劉少文 焦如珍 董玉紅 劉彩霞 孫 巖

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室 北京 100091)

綠色木霉和草酸青霉對Hg2+、Zn2+、Cu2+和Pb2+的耐性和吸附特征*

劉少文 焦如珍 董玉紅 劉彩霞 孫 巖

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室 北京 100091)

【目的】 通過對已篩選出的耐較高濃度重金屬的綠色木霉和草酸青霉菌株進(jìn)行Hg2+、Zn2+、Cu2+和Pb2+耐受性和吸附性試驗，為其應(yīng)用于土壤修復(fù)提供科學(xué)參考?！痉椒ā?通過測定重金屬離子對菌株的生長抑制率和半致死濃度(EC50)評價真菌重金屬耐性； 將一定質(zhì)量的菌絲球添加到已知濃度的重金屬離子溶液中，測試菌株對重金屬的吸附速率和吸附量，并對吸附過程進(jìn)行函數(shù)擬合，分析其重金屬吸附特征。【結(jié)果】 2株菌株生物量隨重金屬濃度增加而降低，其過程分2個階段，在金屬離子濃度較低(0～200 mg·L-1)時，生物量下降不明顯或略有上升，當(dāng)重金屬離子濃度大于某個臨界值(400 mg·L-1左右)時，生物量下降迅速； Hg2+、Zn2+、Cu2+和Pb2+對菌株lys2015f1的EC50值分別是158.07、464.02、229.33和209.59 mg·L-1，對菌株lys2015f5的EC50值分別是580.47、572.88、231.85、2 284.01 mg·L-1，因此，菌株lys2015f1對重金屬耐受程度為Zn2+gt;Cu2+gt;Pb2+gt;Hg2+，菌株lys2015f5對重金屬耐受程度為Pb2+gt;Hg2+gt;Zn2+gt;Cu2+。菌株的吸附過程更加擬合準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)模型，由模型速率常數(shù)k2可知，2株菌株吸附重金屬速率排序變化一致，均為Pb2+gt;Hg2+gt;Cu2+gt;Zn2+，菌株lys2015f1通過模型得到的理論Hg2+、Zn2+、Cu2+和Pb2+最大吸附量分別是37.12、14.63、16.62和107.31 mg·g-1，菌株lys2015f5理論最大吸附量47.12、16.50、25.78和201.22 mg·g-1； 吸附的限速步驟是由化學(xué)反應(yīng)控制的，在同等條件下，2株菌株對4種重金屬吸附速率排序均為Hg2+gt;Cu2+gt;Zn2+gt;Pb2+?！窘Y(jié)論】 綠色木霉和草酸青霉菌株具有較高的重金屬耐性和較好的吸附性，現(xiàn)有研究也表明其在生物防治、植物促生、土壤有機物降解等方面具有較好效果，因此2株菌株具有較好的重金屬修復(fù)應(yīng)用潛力。

綠色木霉； 草酸青霉； 重金屬耐性； 生物吸附

重金屬是土壤污染重要來源，重金屬污染具有隱蔽性、積累性、不可逆性和滯留時間長、毒性大等特點(彭強等， 2011)。傳統(tǒng)的土壤重金屬物化修復(fù)辦法有其無法克服的局限性，利用微生物修復(fù)重金屬污染，越來越受到人們的重視(Adamoetal., 2014)。

土壤微生物修復(fù)技術(shù)是指培養(yǎng)土著或添加外源微生物，通過促進(jìn)微生物新陳代謝活動，促使污染物降解的方法(Tyagietal.,2011)。研究表明，針對污染物培養(yǎng)特定功能微生物，并使微生物活性和數(shù)量維持在一定水平，可有效降低土壤中污染物的含量(Kumaretal.,2011)。真菌在微生物修復(fù)領(lǐng)域，相比于細(xì)菌，具有生物活性強、抗逆性強、對營養(yǎng)條件要求簡單、生物量大等優(yōu)勢。多種真菌都有對重金屬污染的修復(fù)能力，如樹脂枝孢霉(Cladosporiumresinae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、類酵母(Aureobasidiumpullulans)、白腐菌(Funaliatrogii)、靈芝(Ganodermalucidum)、青霉(Penicilliumsp.)、木霉(Trichodermasp.)(Sayetal., 2003)。

