朱峰 張鵬 宋建榮 呂新文 周小龍 蔡珂 張超 何蓓 梁媛

(寶雞市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 寶雞 721008)

·論著·

長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中生物功能的研究

朱峰 張鵬*宋建榮 呂新文 周小龍 蔡珂 張超 何蓓 梁媛

(寶雞市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 寶雞 721008)

目的探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA 母系印記基因3(MEG3)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法檢測(cè)116例新鮮神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及癌周正常組織標(biāo)本中長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3的表達(dá)；MEG3 過(guò)表達(dá)后，分別采用四氮唑藍(lán)鹽化合物(MTS)法、流式細(xì)胞儀和Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響。結(jié)果MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著低于正常組織(4.85±0.56vs9.18±0.45;t=1.67,P=0.0012<0.05)；過(guò)表達(dá)MEG3后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(62.0%±3.8%vs84.0%±4.6%;t=1.54,P=0.0145<0.05)；過(guò)表達(dá)MEG3后，細(xì)胞凋亡能力明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(19.4%±3.2%vs5.5%±1.2%;t=2.35,P=0.0013<0.05)；過(guò)表達(dá)MEG3后，U87細(xì)胞遷移能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05)。結(jié)論MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是低表達(dá)的，具有抑制細(xì)胞U87增殖和遷移，促進(jìn)凋亡的作用，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA; 母系印記基因3; 神經(jīng)膠質(zhì)瘤; U87細(xì)胞; 生物學(xué)功能

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新型的轉(zhuǎn)錄物，長(zhǎng)度一般超過(guò)200 nt，其不具有編碼蛋白質(zhì)的功能但能夠通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA 剪切、降解和翻譯等生理過(guò)程發(fā)揮作用[1]。LncRNA也逐漸被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)的生物分子，可以作為腫瘤新的診斷靶標(biāo)[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系印記基因3-MEG3(maternally expressed gene 3)位于染色體14q32上，與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)。許多研究報(bào)道MEG3在如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、膽囊癌、結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌等多種腫瘤中存在異常表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展以及侵襲、遷移相關(guān)[3]。但MEG3 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)情況以及生物學(xué)功能還是未知的，因此，本文旨在研究MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其在U87細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

材料與方法

一、標(biāo)本收集

收集從2013年9月至2015年9月經(jīng)我院確診的116例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及癌旁周正常組織作為對(duì)照。所有標(biāo)本取完后立即保存在液氮中備用。來(lái)源于不同年齡段的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者年齡28～64歲，平均(49.7±4.6)歲；根據(jù)WHO分級(jí)，Ⅰ級(jí)纖維性星形細(xì)胞瘤25例，Ⅱ級(jí)彌漫性星形細(xì)胞瘤21例，Ⅲ級(jí)間變星形細(xì)胞瘤38例，Ⅳ級(jí)惡性膠質(zhì)瘤32例。所有患者手術(shù)前均未接受化療或放療。所有患者都簽署了知情同意書。

二、試劑和耗材

RNA提取試劑Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Houston, TX, USA)，Prime-Script逆轉(zhuǎn)錄-PCR 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)試劑盒(NCodeTMSYBR?Green miRNA quantitative real-time PCR)以及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；Premix EX Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司，ABl7300熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR儀購(gòu)自ABI公司。U87細(xì)胞系購(gòu)自上海中科院生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；培養(yǎng)基，MTTMTS檢測(cè)試劑購(gòu)自Thermofisher公司。

三、RNA 提取、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

組織先用Qiagen公司的組織破碎儀進(jìn)行破碎后提取癌組織和正常組織的總mRNA。總mRNA提取按照Trizol?RNA 提取試劑操作說(shuō)明進(jìn)行，Nanodrop測(cè)定總mRNA的含量和濃度，所有RNA測(cè)量吸光度(A)值，保證RNA的完整性(A260/A280>2.0)。總mRNA按照Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成MEG3 以及內(nèi)參甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)的cDNA。用SYBR Green試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)體系：1 μL cDNA (500 ng/20 μL)，0.6 μL primer (10 pmol/L)，9 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，無(wú)RNase水8.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min 預(yù)熱，95 ℃ 15 s變性，55 ℃ 30 s退火，68 ℃ 30 s延伸，40個(gè)循環(huán)。引物序列，MEG3：正向引物5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3'，反向引物5'-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGG GGCT-3'；GAPDH：正向引物5'-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，反向引物5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。

四、細(xì)胞培養(yǎng)

U87細(xì)胞用高糖改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)(含10% 胎牛血清和1%雙抗)培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2Thermofisher恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況每2～3 d進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用Lipofectine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3。

