國(guó)學(xué)紅，何 燕，張旺德，王嬋娟，張 婷，官志忠

(地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004)

·調(diào)查報(bào)告·

貴州省3個(gè)少數(shù)民族線粒體DNA 9 bp序列缺失頻率的分析研究

國(guó)學(xué)紅，何 燕△，張旺德，王嬋娟，張 婷，官志忠

(地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004)

目的探討貴州省3個(gè)少數(shù)民族線粒體DNA(mtDNA)9 bp序列缺失頻率情況。方法隨機(jī)選取貴州省雷山縣苗族(69例)、荔波縣布依族(70例)、荔波縣水族(44例)共183例男性血液標(biāo)本，應(yīng)用PCR及直接測(cè)序檢測(cè)線粒體DNA 9 bp序列缺失情況。結(jié)果在貴州省3個(gè)少數(shù)民族樣本中發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)型、缺失型、3型，缺失頻率最高為荔波縣水族(40.91%)，雷山縣苗族中檢出3型1例，3個(gè)少數(shù)民族群體間mtDNA 9 bp缺失頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。結(jié)論3個(gè)世居少數(shù)民族mtDNA 9 bp 缺失頻率不同，水族的遺傳變異較大，水族與苗族的親緣關(guān)系相比水族與布依族較近。

貴州；布依族；水族；苗族；mtDNA

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA) 9 bp序列缺失標(biāo)記做了一系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該遺傳標(biāo)記有助于了解人群的親緣關(guān)系和遷徙路線。mtDNA 9 bp序列缺失是指位于mtDNA COⅡ/tRNALys基因間小非編碼區(qū)RegionⅤ的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列隨機(jī)發(fā)生一個(gè)拷貝序列丟失的現(xiàn)象，可能與DNA復(fù)制過(guò)程中滑鏈錯(cuò)配有關(guān)，致使該區(qū)域核苷酸長(zhǎng)度發(fā)生變化，最終形成4種多態(tài)：標(biāo)準(zhǔn)序列為2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的 9 bp序列，長(zhǎng)型為標(biāo)準(zhǔn)序列前加4個(gè)CCCC，缺失型為1拷貝 9 bp序列，3型為3個(gè)重復(fù)拷貝 9 bp序列[1]。缺失型是一種最常見(jiàn)的多態(tài)，在不同人群中分布比例不同。研究表明，mtDNA 9 bp序列缺失具有多重源性，在亞洲人、非洲人、歐洲人等均發(fā)現(xiàn)了mtDNA 9 bp序列缺失現(xiàn)象[2]。本文旨在通過(guò)對(duì)貴州省雷山縣苗族、荔波縣布依族、荔波縣水族的mtDNA 9 bp序列缺失頻率分布情況進(jìn)行研究，并結(jié)合已報(bào)道的其他民族群體來(lái)分析該地區(qū)人群的母系遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為相關(guān)的民族群體的起源和遷徙路線提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本采集 根據(jù)知情同意原則，隨機(jī)選取貴州省雷山縣苗族(69例)、荔波縣布依族(70例)、荔波縣水族(44例)共183例男性血液標(biāo)本，采血對(duì)象均3代內(nèi)無(wú)族外通婚，彼此之間無(wú)直系親緣關(guān)系，每人取2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。

1.2試劑 本試驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。血液基因組提取試劑盒、2×PCR Master Mix、96孔PCR反應(yīng)板等購(gòu)自北京天跟生化科技有限公司。PCR擴(kuò)增引物合成和DNA序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3儀器 2720 Thermal Cycler PCR儀(美國(guó)ABI公司)擴(kuò)增目的基因片段,DU-640核酸蛋白分析儀(美國(guó)Beckman公司)檢測(cè)核酸的純度和濃度。電泳儀DYY-6C(北京六一儀器廠)和凝膠顯像儀(英國(guó)Syngene公司，G：BOX)用來(lái)分辨DNA片段長(zhǎng)度大小。

1.4方法

1.4.1模板DNA提取 外周血提取試劑盒提取基因組DNA，每個(gè)DNA樣本取 2 μL加入 48 μL無(wú)菌雙蒸水進(jìn)行25倍稀釋?zhuān)贤夥止夤舛葍x進(jìn)行核酸定量，由A260和A280計(jì)算出DNA母液的濃度和純度，取少量的DNA進(jìn)行模板標(biāo)化至30 μL，標(biāo)化濃度為30 ng/μL作為PCR的模板，于-20 ℃保存。

