孔祥輝，楊國力，高 洋，陳喜君，王 輝，馬銀鵬，陳 丹，陳 鶴，陳靜宇

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江眾生生物工程有限公司，黑龍江哈爾濱 150028；4.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150076）

響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵活性成分分析

孔祥輝1，2，楊國力3，高 洋4，*陳喜君3，王 輝3，馬銀鵬1，陳 丹3，陳 鶴1，陳靜宇1

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江眾生生物工程有限公司，黑龍江哈爾濱 150028；4.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150076）

以靈芝液體發(fā)酵菌絲量和胞外多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定靈芝菌液體發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基配方，分析了菌絲體和發(fā)酵液中的活性成分。結(jié)果表明，靈芝液體發(fā)酵最優(yōu)配方為黃豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L，菌絲體干質(zhì)量最高達(dá)1.94 g/100 mL；發(fā)酵液中的胞外多糖質(zhì)量濃度為431 mg/100 mL；菌絲體胞內(nèi)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)15.37%，總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.36%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.93%，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.91%。

靈芝；菌絲體；活性成分；胞內(nèi)多糖；胞外多糖

靈芝（Ganoderma lucidum） 又稱神芝、仙草、瑞草，是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，自古以來就是我國珍貴的藥食兩用菌，具有抗癌、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、保肝、排毒、抑制組胺釋放等功效[1]，市場(chǎng)需求量與日俱增。靈芝活性成分主要為靈芝多糖、三萜類、靈芝多肽等，但成分含量會(huì)因所用菌種、菌種產(chǎn)地、栽培方法、提取工藝、制劑方法不同而不同[2]。傳統(tǒng)靈芝藥用方式是以子實(shí)體或孢子入藥，子實(shí)體纖維化、木質(zhì)化程度高，苦味濃，而靈芝孢子細(xì)胞壁厚，不易被人體利用，二者不宜直接作為食品、藥品原料[3]。另外，野生靈芝資源有限，人工栽培靈芝子實(shí)體周期較長、成本高，限制了靈芝的廣泛應(yīng)用。目前，利用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)真菌具有容積大、產(chǎn)量高、周期短和無污染等特點(diǎn)，已成為醫(yī)藥和保健品、化妝品等原料的重要生產(chǎn)方式[4]。通過液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體，產(chǎn)品苦味小，營養(yǎng)價(jià)值及有效成分不低于子實(shí)體，甚至有些指標(biāo)高于子實(shí)體，因而具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景[4-6]。試驗(yàn)采用搖瓶發(fā)酵方法，以靈芝發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量為指標(biāo)篩選最優(yōu)培養(yǎng)基，測(cè)定菌絲體胞內(nèi)多糖、萜類、蛋白質(zhì)和多酚含量，為靈芝菌絲體及發(fā)酵液的深層次開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

靈芝菌株：赤靈芝，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備和試劑

UV757CRT型紫外可見光分光光度計(jì)，上海精科集團(tuán)產(chǎn)品；TGL20M-II型離心機(jī)，西安莫吉娜儀器制造有限公司產(chǎn)品；RE-53AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；KDN-08C型凱氏定氮消化儀，杭州麥哲儀器廠產(chǎn)品；DP-ZDDN-II型凱氏定氮蒸餾裝置，北京亞歐德鵬科技有限公司產(chǎn)品；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、葡萄糖、香草醛、冰醋酸、氯仿、甲醇、異丙醇、硼酸、甲基紅、高氯酸、硫酸銅、硫酸鉀、重蒸酚、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉為分析純；可溶性淀粉、白砂糖均為化學(xué)純；濃硫酸為優(yōu)級(jí)純；酵母膏、蛋白胨、α-淀粉酶、VB1為生物試劑；鄰苯二甲酸氫鉀為基準(zhǔn)試劑；溴甲酚綠、酚酞為指示劑；齊墩果酸為分析標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝菌種活化、擴(kuò)大培養(yǎng)[7]、菌絲體收集及干質(zhì)量測(cè)定方法

