李亞寧 張麗紅 殷艷艷張 晨 劉 剛 李鳳祥

(1.南開大學濱海學院環(huán)境科學與工程系，天津 300270；2.南開大學化學學院，天津 300071；3.天津市環(huán)境監(jiān)測中心，天津 300191；4.南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300071)

典型磺胺類抗生素對油菜葉片葉綠素、可溶性蛋白及抗氧化酶的影響*

李亞寧1,2張麗紅3殷艷艷1#張 晨1劉 剛1李鳳祥4

(1.南開大學濱海學院環(huán)境科學與工程系，天津 300270；2.南開大學化學學院，天津 300071；3.天津市環(huán)境監(jiān)測中心，天津 300191；4.南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300071)

通過盆栽實驗研究了典型磺胺類抗生素磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SM1)和磺胺噻唑(ST)對油菜葉片內(nèi)抗氧化酶(POD)活性、葉綠素(CHL)含量和可溶性蛋白(SP)含量的影響。結(jié)果表明：在低濃度染毒處理(15.0 mg/kg)和高濃度染毒處理(45.0 mg/kg)下， SM1、ST對油菜葉片中的CHL含量均有顯著抑制作用(P<0.05)，SMZ對油菜葉片中的CHL含量有極顯著抑制作用(P<0.01)。3種磺胺類抗生素對油菜葉片SP含量的抑制作用隨著染毒濃度的增加逐漸增強，其中SMZ對SP含量的抑制作用最大。兩種濃度的染毒處理下，3種磺胺類抗生素對油菜葉片的POD活性均產(chǎn)生極顯著誘導(P<0.01)作用，并且SMZ對POD活性的誘導作用最為顯著。綜上，SMZ、SM1和ST均顯著影響了油菜體內(nèi)的生化過程，并且3種抗生素中SMZ的毒性效應(yīng)最強。

磺胺類抗生素 油菜 葉綠素 可溶性蛋白 抗氧化酶

磺胺類抗生素是以氨苯磺胺為母體合成的一類化學藥物，一直被廣泛用于人體和禽畜的疾病預防與治療[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，磺胺類抗生素在世界各國的抗生素銷售及使用量中均居于首位[3]。西班牙的一項研究表明，污水處理廠污泥中磺胺甲基嘧啶(SM1)的質(zhì)量濃度高達139 mg/kg，磺胺噻唑(ST)的質(zhì)量濃度高達77 mg/kg[4]32。同時，磺胺類抗生素在動物糞肥中也廣泛存在，據(jù)H?LZEL等[5]報道，液態(tài)豬糞中14種磺胺類抗生素的質(zhì)量濃度達0.05～38.40 mg/kg。含有磺胺類抗生素的動物糞肥及污泥堆肥施入土壤中，勢必會引起土壤環(huán)境的污染。GARCA GALN等[4]34的研究表明，SM1、磺胺硝苯以及磺胺甲氧吡噠嗪在土壤中的質(zhì)量濃度分別高達20.4、17.1、15.6 μg/kg。李彥文等[6]檢測了廣州、深圳等地菜地土壤中的6種磺胺類抗生素，其平均質(zhì)量濃度為4.90～51.40 μg/kg。而關(guān)于土壤環(huán)境中磺胺類抗生素污染引起的植物生態(tài)毒性研究也受到越來越多的關(guān)注。金彩霞等[7]研究了磺胺間甲氧嘧啶(SMM)對小麥和西紅柿的毒性效應(yīng)，結(jié)果顯示SMM對兩種植物的根伸長和芽生長均具有較強的抑制作用。肖明月等[8]發(fā)現(xiàn)當磺胺二甲嘧啶染毒質(zhì)量濃度大于8.00 mg/L時，其對小白菜種子的萌發(fā)會產(chǎn)生顯著的抑制作用。然而關(guān)于磺胺類抗生素對植物毒性機理的研究還并不多見，因此有必要在此方面開展更多的研究工作。

陸生高等植物是陸生生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，其生長情況可反映整個生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況，為此研究污染脅迫對陸生植物的生態(tài)毒性具有重要意義。為此，本研究以較為常用的磺胺類抗生素磺胺甲惡唑(SMZ)、SM1及ST為研究對象，并以具代表性的陸生高等植物油菜(Brassicacampestris)作為生態(tài)毒理學模式生物，通過盆栽實驗研究3種磺胺類抗生素脅迫對油菜幼苗葉片中的葉綠素(CHL)和可溶性蛋白(SP)含量以及抗氧化酶(POD)活性的影響，以期為磺胺類抗生素的生態(tài)風險評價和安全管理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，Hettich 32R低溫高速冷凍離心機(德國Hettich公司)。SMZ、SM1、ST純度均為98%，購自Sigma公司，其他試劑均為分析純或化學純級別。

