xiàn)為心室舒張功能異常〔1〕。心肌細(xì)胞在糖尿病性心肌病變中發(fā)揮重要作用〔2〕。糖尿病大鼠模型中，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象〔3〕。心肌細(xì)胞的凋亡與心肌肥厚、心力衰竭、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病有關(guān)〔4〕。姜黃素(Curcumin)提取自姜科植物，可以降低小鼠心肌纖維化的程度，對心臟具有一定的保護(hù)作用。姜黃素除了具有保護(hù)心臟大血管的作用外，對心肌細(xì)胞損傷也具有一定的保護(hù)作用〔5〕。姜黃素可以通過調(diào)控相關(guān)的蛋白激酶活性作用于心肌細(xì)胞〔6〕。本研究探討姜黃素對心肌細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為治療糖尿病心肌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人心肌細(xì)胞(HCM)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.1.2主要儀器及試劑 姜黃素購自成都瑞芬思生物科技有限公司；胰蛋白酶、青鏈霉素、DMEM-F12、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Simga；p-JAK2單克隆抗體、JAK2單克隆抗體、p-STAT3單克隆抗體、STAT3單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國Cell Signaling；CO2培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀均購自美國Thermo。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 保存于液氮管中的心肌細(xì)胞HCM放在37℃的孵育器中融化，加入含有胎牛血清濃度為10%的DMEM-F12細(xì)胞生長液，充分混合后，轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min離心10 min后，棄掉上清液，用細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞，種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件是37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。觀察細(xì)胞濃度為90%時，倒掉細(xì)胞生長液，加入0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，離心，用細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2噻唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞分為三組，分別為對照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組。對照組中心肌細(xì)胞培養(yǎng)液用正常的含有D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的細(xì)胞生長液，高糖組和實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞用含有D-葡萄糖濃度為30 mmol/L的細(xì)胞生長液。實(shí)驗(yàn)組中加入姜黃素使其終濃度為0.5 μg/ml。同時設(shè)置空白組，空白組不加入細(xì)胞，加入等量的細(xì)胞生長液。將各組細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每毫升細(xì)胞生長液中含有細(xì)胞個數(shù)為1×105個。培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，在細(xì)胞中加入MTT溶液20 μl。放在37℃孵育反應(yīng)4 h。倒掉上清液，加入100 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，酶標(biāo)儀檢測每孔中的吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對照組-空白組)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取培養(yǎng)48 h的各組心肌細(xì)胞，加入0.125%胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，在細(xì)胞中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮細(xì)胞，離心后，棄上清液。加入適量的PBS使細(xì)胞濃度為1×105個/ml?；旌暇鶆蚝螅? ml細(xì)胞懸浮液，收集細(xì)胞，加入PI和Annexin V各5 μl，充分混合，放在室溫環(huán)境下孵育反應(yīng)15 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4DCFH-DA探針檢測活性氧水平 取培養(yǎng)48 h的心肌細(xì)胞，經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。吸除細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長液，在每孔中加入1 ml的DCFH-DA(10 μmol/L)，放置于37℃孵育反應(yīng)30 min后，期間每5 min震蕩混勻1次。在細(xì)胞中加入不含有胎牛血清的細(xì)胞生長液洗滌細(xì)胞兩次，放置于顯微鏡下觀察后，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.2.5Western印跡檢測p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Bcl-2、Bax表達(dá)水平 處于對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞，棄掉細(xì)胞生長液，在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，放置于冰上孵育裂解50 min，轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液至離心管中，放置于4℃，16 000 r/min離心15 min。吸取蛋白上清，按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。提取的蛋白經(jīng)變性后，加入到上樣孔中，每孔加入變性蛋白樣品50 μl。SDS-PAGE電泳初始電壓為80 V，終末電壓為120 V。電泳結(jié)束后，取出蛋白凝膠，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜，4℃轉(zhuǎn)膜過夜。聚偏氟乙烯(PVDF)膜經(jīng)封閉液封閉后，加入一抗孵育反應(yīng)后，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗反應(yīng)后，滴加顯色劑，在暗室中曝光，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果 高糖組心肌細(xì)胞增殖與對照組相比明顯受到抑制(Plt;0.01)，并且高糖對心肌細(xì)胞具有一定的毒性作用。實(shí)驗(yàn)組中加入了姜黃素，心肌細(xì)胞增殖明顯高于高糖組(Plt;0.01)。見表1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 高糖組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組(Plt;0.01)。Western印跡結(jié)果顯示，高糖組心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯低于對照組(Plt;0.01)；高糖組心肌細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平明顯高于對照組(Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平明顯低于高糖組(Plt;0.01)。見表2。