（1）菌種活化培養(yǎng)基：cPDA。

（2） 液體培養(yǎng)基配方。土豆汁添加量20%，麥麩皮添加量5%，可溶性淀粉添加量2%，硫酸鎂添加量0.05%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，酵母膏添加量0.2%。

（3）接種。無菌操作臺(tái)，用移液槍取2.5 mL靈芝液體菌種接種到裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于28℃，120 r/min條件下培養(yǎng)8 d[8]。4層紗布過濾發(fā)酵液，菌絲體蒸餾水洗滌，于80℃下烘干至恒質(zhì)量，稱量[9]。

1.2.2 碳源對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

根據(jù)靈芝生理特性，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，選擇玉米粉、可溶性淀粉、土豆、葡萄糖、白砂糖作為碳源，在基準(zhǔn)培養(yǎng)基（黃豆粉添加量1.5%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L）基礎(chǔ)上，分別研究玉米粉添加量（2%，3%，4%）、土豆添加量（10%，20%，30%）、可溶性淀粉添加量（2%，3%，4%）、葡萄糖添加量（2%，3%，4%）和白砂糖添加量（2%，3%，4%） 對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響。

1.2.3 氮源對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

根據(jù)靈芝生理特性，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，選擇黃豆粉、麥麩皮、酵母膏、蛋白胨、硫酸銨作為氮源，在基準(zhǔn)培養(yǎng)基（玉米粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L）基礎(chǔ)上，分別研究黃豆粉添加量（1.50%，1.75%，2.00%）、麥麩皮添加量（2%，5%，8%）、酵母膏添加量（0.1%，0.3%，0.5%）、蛋白胨添加量（0.1%，0.3%，0.5%） 和硫酸銨添加量（1%，3%，5%） 對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響。

1.2.4 無機(jī)鹽添加量對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

以基準(zhǔn)培養(yǎng)基（3%玉米粉，1.5%黃豆粉，0.05%硫酸鎂，50 mg/L VB1）研究添加0.05%～0.30%的磷酸二氫鉀對(duì)菌絲體生長量和發(fā)酵液胞外多糖的影響。

1.2.5 靈芝菌絲體最優(yōu)配方確定

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)/%

由表1可知，29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)為分析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中分析因點(diǎn)取值在X1，X2，X3，X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，2，4，13，16，23為零點(diǎn)試驗(yàn)，重復(fù)5次，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。按照29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)配方分別做培養(yǎng)基，每組3個(gè)平行，依次滅菌、冷卻、接種，于28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)8 d。

1.2.6 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[10]。

（1） 菌絲體胞內(nèi)多糖提取、測(cè)定。將80℃下烘干的靈芝菌絲體1.0 g，加30倍水，于90℃下浸提1.5 h，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心20 min，取上清液1，沉淀加30倍水再次浸提1.5 h，離心取上清液2，將沉淀烘干；上清液1和上清液2合并，加入2 mg α-淀粉酶60℃酶解1 h，加水定容至100 mL，精密吸取10 mL，加入40 mL無水乙醇混勻，4℃醇沉12 h，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，沉淀用80%乙醇潤洗3次，60℃烘干得多糖粗樣品，用50 mL蒸餾水溶解，離心，取上清液按照苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量[10]。

（2）胞外多糖分離、測(cè)定。過濾后所得發(fā)酵液中加入2 mg α-淀粉酶60℃酶解1 h，測(cè)定多糖含量。

1.2.7 萜類含量測(cè)定

（1）齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，以甲醇定容至50 mL。依次吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于9支具塞磨口試管中，水浴加熱揮去溶劑，加入0.3 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，密封。于70℃下水浴25 min，取出立即冰水冷卻，加入冰醋酸10 mL，搖勻，于550 nm處測(cè)定吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)，以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）靈芝菌絲體總?cè)坪康臏y(cè)定。靈芝菌絲體干品2.0 g，加入30 mL氯仿回流提取2 h，過濾后殘?jiān)^續(xù)回流提取，重復(fù)3次，合并濾液并定容至100 mL。精密移取1.0 mL于具塞磨口試管中，水浴加熱揮去溶劑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜含量[10]。