1.2 土壤樣品制備

采集表層(0～20 cm)未污染土壤，風干后過2.0 mm篩后備用。該土壤有機質(zhì)質(zhì)量濃度為18.9 g/kg，陽離子交換量為163 mmol/kg，pH為8.78。先將一小部分干凈土壤與抗生素混合，拌勻后再將染毒土壤與干凈土壤進行不斷攪拌，以保證充分混勻，使土壤樣品中各抗生素的最終質(zhì)量濃度分別為15.0、45.0 mg/kg。

1.3 植物培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿的油菜種子，放入恒溫培養(yǎng)箱中，于25 ℃下培養(yǎng)5 d，將油菜幼苗分別種植在不同濃度梯度的染毒土壤中盆栽培養(yǎng)，同時設(shè)置干凈土壤為空白對照組(CK)。本實驗共設(shè)置6個處理組，每個處理組3次重復。第1、2、3處理組為低濃度染毒組，土壤中分別為15.0 mg/kg的ST、SMZ、SM1，第4、5、6處理組為高濃度染毒組，土壤中分別為45.0 mg/kg的ST、SMZ、SM1，每天給植物澆水，培養(yǎng)1個月后采樣測定植物幼苗葉片中CHL、SP含量及POD活性。

1.4 測定方法

CHL的測定參照文獻[9]；SP的測定參照文獻[10]；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[11]。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標準偏差表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件對組間數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著，P>0.05表明差異不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 磺胺類抗生素對CHL的影響

由圖1可見，與CK組相比，3種磺胺類抗生素染毒處理1個月后，油菜葉片中的CHL含量均被顯著抑制(P<0.05)。其中，第2、5處理組CHL最低，說明SMZ脅迫對CHL的抑制作用最大，經(jīng)低濃度、高濃度SMZ染毒處理后，油菜葉片中的CHL均極顯著(P<0.01)低于CK組。此外，第1、4處理組，第2、5處理組，第3、6處理組之間的CHL含量差別不大，說明抗生素染毒濃度的增加，油菜葉片CHL含量的變化并不明顯，表明油菜葉片CHL含量與磺胺類抗生素染毒濃度之間無顯著的劑量—效應(yīng)關(guān)系。

注：**表示與CK組比較差異極顯著(P<0.01),*表示與CK組比較差異顯著(P<0.05)，圖2、圖3同。

圖1磺胺類抗生素對油菜葉片CHL的影響
Fig.1 Effects of sulfonamides on CHL inBrassicacampestrisleaves

植物葉片中的CHL會直接參與植物的光合作用，其含量可反映植物體生長及受脅迫的狀況[12]。由于CHL的敏感性，當植物體暴露于重金屬或有機污染物時，CHL會受到影響，進而影響植物體。ZHANG等[13]在研究石油烴對海洋微藻的生態(tài)毒性時發(fā)現(xiàn)，青島大扁藻、球等鞭金藻以及小新月菱形藻體內(nèi)的CHL含量均受到不同程度的抑制。本研究也得到相似結(jié)論，在15.0、45.0 mg/kg兩種染毒水平下，磺胺類抗生素染毒組對油菜葉片中的CHL均有顯著抑制作用，尤其是SMZ對葉綠素的抑制作用明顯高于SM1和ST?？赡苁腔前奉惪股貙HL合成過程中的關(guān)鍵酶類(如葉綠素酸酯還原酶等)具有抑制作用，進而影響了CHL的合成[14]。

2.2 磺胺類抗生素對SP的影響

由圖2可見，3種磺胺類抗生素的低濃度染毒處理組對油菜葉片中的SP含量影響相差較大，第3組油菜葉片中的SP含量與CK組差異不顯著，第1組油菜葉片中的SP含量與CK組差異顯著，第2組油菜葉片中的SP含量與CK組差異極顯著，低濃度SMZ對油菜葉片SP的抑制作用最大。經(jīng)3種磺胺類抗生素的高濃度染毒處理后，SP含量進一步降低，也表現(xiàn)為SMZ對油菜葉片SP的抑制作用最大，而高濃度ST與SM1對SP含量的抑制作用差異不大。