草酸青霉(Penicilliumoxalicum)屬半知菌綱(Fungi Imperficti)、殼霉目(Sphaeropsidales)、杯霉科(Discellaceae)，是一種常見的土壤真菌，具有促進(jìn)植物生長、解磷等作用。王超(2013)研究了草酸青霉在Cu2+、Zn2+脅迫下生物學(xué)特征及錳過氧化氫酶、加氧酶的活性變化，結(jié)果表明高濃度的重金屬均顯著抑制酶的活性，Cu2+濃度、Zn2+濃度分別為125、1 250 mg·L-1時，草酸青霉停止生長。Abedin(2014)研究了草酸青霉菌株JQ624873對Cu2+和Ni2+的吸附過程，結(jié)果表明草酸青霉菌株JQ624873對Cu2+吸附速率的最大影響因子為重金屬離子濃度，對Ni2+的吸附速率影響較大的因素為溫度和培養(yǎng)時間； 經(jīng)過一系列的條件優(yōu)化，JQ624873菌株對Cu2+和Ni2+的最大吸附速率可達(dá)到94%和80%。木霉屬真菌主要生長于溫暖潮濕的生境中，如農(nóng)田、坡溝、森林、草地等，可利用腐敗植物殘體和其他菌類子實體作為生長基質(zhì)(Doi, 2006)。綠色木霉(T.viride)對重金屬耐受能力較強，具備一定的吸附能力，在土壤重金屬污染修復(fù)中具有較高的應(yīng)用潛力。Siddiquee 等(2013)對比了3種常見木霉屬菌黃綠木霉(T.aureoviride)、哈茨木霉(T.harzianuml)和綠色木霉對重金屬Cu2+、Zn2+、Pb2+、Ni3+離子吸附性和耐受性，結(jié)果表明，綠色木霉在其中表現(xiàn)出最高的耐受性，耐受最大濃度為1 200 mg·L-1(Pb2+、Ni3+)。綜上，綠色木霉和草酸青霉在纖維素降解、生物防治、發(fā)酵生產(chǎn)、解磷等方面具有較好的應(yīng)用效果，對人類和作物不存在毒害作用，為應(yīng)用較廣的功能微生物，但關(guān)于綠色木霉和草酸青霉在土壤重金屬污染防治方面的研究和應(yīng)用還鮮有報到。

綠色木霉和草酸青霉人工培育技術(shù)成熟，對多種病原菌具有較強的抑制作用，同時對重金屬有較強的耐受性和吸附性。在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系中，可有效降低重金屬對植物生長的影響，增強植物修復(fù)重金屬污染土壤的潛力。森林是重要的陸地生態(tài)系統(tǒng)，是物質(zhì)和能量循環(huán)的重要樞紐。林木個體大，適應(yīng)力強，生活周期長，對營養(yǎng)要求相對較低，是植物修復(fù)的理想材料。很多研究表明，微生物可分泌質(zhì)子，改變林木根際酸堿環(huán)境，進(jìn)而影響林木對重金屬的吸收。同時，微生物可分泌有機酸、蛋白質(zhì)和多糖等，這些分泌物可與重金屬結(jié)合，降低重金屬對林木的毒害作用(劉少文， 2016)。筆者通過系統(tǒng)研究草酸青霉和綠色木霉對重金屬(Hg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+)耐受性和吸附性特征，為2菌株應(yīng)用于重金屬污染修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1 菌種來源 從汞污染土樣中提取菌株，經(jīng)分離、純化、并進(jìn)行DNA鑒定后，接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，4℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 固液PDA培養(yǎng)基，根據(jù)試驗梯度設(shè)計要求添加HgCl2、ZnCl2、CuSO4·5H2O、 (CH3COO)2Pb(分析純)配制成特定濃度的重金屬培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器 生化培養(yǎng)箱(LRH-150，上海)、超凈工作臺(DE-CJ-1 N，蘇州)、自動滅菌鍋(MLS-3780，日本)、原子吸收分光光度計(PEAA700，USA)、電感耦合等離子光譜儀(OPTIMA 8000DV，美國)

