趙利華，焦 勤，陳夢婕，王一臣，范玲燕，馬 峰，應(yīng) 灝，王 隼

(上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學附屬兒童醫(yī)院骨科 200062)

·論著·

PTGFR基因在DDH患兒關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中的表達變化及其與DDH發(fā)病的相關(guān)性研究

趙利華，焦 勤，陳夢婕，王一臣，范玲燕，馬 峰，應(yīng) 灝，王 隼△

(上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學附屬兒童醫(yī)院骨科 200062)

目的分析前列腺素F2α 受體(PTGFR)基因在發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(DDH)患兒髖關(guān)節(jié)組織中的表達變化及其與DDH發(fā)病的相關(guān)性。方法8對年齡相近、性別相同的DDH患兒(DDH組)和對照兒童(對照組)入組進行比較。采用實時定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測兩組患兒PTGFR mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果DDH組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中PTGFR mRNA表達水平較對照組明顯降低(t=3.472、2.887,Plt;0.05)。DDH組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中PTGFR蛋白表達水平較對照組明顯降低(t=5.488、3.942,Plt;0.05)。結(jié)論PTGFR可能在DDH發(fā)病中發(fā)揮重要作用，PTGFR可能是DDH的致病基因之一。

關(guān)節(jié)囊；圓韌帶；發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良；前列腺素F2α 受體基因

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(developmental dysplasia of the hip,DDH)是兒童骨科最常見的疾病之一。 在我國DDH發(fā)病率達5‰，國外為2‰～50‰，以女性占絕對優(yōu)勢，其發(fā)病率在人種間和地區(qū)間差異明顯，這與遺傳因素、環(huán)境影響和生活習慣密切相關(guān)[1]。DDH是由股骨近端和髖臼及其周圍組織發(fā)育異常導(dǎo)致，關(guān)節(jié)囊和韌帶松弛是導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)不穩(wěn)定的主要因素之一[2]。目前，DDH的明確致病基因和發(fā)病機制仍不清楚[3-4]。本課題組前期研究結(jié)果提示前列腺素F2α受體(prostaglandin F2α receptor,PTGFR)基因的突變與DDH的發(fā)病相關(guān)，文獻亦顯示PTGFR基因與骨關(guān)節(jié)發(fā)育相關(guān)。為了進一步研究PTGFR與DDH的相關(guān)性，本研究應(yīng)用分子生物學方法比較PTGFR在DDH和非DDH患兒關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達差異，為進一步從分子水平探索PTGFR在DDH發(fā)病中發(fā)揮作用的機制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年8月至2016年12月入住本院的DDH患兒8例(DDH組)，均無家族史，無合并其他畸形，手術(shù)復(fù)位中采集切除的患髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶。收集與DDH組性別相同年齡相近(lt;6個月)的對照組兒童8例髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶(3例來源于髖關(guān)節(jié)化膿性關(guān)節(jié)炎，2例來源于股骨頭無菌性壞死，1例來源于股骨骨肉瘤手術(shù)切除，2例來源于意外死亡后尸檢)，取材部位及方法同DDH組。DDH組8例，男2例,女6例,年齡2～8歲，平均(3.2±0.8)歲。對照組8例，男3例，女5例,年齡2～7歲，平均(3.5±1.4)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.036，Pgt;0.05)。在標本離體后迅速剪取全厚層關(guān)節(jié)囊和中間1/3圓韌帶，將標本切成多塊直徑約為0.5 cm的組織塊并裝進帶有編號的滅菌凍存管，立即放進液氮轉(zhuǎn)移罐，最終于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。以上標本獲取均獲得參與人或其法定監(jiān)護人的書面知情同意，收集和使用病患生物樣本均通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2方法