1.4.2mtDNA 9 bp的PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR引物序列，上游引物：5′-GCC CGT ATT ACC CTA TA-3′，下游引物：5′-GTA AAG AGG TGT TGG TTC-3′。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，無(wú)菌雙蒸水11.0 μL，2×PCR master mix 6.0 μL，上下游引物各1 μL，DNA模版1 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 40 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃充分延伸5 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，電壓120 V，時(shí)間80 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)型、缺失型、3型，與之相對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為121、112、130 bp。

1.4.3mtDNA 9 bp的PCR產(chǎn)物測(cè)序 隨機(jī)選取標(biāo)準(zhǔn)型、缺失型、3型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各6例交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與mtDNA修訂的劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié) 果

2.1基本情況 貴州3個(gè)少數(shù)民族群體mtDNA 9 bp發(fā)現(xiàn)3種基因型:標(biāo)準(zhǔn)型、缺失型、3型，見(jiàn)圖1。本次研究的3個(gè)少數(shù)民族群體標(biāo)準(zhǔn)頻率依次為66.67%、75.71%、59.09%，缺失頻率依次為31.88%、24.29%、40.91%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；僅在苗族中發(fā)現(xiàn)3型，頻率為1.45%。

圖1 貴州3個(gè)少數(shù)民族mtDNA 9 bp 3種基因型頻率的分布

2.2mtDNA 9 bp PCR產(chǎn)物電泳圖譜 在PCR檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)非特異擴(kuò)增，183例受檢者的電泳圖譜發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)型125例，缺失型57例，3型1例，見(jiàn)圖2。被檢測(cè)的貴州3個(gè)少數(shù)民族群體樣本數(shù)依次為苗族69例、布依族70例、水族44例mtDNA 9 bp缺失個(gè)數(shù)分別為22、17、18個(gè)。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物；1:3型擴(kuò)增產(chǎn)物；2、3:標(biāo)準(zhǔn)型擴(kuò)增產(chǎn)物；4、5:缺失型擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 mtDNA 9 bp PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3序列測(cè)定結(jié)果 檢測(cè)的6例標(biāo)準(zhǔn)型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸序列與mtDNA COⅡ/tRNALys基因區(qū)的小非編碼區(qū)的劍橋序列一致，存在2個(gè)重復(fù)拷貝的9 bp序列，5例缺失型1拷貝9 bp序列和1例3型3個(gè)拷貝的9 bp序列。見(jiàn)圖3。

A：缺失型;B:標(biāo)準(zhǔn)型;C:3型

圖3 mtDNA 9 bp序列分析結(jié)果

3 討 論

人類(lèi)mtDNA 9 bp序列缺失標(biāo)記由于具有母系遺傳特點(diǎn)，能夠忠實(shí)地記錄母系進(jìn)化歷史，因此對(duì)于研究人類(lèi)的起源、遷徙、親緣關(guān)系等具有重要價(jià)值。有研究通過(guò)對(duì)伊朗人群的mtDNA 9 bp序列缺失頻率的分析[3]，提示該人群的母系遺傳結(jié)構(gòu)與巴基斯坦人群、新幾內(nèi)亞人群較為相近，而與我國(guó)人群32%、中國(guó)臺(tái)灣人群18%～40%的母系遺傳結(jié)構(gòu)差異較大(Plt;0.05)[4-5]。mtDNA 9 bp缺失頻率分布所呈現(xiàn)的地理趨勢(shì)能夠較好地描述出史前該地區(qū)人類(lèi)的遷徙路線。姚永剛等[6]對(duì)國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)的少數(shù)民族和漢族群體的mtDNA 9 bp缺失頻率進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，南方人群的遺傳多態(tài)性高于北方人群，沿海人群高于內(nèi)陸人群，提示自我國(guó)的南方進(jìn)入，隨后由南向北遷徙，這與柯越海等[7]得出中華民族南方起源的結(jié)論是相符的。于恩艷等[8]對(duì)我國(guó)新疆塔吉克族和柯?tīng)柨俗巫迦巳簃tDNA 9 bp多態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，塔吉克族1.43%、柯?tīng)柨俗巫?.86%與維吾爾族3.3%、高加索人群mtDNA 9 bp缺失頻率較近；這與嚴(yán)江偉等[9]通過(guò)對(duì)新疆喀什地區(qū)維吾爾族 mtDNA D 環(huán)高變Ⅰ區(qū)序列研究得出維吾爾族人群與高加索人群基因發(fā)生了融合的結(jié)論相一致。本次研究的貴州3個(gè)世居少數(shù)民族為不同原始部落起源的民族群體，苗族是一個(gè)有著悠久歷史的并且發(fā)源于我國(guó)的國(guó)際性民族，水族、布依族起源于古代百越。研究發(fā)現(xiàn)，地理位置相近的苗族與百越起源的布依族、水族的mtDNA 9 bp缺失頻率分布不同，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，其中布依族的mtDNA 9 bp缺失頻率最小，苗族次之，水族的mtDNA 9 bp缺失頻率最高，提示苗族的母系遺傳結(jié)構(gòu)變異小于水族和布依族。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)不同地域、不同民族的mtDNA 9 bp缺失頻率分布狀況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其分布具有明顯的地域特異性和種族差異性。不同民族起源的民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率分布情況表現(xiàn)不一。本次研究的3個(gè)世居少數(shù)民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率均高于北方民族起源的新疆蒙古族4.0%、朝鮮族9.43%、藏族5.52%[6，10-11]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；這符合起源于百越、苗瑤支系的民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率高于北方民族起源的民族群體的結(jié)論。荔波水族人群mtDNA 9 bp缺失頻率與中國(guó)臺(tái)灣高山族41.46%、漢族40%相近[12-13]，提示親緣關(guān)系較近。筆者分析可能的原因有，高山族來(lái)源是多源性的，但主要是來(lái)自我國(guó)大陸東南沿海的古越的一支，因此與同為古越起源的水族有著相似的遺傳結(jié)構(gòu)；另一個(gè)原因?yàn)闈h族與高山族混雜居住，民族間基因發(fā)生了交流。同一民族起源的不同民族群體mtDNA 9 bp缺失頻率分布情況也是不同的，本研究的荔波布依族的mtDNA 9 bp缺失頻率與廣西壯族20.83%相近[14]，與荔波水族的缺失頻率相比差異較大，提示該人群與廣西壯族的親緣關(guān)系較近，與荔波水族的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。究其原因可能是這些具有共同史載起源的民族群體在遷徙過(guò)程中與其他民族基因融合的概率不同，也有可能群體間本身就存在遺傳結(jié)構(gòu)差異。