圖2 磺胺類抗生素對油菜葉片SP的影響Fig.2 Effects of sulfonamides on SP in Brassica campestris leaves

SP作為標志植物體內(nèi)總體代謝的重要指標，往往對污染物的長期脅迫更敏感[15]。本研究中，當染毒質(zhì)量濃度為15.0 mg/kg時，3種磺胺類抗生素對油菜葉片中SP的合成已開始產(chǎn)生一定的抑制作用；隨著染毒質(zhì)量濃度增加到45.0 mg/kg，抑制作用更加明顯。這可能是由于抗生素的脅迫使油菜葉片中R基因的激活受到抑制，進而使SP的合成受到抑制，或是由于高濃度抗生素脅迫使合成的SP分解[16]。

2.3 磺胺類抗生素對POD活性的影響

由圖3可見，在兩種濃度的染毒處理下，3種磺胺類抗生素對油菜葉片POD活性均有極顯著的誘導作用。尤其是SMZ脅迫下，POD的活性均顯著增加，3種抗生素的誘導作用強度為SMZ>SM1>ST。

抗氧化防御系統(tǒng)主要用于清除活性氧自由基(ROS)，因此在生物體抵御脅迫及保護細胞免受ROS造成的傷害中起到重要作用。在抗氧化防御系統(tǒng)中的眾多酶類里，POD因其在細胞內(nèi)外都可清除ROS，而成為最主要的抗氧化防御酶[17]。張軍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，單一溶解性有機質(zhì)或雙酚A暴露都會誘導POD活性產(chǎn)生。本研究中，無論是低濃度染毒處理組還是高濃度染毒處理組，3種磺胺類抗生素對油菜葉片中的POD活性均有極顯著的誘導作用，說明在抗生素脅迫下油菜體內(nèi)產(chǎn)生了大量的ROS，而油菜啟動了自身的抗氧化防御能力，利用POD清除這些ROS，POD活性就被誘導，這是植物體進行自我保護的體現(xiàn)。但有研究表明，低濃度的四氯乙烯會誘導小麥幼苗中的POD活性，而高濃度的四氯乙烯則會抑制POD活性[19]，表明植物體的抗氧化防御能力是有限的，當污染物濃度過高而產(chǎn)生過多的ROS時，就超出了POD的清除能力，POD活性即被抑制?？梢姡瑢嶒炍锓N、抗生素種類及染毒劑量都會對POD活性產(chǎn)生不同影響。

圖3 磺胺類抗生素對油菜葉片POD活性的影響Fig.3 Effects of sulfonamides on the activity of POD in Brassia campestris leaves

3 結(jié) 論

在低濃度染毒處理和高濃度染毒處理下，SM1、ST對油菜葉片中的CHL含量均有顯著抑制作用(P<0.05)，SMZ對油菜葉片中的CHL含量有極顯著抑制作用(P<0.01)。3種磺胺類抗生素對油菜葉片SP含量的抑制作用隨著染毒濃度的增加逐漸增強，其中SMZ對SP含量的抑制作用最大。兩種濃度的染毒處理下，3種磺胺類抗生素對油菜葉片的POD活性均產(chǎn)生極顯著誘導(P<0.01)，并且SMZ對POD活性的誘導作用最為顯著。綜上，SMZ、SM1和ST均顯著影響了油菜體內(nèi)的生化過程，并且3種抗生素中SMZ的毒性效應(yīng)最強。

[1] BOXALL A B A,BLACKWELL P,CAVALLO R,et al.The sorption and transport of a sulphonamide antibiotic in soil systems[J].Toxicology Letters,2002,131(1/2):19-28.

[2] GILMAN A G,RALL T W,NIES A S,et al.Goodman and gilman’s pharmacological basis of therapeutics[M].8th ed.New York:Pergamon Press,1990.

[3] WITTE W.Medical consequences of antibiotic use in agriculture[J].Science,1998,279(5353):996-997.

[5] H?LZEL C S,HARMS K S,KüCHENHOFF H,et al.Phenotypic and genotypic bacterial antimicrobial resistance in liquid pig manure is variously associated with contents of tetracyclines and sulfonamides[J].Journal of Applied Microbiology,2010,108(5):1642-1656.

[6] 李彥文,莫測輝,趙娜,等.菜地土壤中磺胺類和四環(huán)素類抗生素污染特征研究[J].環(huán)境科學,2009,30(6):1762-1766.

[7] 金彩霞,劉軍軍,鮑林林,等.磺胺間甲氧嘧啶-鎘復合污染對作物種子發(fā)芽的影響[J].中國環(huán)境科學,2010,30(6):839-844.