1.2真菌的重金屬離子耐性檢測

2株真菌分別為綠色木霉(編號lys2015f1)、草酸青霉(編號lys2015f5)，進(jìn)行耐性測試所用藥劑分別為HgCl2、ZnCl2、CuSO4·5H2O、(CH3COO)2Pb。每種重金屬溶液(以重金屬離子計)設(shè)置7個濃度梯度(0、200、400、600、800、1 000、1 200 mg·L-1)，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。活化菌株3次，在PDA平板上選擇生長較旺盛的菌落，利用滅菌后的打孔器在菌落邊緣打下直徑1.2 cm的菌絲培養(yǎng)物，置于含有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在28 ℃和初始pH值為7的條件下靜置培養(yǎng)約96 h。

真菌生物量的測定方法為菌絲干質(zhì)量法： 稱取干燥的濾紙質(zhì)量，將培養(yǎng)基加到濾紙上，真空抽濾，去掉培養(yǎng)基液體，濾出全部的菌絲體，蒸餾水沖洗3次，洗凈菌絲表面粘連的培養(yǎng)基。在60 ℃下烘箱內(nèi)，將菌絲與濾紙烘干至恒質(zhì)量。從烘箱取出后，放入干燥器中冷卻，電子分析天平稱質(zhì)量，可得菌絲體干質(zhì)量(劉少文， 2016)。

按公式計算可得每種重金屬對菌株lys2015f1和lys2015f5的抑制率效率，得半致死濃度值(EC50)，依照計算結(jié)果求得毒力方程。

生長抑制率=(對照菌絲干質(zhì)量-處理菌絲干質(zhì)量)/對照菌絲干質(zhì)量×100%。

1.3真菌的重金屬離子吸附特征

1.3.1 菌絲球的制備 接種后真菌于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4天，在超凈工作臺中，將菌絲接種到內(nèi)含已滅菌玻璃珠和100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，在180 r·min-1、28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3～4天，待其長成菌絲球(王國惠等， 2007)。用無菌紗布在超凈工作臺內(nèi)過濾獲得菌絲球，無菌水將培養(yǎng)液沖洗干凈，放入滅菌后的0.9%氯化鈉溶液中，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。用濾紙吸干菌絲球表面水分，用于吸附試驗(馮宏等， 2013)。利用烘干法測量菌絲干質(zhì)量，計算可得2種菌絲球的干濕質(zhì)量比值。

1.3.2 菌絲球投加量對重金屬離子吸附的影響 取初始濃度為100 mg·L-1、pH值為5的重金屬(Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+)溶液各30 mL，加到100 mL錐形瓶中，根據(jù)菌絲球干濕比，按干質(zhì)量為0.5、1、2 g·L-1加入菌絲球。28 ℃、60 r·min-1條件下進(jìn)行重金屬吸附試驗，設(shè)置空白對照，每組重復(fù)3次。720 min后吸附完成，將菌液在12 000 r·min-1離心3 min，所得上清液過0.45 μm無菌濾膜，濾液的重金屬含量用電感耦合等離子光譜儀和原子吸收分光光度計測得。

1.3.3 真菌對重金屬離子的吸附動力學(xué)特征 按上述試驗條件設(shè)置，添加特定比例的菌絲球，進(jìn)行菌絲重金屬吸附試驗。分別在10、30、60、100、120、240、360、720、1 440 min進(jìn)行取樣，并檢測其重金屬離子濃度。數(shù)據(jù)錄入Origin，進(jìn)行函數(shù)擬合與數(shù)據(jù)分析。計算公式：