1.2.8 總氮測(cè)定

凱氏定氮法[11]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.9 多酚類成分測(cè)定

（1）樣品總多酚提取。干靈芝菌絲體1.0 g磨碎加入80 mL沸水，沸水浴浸提30 min，過濾、洗滌濾渣，將濾液合并、冷卻，加蒸餾水定容至100 mL。

（2）多酚含量測(cè)定。吸取1 mL樣品提取液加入4 mL蒸餾水和5 mL酒石酸亞鐵溶液，用pH值7.5磷酸鹽緩沖液稀釋至25 mL，混勻。以蒸餾水作空白對(duì)照，測(cè)定540 nm波長處吸光度，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

碳源種類對(duì)菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量的影響見圖1。

圖1 碳源種類對(duì)菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量的影響

碳源種類對(duì)菌絲體生長以及胞外多糖的影響有一定差異。由圖1可知，葡萄糖為菌絲體生長最佳碳源，含量為4%時(shí)菌絲體干質(zhì)量產(chǎn)量最多；可溶性淀粉為胞外多糖產(chǎn)量的最佳碳源，含量為4%時(shí)胞外多糖產(chǎn)量最多，但可能醇沉?xí)r含剩余淀粉；葡萄糖為碳源胞外多糖產(chǎn)量偏少，原因是菌絲體生長過多，發(fā)酵液過少。

2.2 氮源對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

氮源種類對(duì)菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量的影響見圖2。

氮源種類對(duì)菌絲體生長和胞外多糖的影響有一定差異。由圖2可知，黃豆粉對(duì)菌絲體生長影響最大；黃豆粉和麥麩皮對(duì)胞外多糖的影響差異不大，硫酸銨對(duì)胞外多糖的影響出現(xiàn)異常的原因是菌絲體長得極少，未消耗的玉米粉被醇沉所致（經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證），確定黃豆粉為最佳氮源，其含量為2%時(shí)菌絲體干質(zhì)量最多，1.5%時(shí)胞外多糖最多，原因可能是黃豆粉為2%時(shí)菌絲體量比1.5%時(shí)多，發(fā)酵液少導(dǎo)致胞外多糖量少。

2.3 無機(jī)鹽添加量對(duì)靈芝菌絲體生長量和胞外多糖含量的影響

添加一定濃度的無機(jī)鹽能夠促進(jìn)菌絲生長。液態(tài)搖床發(fā)酵中，磷酸二氫鉀不同添加量的菌絲體生長和胞外多糖產(chǎn)量不同。

無機(jī)鹽添加量對(duì)靈芝菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量的影響見圖3。

圖2 氮源種類對(duì)菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量的影響

圖3 無機(jī)鹽添加量對(duì)靈芝菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖含量的影響

由圖3可知，隨著磷酸二氫鉀添加量增多，菌絲體生長量和胞外多糖產(chǎn)量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，確定磷酸二氫鉀添加量最適范圍為0.1%～0.2%。

2.4 響應(yīng)面圖結(jié)果分析

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取黃豆粉、葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀，采用四因素三水平響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理見表2，菌絲體干質(zhì)量數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果見表3，胞外多糖數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果見表4。

各因素經(jīng)過回歸擬合，得到回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

表3 菌絲體干質(zhì)量數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果

表4 胞外多糖數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果

由表2可知，菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖回歸模型均具有顯著性（p＜0.05），失擬性具有不顯著性（p＞0.05），說明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，因素X1，X3，X22，X32對(duì)菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖有極其顯著性影響，因此，試驗(yàn)因素對(duì)菌絲體干質(zhì)量和胞外多糖影響不是簡單線性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)其也有很大影響。