1.2.1實時定量PCR檢測髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中PTGFR mRNA的表達水平 總RNA的分離和提取方法嚴格按照Trizol試劑盒說明書進行。紫外分光光度計TU-1901進行吸光度A260/280和A260/230比值的測定以確定樣品總RNA的純度和濃度。分別取總RNA各500 ng進行反轉(zhuǎn)錄，β-actin作為內(nèi)參。β-actin上游引物：5′-TGA GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3′，下游引物：5′-GCT CGT TGC CAA TAG TGA TGA CC-3′；PTGFR上游引物：5′-GTT TTC CGT CTG GCA GGT TGT-3′，下游引物：5′-AGA TGA CTT GAG TGG TTG GCT TTT-3′。實時定量PCR反應(yīng)混合液：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上游引物0.4 μL，10 μmol/L的下游引物0.4 μL，加水至總體積為20 μL。實時定量PCR循環(huán)條件：初始階段95 ℃ 3 min；95 ℃ 7 s(解鏈)，57 ℃ 10 s(退火)，72 ℃ 15 s(延伸)，共40個循環(huán)。完成加樣后，把加好樣品的96孔板放在ABI7500型熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.2蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中PTGFR蛋白的表達水平 取兩組患兒關(guān)節(jié)囊和圓韌帶組織樣本適量，加300 μL含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑后冰上研磨。研磨后冰上放置10 min，4 ℃ 15 300 r/min離心10 min。取上清液(即是總蛋白提取物)放入預(yù)冷的1.5 mL離心管。按Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度后行SDS-PAGE電泳，半干法蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，300 mA恒流條件下按蛋白大小轉(zhuǎn)膜。膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合，封閉過的膜加一抗(PTGFR)室溫孵育1.5 h，TBST洗脫5 min×3次，HRP標記的熒光二抗(1∶5 000)常溫下孵育1 h，TBST洗脫5 min×3次，ECL化學發(fā)光顯像，Image J軟件測定灰度值。 β-actin作為內(nèi)參照，每個樣本重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中PTGFR mRNA的表達水平 DDH組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊、圓韌帶中PTGFR mRNA的表達水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.472、2.887,Plt;0.05)。見圖1、表1。

A：髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊；B：髖關(guān)節(jié)圓韌帶

圖1兩組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中PTGFR mRNA表達水平

2.2髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中PTGFR蛋白的表達水平 DDH組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊、圓韌帶中PTGFR蛋白表達水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.488、3.942,Plt;0.05)。見圖2、3，表2。

表1 兩組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中PTGFR mRNA的表達情況

*：Plt;0.05，與對照組相比

1～8:DDH組標本；1′～ 8′：對照組標本

圖2兩組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊中PTGFR蛋白表達水平

1～8：DDH組標本；1′～ 8′：對照組標本

圖3 兩組患兒髖關(guān)節(jié)圓韌帶中PTGFR蛋白表達水平表2 兩組患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中PTGFR 蛋白表達情況

*：Plt;0.05，與對照組相比

3 討 論

DDH病因?qū)W復(fù)雜，越來越多的研究顯示環(huán)境因素和遺傳因素共同參與DDH的發(fā)病。環(huán)境因素包括羊水過少、臀位、襁褓方法不當?shù)萚5]。流行病學研究顯示，遺傳因素在DDH的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，67.88%的DDH發(fā)病與遺傳因素有關(guān)[6]，同卵雙生DDH的發(fā)病一致率(41.4%)遠遠高于異卵雙生的發(fā)病一致率(2.8%)[7]。包括家族聚集性研究、家系的復(fù)合分離分析、遺傳模式分析和流行病學調(diào)查在內(nèi)的多種研究結(jié)果也表明孤立型DDH符合常染色體顯性遺傳的一些特征，但不表現(xiàn)為簡單的孟德爾方式遺傳，可能由于其復(fù)雜的病因，DDH往往表現(xiàn)為不完全外顯性[3-4]，這些證據(jù)都提示基因的異常在DDH的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

臨床醫(yī)師常常發(fā)現(xiàn)DDH患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶存在松弛和薄弱[2,8]。人類出生時髖關(guān)節(jié)髖臼淺、股骨頭表面形成的弧線平滑，出生后髖臼不斷加深、股骨頭弧度加大，髖關(guān)節(jié)逐漸穩(wěn)定，厚而堅韌的髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶在該穩(wěn)定過程發(fā)揮重要作用[8]。髖關(guān)節(jié)的正常生長發(fā)育需要髖臼、股骨近端、關(guān)節(jié)周圍韌帶、血管、神經(jīng)及肌肉的協(xié)調(diào)生長共同完成，該過程由復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，同時受環(huán)境、生物因素的影響[9]。本課題組前期研究結(jié)果提示PTGFR基因的突變與DDH的發(fā)病相關(guān)。本研究進一步通過實時定量PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平檢測了PTGFR在DDH患兒髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中的表達，研究結(jié)果提示DDH患兒髖關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)囊和圓韌帶中PTGFR的mRNA和蛋白表達明顯低于對照組，進一步提示PTGFR很可能參與DDH的發(fā)病。