吸附速率W=(C0-Ct)/C0，

吸附量Q=(C0-Ct)V/m。

式中，C0為所測溶液中離子的初始濃度(mg·L-1)；Ct為在t時段離子的瞬時濃度(mg·L-1)；V為吸附溶液體積(L)；m為菌絲干質(zhì)量g；Q為吸附容量，即每克干菌絲吸附該金屬離子的質(zhì)量(mg·g-1)。

將試驗所測得數(shù)據(jù)，擬合準(zhǔn)一級吸附動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)模型，由擬合程度判斷重金屬離子的吸附特征(Wuetal., 2009)。

準(zhǔn)一級吸附動力學(xué)表達(dá)式：

準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)表達(dá)式：

式中，k1為準(zhǔn)一級吸附速率常數(shù)；t為吸附所用時間(min)；qt為t時刻下吸附容量(mg·g-1)；qe為吸附平衡時吸附容量(mg·g-1)；k2為準(zhǔn)二級吸附速率常數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Origin8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株對重金屬離子的耐性

2.1.1 重金屬離子對菌株生物量的影響 隨著重金屬離子濃度的增加，菌株生物量不斷下降，直至停止生長(圖1)。抑制效果在重金屬離子濃度較低時(0～100 mg·L-1)即出現(xiàn)，并且4種重金屬離子在100 mg·L-1點位上的菌絲干質(zhì)量相差不大。隨著重濃度的不斷增加，金屬離子對2個試驗菌株的抑制效果發(fā)生變化。

Hg2+對lys2015f1菌株具有較強的抑制效果，當(dāng)重金屬離子濃度大于200 mg·L-1時，抑制效果更為明顯(Plt;0.05)。當(dāng)Hg2+濃度為400 mg·L-1時，菌株停止生長。Zn2+溶液在0～200 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對菌株lys2015f1抑制效果不明顯(Pgt;0.05);當(dāng)濃度超過200 mg·L-1時，菌株生物量隨Zn2+濃度的增加而降低；當(dāng)濃度達(dá)到1 000 mg·L-1時，菌株無法生長。 Cu2+對該菌株生物量的抑制效果隨金屬濃度的增加而加大，當(dāng)濃度為800 mg·L-1時，菌株停止生長。隨著Pb2+濃度的升高，菌株生物量受到抑制不斷下降，下降幅度在試驗各個階段都比較穩(wěn)定，當(dāng)濃度為800 mg·L-1時，菌株無法生長。

圖1 不同金屬離子濃度下菌株lys2015f1生物量的變化Fig.1 The change of biomass of fungi strain lys2015f1 with different metal ions concentrations

對于lys2015f5菌株，隨重金屬離子濃度的增加，菌株生物量呈不斷下降的趨勢(圖2)，可分為2個較為明顯的階段。當(dāng)4種重金屬離子濃度為在0～400 mg·L-1之間時，對lys2015f5菌株生物量的抑制效果不明顯(Pgt;0.05)； 當(dāng)濃度大于400 mg·L-1時是，對該菌株生物量增長的抑制作用顯著增強(Plt;0.05)。 Hg2+濃度大于400 mg·L-1時效果逐漸明顯，當(dāng)濃度為1 200 mg·L-1菌株停止生長。 Zn2+濃度在0～400 mg·L-1范圍內(nèi)，菌株lys2015f5生物量增加，當(dāng)濃度超過400 mg·L-1時，菌株生物量隨濃度的增加而顯著降低(Plt;0.05)。 ，當(dāng)濃度達(dá)1 000 mg·L-1時，菌株無法生長。 Cu2+濃度小于400 mg·L-1時抑制效果不顯著(Pgt;0.05)，尤其在200～400 mg·L-1范圍內(nèi)菌株生物量反而有所增加；但當(dāng)濃度大于400 mg·L-1時，抑制效果迅速增強；濃度800 mg·L-1時，菌株無法生長。 隨著溶液Pb2+濃度增加，菌株生物量持續(xù)減少，但是降低幅度不大；當(dāng)Pb2+濃度為1 000 mg·L-1時，菌絲的干質(zhì)量為0.21 g。

圖2 不同金屬離子濃度下菌株lys2015f5生物量的變化Fig.2 The change of fungi strain lys2015f5 with different metal ions concentrations