五、MTS 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為3000個(gè)/mL，每孔100 μL 接種于96孔板中，放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入20 μL MTS，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、流式細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞凋亡

按照BD公司細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒上的操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用不含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, EDTA)的胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，1000 r/min 離心 5 min，棄上清，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS) 洗滌 1 次，加入200 μL結(jié)合緩沖液，再加入異硫氰酸熒光素和碘化丙碇各5 μL輕輕混勻，避光室溫孵育15 min，尼龍莫過(guò)濾到流式管中后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

七、Transwell檢測(cè)U87細(xì)胞遷移

取轉(zhuǎn)染后48 h的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，胰酶消化處理后，用無(wú)血清的培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，再用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)/mL，將200 μL各組細(xì)胞懸液移入transwell小室內(nèi)，每組3個(gè)重復(fù)，再將Transwell小室植入24孔板內(nèi)，然后在Transwell小室下層孔中加入600 μL含有10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育36 h，取出小室，用干凈棉簽擦去上室面細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，置于0.1% 結(jié)晶紫染色液中20 min，高倍顯微鏡下隨機(jī)選擇 5個(gè)視野計(jì)算每個(gè)視野平均穿膜細(xì)胞數(shù)。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯著性低表達(dá)

我們對(duì)MEG3在116例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR定量分析，結(jié)果如圖1所示。與正常組織相比，MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯著性低表達(dá)(4.85±0.56vs9.18±0.45;P=0.0012)。

圖1 MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和癌旁正常組織中的差異表達(dá)
Fig 1 The expression level of MEG3 in glioma
aP<0.05,vscontrol group.

圖2 LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響
Fig 2 The effect of overexpression of LncRNA MEG3 on U87 cell
aP<0.05,vscontrol group.

二、LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖

為進(jìn)一步研究MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中對(duì)增殖的影響，我們通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)MEG3的U87細(xì)胞和正常U87細(xì)胞進(jìn)行MTS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MEG3過(guò)表達(dá)后顯著降低細(xì)胞增殖(84.0%±4.6%vs62.0%±3.8%;t=1.54,P=0.0145<0.05)，而且隨著時(shí)間增加，抑制能力顯著增強(qiáng)。如圖2 所示。

三、LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡

為研究MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中對(duì)凋亡的影響，我們通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)MEG3的U87細(xì)胞和正常U87細(xì)胞進(jìn)行過(guò)流式凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MEG3過(guò)表達(dá)后細(xì)胞凋亡為19.4%±3.2%，而對(duì)照組為5.5%±1.2%，兩組之間差異顯著(t=2.35,P=0.0013<0.05)，表明MEG3具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。如圖3所示。

圖3 LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響
Fig 3 The effect of overexpression of LncRNA MEG3 on U87 cell apoptosis
A:The flow cytometry apoptosis of control group; B:The flow cytometry apoptosis of MEG3 overexpression group; C:The statistical graph of apoptosis.
aP<0.05,vscontrol group.

四、LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87遷移

為研究MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中對(duì)遷移的影響，我們通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)MEG3的U87細(xì)胞和正常U87細(xì)胞進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MEG3過(guò)表達(dá)后細(xì)胞相對(duì)與正常對(duì)照組的遷移率為55.6%±5.8%，兩組之間差異顯著(55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05)，從而表明MEG3具有抑制細(xì)胞遷移的作用。如圖4所示。

圖4 LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞遷移的影響
Fig 4 The effect of overexpression of LncRNA MEG3 on U87 cell migration
aP<0.05,vscontrol group.

討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦瘤，占顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率首位[4]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)根據(jù)病理組織惡性程度將原發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤分為四個(gè)等級(jí)，Ⅰ～Ⅱ級(jí)是低等級(jí)膠質(zhì)瘤，Ⅲ～Ⅳ級(jí)是高等級(jí)膠質(zhì)瘤[5]。高等級(jí)膠質(zhì)瘤1年總體生存率為40%，5年生存率不足10%，而且在中國(guó)近幾年發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)，因此迫切需要新的治療方法和新型腫瘤標(biāo)記物用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷以及治療[6]。

隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)錄和編碼蛋白功能的RNA僅占基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的2%，而其余98%的RNA不具備蛋白編碼功能[7]。這些非編碼RNA中長(zhǎng)鏈非編碼LncRNA長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸以上，不具有編碼功能。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA表達(dá)水平在不同發(fā)育階段存在差異，并且具有組織特異性；相當(dāng)一部分LncRNA表達(dá)失調(diào)與人類惡性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)，可作為腫瘤的生物標(biāo)記物和預(yù)后因子[2,8]。