髖關(guān)節(jié)屬于滑膜關(guān)節(jié)，它的兩個關(guān)節(jié)面都由關(guān)節(jié)軟骨被覆。軟骨內(nèi)成骨貫穿于正常骨和關(guān)節(jié)生長、發(fā)育及外傷后骨骼修復(fù)，軟骨內(nèi)成骨的軟骨細胞分化過程受到多種生長因子和信號分子調(diào)控，其中一類信號分子即是前列腺素(prostaglandins,PGs)，它是一組化學結(jié)構(gòu)相似、具有廣泛生物活性的不飽和脂肪酸，體內(nèi)的PGs水平極微，但活性極強，除PGE2外,PGF2α是關(guān)節(jié)液的主要PGs，骨關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血液和關(guān)節(jié)液中的PGE2和PGF2α水平均明顯增高[10]。PGF2α能刺激鼠軟骨細胞株聚糖蛋白合成并促進人關(guān)節(jié)軟骨細胞中二型膠原蛋白mRNA的表達[11-12]。PGF2α通過其受體PTGFR發(fā)揮生物學作用，PGF2α與PTGFR結(jié)合，活化的PTGFR增加肌醇三磷酸/甘油二酯(IP3/DAG)水平，從而激活蛋白激酶C(PKC),觸發(fā)Ca2+從細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，從而發(fā)揮調(diào)控作用[13]。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)PTGFR mRNA表達于生長版的肥大軟骨細胞，這提示PTGFR-PGF2α信號通路可能參與軟骨細胞的肥大過程。Kim等[15]發(fā)現(xiàn)PTGFR的表達在軟骨形成后期明顯增高，低表達PTGFR干擾軟骨形成而人為的高表達PTGFR能促進軟骨形成，該結(jié)果提示PTGFR的低表達會抑制軟骨的形成，與本研究結(jié)果一致，提示PTGFR可能影響髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊和圓韌帶的發(fā)育從而參與DDH的發(fā)病。因此，PTGFR極有可能在DDH的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但是目前為止，尚無文獻報道PTGFR與DDH的發(fā)病相關(guān)，其中的機制需要大量研究進一步證實。

DDH的臨床表現(xiàn)、診斷標準和治療方案均較明確，遺傳因素在DDH發(fā)病中發(fā)揮著重要作用這一觀念也被大多數(shù)臨床工作者和科研工作者所認同，目前發(fā)現(xiàn)至少5個基因的突變和DDH的發(fā)病相關(guān),但是，這些基因在DDH發(fā)病中發(fā)揮作用的分子機制均不明確，DDH的發(fā)病機制更不清楚。本研究結(jié)果提示PTGFR參與DDH的發(fā)病，但是其分子機制還需要大量細胞學和動物學研究不斷探索和研究。

[1]Kolb A,Schweiger N,Mailath-pokorny YM,et al.Low incidence of early developmental dysplasia of the hip in Universal ultrasonographic screening of newborns:analysis and evaluation of risk factors[J].Int Orthop,2016,40(1):123-127.

[2]Philippon MJ,Trindade CA,Goldsmith MT,et al.Biomechanical assessment of hip capsular repair and Reconstruction procedures using a 6 degrees of freedom robotic system[J].Am J Sports Med,2017,45(8):1745-1754.

[3]Zhao LH,Zhou ZW,Wang S,et al.A recurrent mutation in bone morphogenetic proteins-2-inducible kinase gene is associated with developmental dysplasia of the hip[J].Exp Ther Med,2017,13(5):1773-1778.

[4]Feldman GJ,Parvizi J,Sawan H,et al.Linkage mapping and whole exome sequencing identify a shared variant in CX3CR1 in a large multi-generation family[J].J Arthroplasty,2014,29(9 Suppl):S238-241.