葡萄糖和可溶性淀粉添加量對(duì)菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面見圖4，磷酸二氫鉀和可溶性淀粉添加量對(duì)菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面見圖5，葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對(duì)菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面見圖6，葡萄糖和黃豆粉添加量對(duì)胞外多糖響應(yīng)面見圖7，葡萄糖和可溶性淀粉添加量對(duì)胞外多糖響應(yīng)面見圖8，葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對(duì)胞外多糖影響響應(yīng)面見圖9。

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，得到靈芝菌絲體生長和胞外多糖產(chǎn)量最優(yōu)培養(yǎng)基配方為黃豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L。

2.5 胞內(nèi)多糖、萜類、總氮和多酚含量測(cè)定結(jié)果

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.683 5X-0.013 8，R2=0.997。測(cè)得靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖含量為15.37%，比文獻(xiàn)報(bào)道（10.13%）[13]高接近50%；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.768 8X-0.025 3，R2=0.995。測(cè)得靈芝菌絲體萜類含量為1.36%，是文獻(xiàn)報(bào)道（0.33%）[13]的4倍；總氮含量為22.93%；多酚含量為1.91%，目前未見對(duì)靈芝菌絲體多酚含量測(cè)定的報(bào)道。

3 結(jié)論

（1）通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了靈芝培養(yǎng)基，確定靈芝菌絲體生長和胞外多糖產(chǎn)量的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為黃豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.1%，硫酸鎂添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L；菌絲體干質(zhì)量達(dá)1.94 g/100 mL，胞外多糖質(zhì)量濃度為431 mg/100 mL；最優(yōu)培養(yǎng)基經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)得到的菌絲體干重和胞外多糖產(chǎn)量與響應(yīng)面回歸方程得出的結(jié)果基本一致。

（2）最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的菌絲體中活性成分胞內(nèi)多糖和萜類含量很高，胞內(nèi)多糖15.37%，總?cè)?.36%，蛋白質(zhì)22.93%，多酚1.91%。

圖4 葡萄糖和可溶性淀粉添加量對(duì)菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面

圖5 磷酸二氫鉀和可溶性淀粉添加量對(duì)菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面

圖6 葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對(duì)菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面

圖8 葡萄糖和可溶性淀粉添加量對(duì)胞外多糖響應(yīng)面

圖9 葡萄糖和磷酸二氫鉀添加量對(duì)胞外多糖影響響應(yīng)面

圖7 葡萄糖和黃豆粉添加量對(duì)胞外多糖響應(yīng)面

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Optimization of Fermentation Medium by Response Surface Methodology and Active Component Analysis of Ganoderma lucidum

KONG Xianghui1，2，YANG Guoli3，GAO Yang4，*CHEN Xijun3，WANG Hui3，MA Yinpeng1，CHEN Dan3，CHEN He1，CHEN Jingyu1
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150001，China；3.Heilongjiang Johnsun Biological Engineering Co.，Ltd.，Harbin，Heilongjiang 150028，China；4.Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

The optimal culture medium formula of Ganoderma lucidum was studied in this paper based on dry weight of mycelium and extracellular polysaccharide content，and the active ingredients of mycelium and fermentation broth were also analyzed.The results showed that the optimal culture medium formula of Ganoderma lucidum contains 1.63%soybean powder，2.33%glucose， 3%soluble starch， 0.1%KH2PO4， 0.05%magnesium sulfate， 50 mg/L VB1.Under this formula， the mycelium had 15.37%intracellular polysaccharide， 1.36%terpene content， 22.93%protein content， 1.91%multi phenol content；and the fermentation broth contains 431 mg/100 mL extracellular polysaccharide.

Ganoderma lucidum；mycelium；intracellular polysaccharide；extracellular polysaccharide；active components

S567.31

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.010

1671-9646（2017） 12a-0034-05

2017-08-18

哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2016RAXYJ046）。

孔祥輝（1971— ），女，博士，研究員，研究方向?yàn)槭乘幱镁罴庸ぜ夹g(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)。

*通訊作者：陳喜君（1969— ），男，博士，研究員，研究方向?yàn)榫锼幯邪l(fā)。