表1 各組細(xì)胞OD值

與對照組比較：1)Plt;0.01；與高糖組比較：2)Plt;0.01；下表同

表2 細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax表達(dá)水平

2.3DCFH-DA探針檢測活性氧水平結(jié)果 高糖組心肌細(xì)胞中熒光強(qiáng)度(19.64±1.58)明顯高于對照組(10.02±1.05，Plt;0.01)；實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中熒光強(qiáng)度(14.68±1.23)明顯低于高糖組(Plt;0.01)。

2.4Western印跡法檢測p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)結(jié)果 對照組、高糖組和實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中JAK2、STAT3表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化；高糖組心肌細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平顯著低于對照組(Plt;0.01)，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平明顯高于高糖組(Plt;0.01)。見表3。

表3 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3表達(dá)水平

3 討 論

姜黃素作為一種植物色素，具有安全無毒的優(yōu)點(diǎn)，臨床上廣泛用于腫瘤的治療。姜黃素對癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有抑制作用〔7〕。姜黃素促進(jìn)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，具有治療阿爾茲海默氏病的作用〔8〕。有研究表明，姜黃素可以有效改善果糖攝入過多引發(fā)的腎臟損害，對心肌缺血損傷具有明顯的治療作用〔9〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞增殖明顯受到抑制，并且高糖環(huán)境對細(xì)胞造成了一定的毒性作用。在細(xì)胞中加入姜黃素后，高糖環(huán)境對心肌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯減弱。

細(xì)胞凋亡是一種受多種基因共同調(diào)控的細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡異常與疾病的發(fā)展具有密切關(guān)系。Bcl-2蛋白家族是目前研究最多的凋亡相關(guān)蛋白。根據(jù)細(xì)胞凋亡過程中的作用，可以將Bcl-2蛋白家族分為兩種，一種是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，一種是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白〔10〕。Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮抑制作用，而Bax在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促進(jìn)作用〔11〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡增多，而加入姜黃素后的心肌細(xì)胞凋亡程度有所減弱；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下Bcl-2蛋白表達(dá)下降，而Bax蛋白表達(dá)升高。加入姜黃素后的心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)增多，Bax蛋白表達(dá)減弱。說明姜黃素抑制高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞凋亡是通過作用于Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的活性氧增多是糖尿病患者機(jī)體損傷的重要組成部分。高糖環(huán)境下，抗氧化酶活性受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化環(huán)境平衡失調(diào)。檢測活性氧水平的高低可以間接反映心肌細(xì)胞的損害程度〔12〕?；钚匝跛皆礁?，說明心肌細(xì)胞損害程度越大。本研究高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞中的活性氧水平升高，加入姜黃素后的心肌細(xì)胞中活性氧水平出現(xiàn)明顯下降。提示高糖環(huán)境對心肌細(xì)胞具有一定程度的氧化損傷，而姜黃素可以有效減緩這一損傷。

酪氨酸蛋白激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK2/STAT3)參與細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)〔13〕。JAK蛋白家族廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中，由JAK1、JAK2、JAK3和TYR2組成〔14〕。STAT3是STAT蛋白家族中的一員。JAK2/STAT3參與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、胚胎發(fā)育、組織器官形成和細(xì)胞凋亡、細(xì)胞損傷等一系列生命活動。JAK2/STAT3參與腫瘤、腎臟疾病、肝炎、心血管疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平有所下降，而姜黃素可以有效抑制高糖環(huán)境造成的這種變化。說明高糖環(huán)境下，JAK2/STAT3信號通路受到抑制，姜黃素可以激活JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用。

綜上所述，高糖環(huán)境對心肌細(xì)胞增殖有抑制作用，對心肌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。姜黃素可以通過作用于JAK2/STAT3信號通路緩解高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞增殖抑制、凋亡增多，對心肌細(xì)胞損傷具有一定的改善作用。

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〔2017-06-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

R542.2

A

1005-9202(2017)22-5490-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.003

國家自然科學(xué)基金(No.81270184)；國家留學(xué)回國人員科技活動項(xiàng)目(No.國人廳〔2006〕164號)

夏 豪(1966-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科疾病研究。

鄧士兵(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科、冠脈介入和心力衰竭研究。