[5]Mulpuri K,Schaeffer EK,Andrade J,et al.What risk factors and characteristics are associated with late-presenting dislocations of the hip in infants?[J].Clin Orthop Relat Res,2016,474(5):1131-1137.

[6]Ceylaner G,Ceylaner S,Ustunkan F,et al.Autosomal dominant inheritance of congenital dislocation of the hip in 16 members of a family[J].Acta Orthop Traumatol Turc,2008,42(4):289-291.

[7]Li LY,Sun KM,Zhang LJ,et al.Heritability and sibling recurrent risk of developmental dysplasia of the hip in Chinese population[J].Eur J Clin Invest,2013,43(6):589-594.

[8]邱旭升，蔣青.髖關(guān)節(jié)正常生長發(fā)育的研究進展[J]．醫(yī)學綜述，2011，17(16)：2401-2404．

[9]Stafford DA,Monica SD,Harland RM.Follistatin interacts with Noggin in the development of the axial skeleton[J].Mech Dev,2014,131(1):78-85.

[10]Basu S,Whiteamn M,Mattey DL,et al.Raised levels of F(2)-isoprostanes and prostaglandin F(2alpha) in different rheumatic diseases[J].Ann Rheum Dis,2001,60(6):627-631.

[11]Lowe GN,Fu YH,Mcdougall S,et al.Effects of prostaglandins on deoxyribonucleic acid and aggrecan synthesis in the RCJ 3.1C5.18 chondrocyte cell line:role of second messengers[J].Endocrinology,1996,137(6):2208-2216.

[12]Caron MM,Emans PJ,Sanen KA,et al.The role of prostaglandins and COX-Enzymes in chondrogenic differentiation of ATDC5 progenitor cells[J].PLoS One,2016,11(4):e0153162.

[13]Milne SA.(2alpha)receptor expression and signaling in human endometrium:role of PGF(2alpha)in epithelial cell proliferation[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(4):1825-1832.

[14]Wang Y,Middleton F,Horton JA,et al.Microarray analysis of proliferative and hypertrophic growth plate zones identifies differentiation markers and signal pathways[J].Bone,2004,35(6):1273-1293.

[15]Kim J,Shim M.Prostaglandin F2α receptor (FP) signaling regulates Bmp signaling and promotes chondrocyte differentiation[J].Biochim Biophys Acta,2015,1853(2):500-512.

ExpressionchangeofPTGFRgeneinarticularcapsuleandligamentumteresinDDHanditscorrelationwithpathogenesisofDDH*

ZhaoLihua,JiaoQing,ChenMengjie,WangYichen,FanLingyan,MaFeng,YingHao,WangSun△

(DepartmentofOrthopedics,ShanghaiMunicipalChildren′sHospital/AffiliatedChildren′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200062,China)

ObjectiveTo analyze the expression change of PTGFR gene in hip joint tissues of development dysplasia of the hip (DDH) and its correlation with DDH pathogenesis.MethodsEight age-and gender-matched children with DDH (DDH group) and control children (control group) were enrolled for conducting the compaison.The real-time quantitative PCR method and Western-blot method were adopted to detect the PTGFR mRNA and protein expression levels.ResultsPTGFR mRNA expression level in the hip articular capsule and ligamentum teres of the DDH group were significantly decreased compared with those of the control group (t=3.472,2.887,Plt;0.05,).The PTGFR protein expression level in the hip articular capsule and ligamentum teres of the DDH group were significantly decreased compared with those of the control group(t=5.488,3.942,Plt;0.05).ConclusionPTGFR could play an important role in DDH pathogenesis and may be one of DDH pathogenic genes.

joint capsule;round ligament;developmental dysplasia of the hip;prostaglandin F2α receptor gene

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.002

國家自然科學基金項目(81401763)；上海衛(wèi)生計生委科研項目(20144Y0176);上海市科學技術(shù)委員會科研項目(12DZ2295006)；上海交通大學醫(yī)學院“985”計劃基金(YBKL2013008)。

趙利華(1982-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事先天性/發(fā)育性骨關(guān)節(jié)疾病發(fā)病機制研究。△

，E-mail:Wangs@shchildren.com.cn。

R684.2

A

1671-8348(2017)33-4613-03

2017-05-24

2017-07-16)