[8] 肖明月,安婧,紀占華,等.6種常見抗生素對小白菜種子萌發(fā)及生理特性的影響[J].生態(tài)學雜志,2014,33(10):2775-2781.

[9] HEGEDüS A,ERDEI S,HORVATH G.Comparative studies of H2O2detoxifying enzymes in green and greening barley seedling under cadmium stress[J].Plant Science,2001,160(6):1085-1093.

[10] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(1/2):248-254.

[11] WU X Y,VON TIEDEMANN A.Impact of fungicides on active oxygen species and antioxidant enzymes in spring barley (HordeumvulgareL.) exposed to ozone[J].Environmental Pollution,2002,116(1):37-47.

[12] WANG C,ZHANG S,WANG P F,et al.Salicylic acid involved in the regulation of nutrient elements uptake and oxidative stress inVallisnerianatans(Lour.) Hara under Pb stress[J].Chemosphere,2011,84(1):136-142.

[13] ZHANG Y,TANG X X.Effect of oil water-accommodated fraction on growth and chlorophyll-a of marine microalgae[J].Advanced Materials Research,2013,726:94-97.

[14] KüPPER H,KüPPER F,SPILLER M.Environmental relevance of heavy metal-substituted chlorophylls using the example of water plants[J].Experimental Botanical,1996,47(2):259-266.

[15] 潘林,張艷馥,金忠民.Zn2+、Cr6+脅迫對水螅的急性毒理作用及對可溶性蛋白的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2013,42(9):120-123.

[16] LI Y N,ZHOU Q X,LI F X,et al.Effects of tetrabromobisphenol A as an emerging pollutant on wheat (Triticumaestivum) at biochemical levels[J].Chemosphere,2008,74(1):119-124.

[17] 杜秀敏,殷文璇.植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機制[J].生物工程學報,2001,17(2):121-125.

[18] 張軍,葛碧洲,侯瑞,等.再生水中溶解性有機質(zhì)和雙酚A對浮水植物的復合脅迫效應(yīng)[J].環(huán)境污染與防治,2015,37(9):1-4.

[19] 楊秀婧,單愛琴,揣小明,等.四氯乙烯污染對小麥幼苗抗氧化酶系的影響[J].環(huán)境污染與防治,2008,30(6):17-19.

Effectsoftypicalsulfonamidesonthechlorophyll，solubleproteincontentsandperoxidasesactivityofBrassicacampestris

LIYaning1,2,ZHANGLihong3,YINYanyan1,ZHANGChen1,LIUGang1,LIFengxiang4.

(1.LaboratoryofEnvironmentalScienceandEngineering,BinhaiCollegeofNankaiUniversity,Tianjin300270;2.CollegeofChemistry,NankaiUniversity,Tianjin300071;3.TianjinEnvironmentalMonitoringCenter,Tianjin300191;4.CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071)

The effects of 3 typical sulfonamides (SAs) of sulfamethoxazole (SMZ),sulfamerazine (SM1),and sulfathiazole (ST) on the peroxides (POD) activity,the contents of chlorophyll (CHL) and soluble protein (SP) ofBrassicacampestriswere investigated by pot experiments. The results indicated that under both low-dose (15.0 mg/kg) and high-dose (45.0 mg/kg) exposure conditions,SM1 and ST treatments significantly (P<0.05) decreased the CHL content inBrassicacampestris,and SMZ treatment highly significantly (P<0.01) decreased the CHL content inBrassicacampestris. The inhibition of the three kinds of SAs on the SP content was increased with the increase of concentrations of SAs. The inhibition of SMZ on the SP content was the most significant. Under the two dose exposure conditions,all the treatments of the three kinds of SAs highly significantly (P<0.01) increased the POD activity. Also,the induction of SMZ on the POD activity was the most significant. Therefore,SMZ,SM1,and ST significantly influenced the biochemical process ofBrassicacampestris. And,the toxicity of SMZ was higher than SM1 and ST.

sulfonamides;Brassicacampestris; chlorophyll; soluble protein; peroxidases

李亞寧，女，1981年生，博士，副教授，研究方向為環(huán)境分析化學與污染生態(tài)化學。#

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*國家自然科學基金青年科學基金資助項目(No.41503109、No.21601094)；國家自然科學基金面上資助項目(No.31570504)；天津市自然科學基金資助項目(No.16JCYBJC22900)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.11.010

2017-07-10)