本課題組前期對(duì)貴州多個(gè)世居少數(shù)民族人群的mtDNA 9 bp的遺傳多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)3拷貝9 bp序列，而本次研究在雷山苗族人群中發(fā)現(xiàn)。3拷貝9 bp序列在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)伊朗人群[3]的3個(gè)9 bp拷貝的重復(fù)頻率很低并且分布分散，與我國(guó)的內(nèi)蒙古蒙古族、廣東漢族、遼寧漢族、武漢漢族、云南漢族、新疆維吾爾族人群接近[6，15]，與葡萄牙人群相比要低，提示這種長(zhǎng)度變異的起源在伊朗人群與我國(guó)人群中可能是各自獨(dú)立起源，在葡萄牙人群中可能是共同起源。

綜上所述，研究mtDNA 9 bp的遺傳多態(tài)性標(biāo)記，不僅有助于了解不同民族群體的母系遺傳結(jié)構(gòu)，而且為研究人類(lèi)的起源、遷徙路線、親緣關(guān)系提供了一定的遺傳背景資料。

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Studyonfrequencyof9bpsequencedeletionofmithochondrialDNAinthreeethnicnationalitiesofGuizhouProvince*

GuoXuehong，HeYan△，ZhangWangde，WangChanjuan，ZhangTing，GuanZhizhong

(KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases,MinistryofEducation/KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo study the frequency of 9 bp sequence deletion of mithochondrial DNA in three ethnic nationalities of Guizhou Province.MethodsA total of 183 male blood samples were randomly extracted from Miao nationality(69 cases) in Leishan County,Shui nationality(44 cases) and Buyi nationality (70 cases) in Libo County.Polymerase chain reaction(PCR) and direct sequencing were used to detect the mithochondrial DNA 9 bp sequence deletion.ResultsThe standard type,deleting type and 3 type were found in the samples of 3 ethnic nationalities in Guizhou Province,the highest deletion frequency was Shui nationality(40.91%) in Libo County,1 cases of 3 type was detected in Miao nationality of Leishan County,and the mtDNA 9 bp deletion frequency had no statistical difference among 3 ethnic nationalities(Pgt;0.05).ConclusionThe frequency of mtDNA 9 bp deletion is different among three native minorities,the genetic variation in Shui nationality is larger,compared with Miao nationality genetic relationship,Shui nationality has a relatively closer affinity with Buyi nationality.

Guizhou;Buyi nationality;Shui nationality;Miao nationality;mtDNA

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.031

貴州省“2011 協(xié)同創(chuàng)新中心”項(xiàng)目(黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心[2014]06號(hào))；貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(黔科合J字[2011]2119號(hào))。

國(guó)學(xué)紅(1981-),在讀碩士，主要從事疾病分子生物學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn。

Q987

A

1671-8348(2017)33-4702-03

2017-05-06

2017-08-04)