最近的研究已經(jīng)表明通過(guò)LncRNA表達(dá)分析譜的篩選發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中LncRNA的表達(dá)發(fā)生顯著性改變[9]。LncRNA MALAT1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)；而且MALAT1表達(dá)下調(diào)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成、周期阻滯以及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)[10]。LncRNA GAS5、HOTAIR、H19等在膠質(zhì)瘤中可通過(guò)調(diào)控miRNA影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。但是還沒(méi)有研究報(bào)道MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和生物學(xué)功能。

母系印記基因MEG3(maternally expressed gene 3)屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA，作為第一個(gè)被證明具有抑癌基因功能的LncRNA，其抑癌基因的功能非常復(fù)雜而且在不同類型腫瘤中參與不同的信號(hào)通路，比如MEG3可通過(guò)p53 激活影響非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌的生長(zhǎng)和凋亡，而且MEG3低表達(dá)患者預(yù)后均不良[12]；在膽囊癌和前列腺癌中，MEG3可以通過(guò)ERK/MAPK通路的激活抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡[13]；在子宮頸癌中，MEG3可調(diào)控miR-21影響子宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。同時(shí)也有研究報(bào)道了MEG3在不同腫瘤中的臨床意義，比如在腎細(xì)胞癌中MEG3高表達(dá)與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、短生存時(shí)間緊密相關(guān)[13]；血液中的MEG3也可作為非小細(xì)胞肺癌診斷的新型生物標(biāo)記物；MEG3在腫瘤組織中的表達(dá)也與胰腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌的臨床進(jìn)展、不利預(yù)后相關(guān)[2]。但MEG3在子神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的臨床作用和意義，現(xiàn)在還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

在本研究中，我們首先研究了MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)了MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果分析表明，MEG3在癌組織中低表達(dá)，和癌旁正常組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.85±0.56vs9.18±0.45;P=0.0012<0.05)。預(yù)示MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮非常重要的作用。

進(jìn)一步研究MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)行為，通過(guò)對(duì)U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)MEG3，然后檢測(cè)MEG3在增殖，凋亡和遷移中的作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MEG3過(guò)表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(62.0%±3.8%vs84.0%±4.6%;t=1.54,P=0.0145<0.05)；過(guò)表達(dá)MEG3后，細(xì)胞凋亡能力明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(19.4%±3.2%vs5.5%±1.2%;t=2.35,P=0.0013<0.05)；過(guò)表達(dá)MEG3后，U87細(xì)胞遷移能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05)。

但本研究并未進(jìn)一步對(duì)MEG3表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，同時(shí)MEG3在膠質(zhì)瘤診斷中價(jià)值以及生存預(yù)后分析還需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明LncRNA MEG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是低表達(dá)的，且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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ExpressionandbiologicalfunctionofLncRNAMEG3inglioma

ZHUFeng,ZHANGPeng,SONGJianrong,LVXinwen,ZHOUXiaolong,CAIKe,ZHANGChao,HEBei,LIANGYuan

1DepartmentofNeurosurgery,CentralHospitalofBaoji,Baoji721008, China

ObjectiveThe expression and biological functions of LncRNA maternally expressed gene 3 (MEG3) in glioma were investigated.MethodsReal-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect lncRNA MEG3 expression of 116 cases of glioma and adjacent normal brain tissues. And MTS [3-(4, 5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium, inner salt] assay, flow cytometry and Transwell assay were further used to analyze the proliferation, apoptosis, and migration of MEG3 overexpression.ResultsLncRNA MEG3 expression was significantly decreased in the glioma compared with the normal tissues (4.85±0.56vs9.18±0.45;t=1.67,P=0.0012<0.05); overexpression of MEG3 inhibited the cell proliferation (62.0%±3.8%vs84.0%±4.6%;t=1.54,P=0.0145<0.05), promoted the cell apoptosis (19.4%±3.2%vs5.5%±1.2%;t=2.35,P=0.0013<0.05) and inhibited the cell migration (55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05) in U87 human glioma cell line.ConclusionLncRNA MEG3 is lowly expressed and indicates the inhibition of proliferation and migration and promotion of apoptosis in glioma and implicates the potential application of MEG3 in glioma therapy.

LncRNA; MEG3; Glioma; U87 cell; Biological function

1671-2897(2017)16-422-05

R 739

A

朱峰，主治醫(yī)師，E-mail:zhufeng198102@163.com

*通訊作者： 張鵬，主任醫(yī)師，E-mail:longniao20000@sina.com.cn

2016-11-11；

2017-02-25)