2.1.2 重金屬離子對2株真菌的毒性 表1中毒力方程表明： 菌株lys2015f1和lys2015f5的生長抑制率均與重金屬離子的對數(shù)濃度成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)最小為0.709 5、0.818 6，菌株生長抑制率和重金屬離子對數(shù)濃度有較高相關(guān)性。

重金屬Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+對菌株lys2015f1的EC50值分別是158.07、464.02、229.33、209.59 mg·L-1，由EC50評估的4種重金屬對菌株生長抑制能力為Hg2+gt;Pb2+gt;Cu2+gt;Zn2+，lys2015f1菌株對Zn2+耐受能力最強，為耐受能力最小Hg2+的2.94倍，菌株對Pb2+和Cu2+的耐受能力較接近； Hg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+對菌株lys2015f5的EC50值分別是580.47、572.88、231.85、2 284.01 mg·L-1，由EC50評估的4種重金屬對菌株生長抑制率為Cu2+gt;Zn2+gt;Hg2+gt;Pb2+。

由圖3可知，lys2015f1菌株對重金屬Hg2+、Zn2+、Pb2+耐受能力均顯著小于lys2015f5(Plt;0.05)，其中Pb2+差別最明顯，Cu2+差別不顯著。在本試驗相同培養(yǎng)、測定條件下，lys2015f5菌株的重金屬(Hg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+)EC50值分別是lys2015f1菌株的3.67、1.23、1.01、10.89倍。

表1 重金屬對菌株的毒力效應(yīng)①Tab.1 Toxicity of Heavy metals against fungi

①x:重金屬離子濃度的自然對數(shù)值;y:菌株生長抑制率。x:the natural logarithm of the concentration of heavy metal ions;y: the growth inhibition rate.

圖3 2株菌株的各重金屬EC50值的對比Fig.3 The EC50 value of each heavy metalion on two fungi strains

2.2真菌對重金屬的吸附特征

2.2.1 菌絲球投加量對重金屬吸附的影響 在pH值為5、初始重金屬離子濃度為100 mg·L-1、吸附時間為720 min、溫度為28 ℃條件下，菌絲球投加量對重金屬吸附的影響結(jié)果如圖4所示。隨著菌絲干質(zhì)量濃度的增加，菌絲對重金屬的吸附速率呈上升狀態(tài)。在菌絲濃度為0～1 g·L-1時，這種增加趨勢表現(xiàn)明顯。在此濃度范圍內(nèi)，隨著菌絲濃度的增加，重金屬吸附位點增多，菌絲有更大可能同金屬離子發(fā)生吸附作用，故而增大吸附速率(Ozeretal., 2009)。當(dāng)菌絲濃度大于1 g·L-1時，吸附速率變動趨勢發(fā)生不同，在2組試驗中Cu2+和Hg2+的吸附速率均呈下降趨勢，這可能由于菌絲濃度過高，菌絲體相互聚集、吸附，菌絲吸附位點利用效率降低，這說明菌絲對重金屬的吸附力并非隨菌絲投加量的增加而不斷增加，在此過程中存在最佳的吸附濃度，若超過此濃度，菌絲的吸附速率不僅會下降，還造成菌絲的浪費(葉佩青等， 2012)。綜合分析，確定1 g·L-1菌絲干質(zhì)量為本試驗最佳菌絲投放量。

圖4 不同干質(zhì)量濃度下菌株lys2015f1(a)和lys2015f5(b)的重金屬吸附效率Fig.4 The effects of different dosages of mycelia pellet lys2015f1(a) and lys2015f5(b) on the adsorption rate to heavy metal

2.2.2 吸附時間對吸附效果的影響 在初始重金屬離子濃度為100 mg·L-1、pH為5、菌絲球干質(zhì)量投加量為1 g·L-1、28 ℃條件下，吸附時間對吸附效果的影響見圖5，2株試驗菌株對4種金屬離子的吸附過程特征表現(xiàn)出較高的一致性。首先，在0～360 min的過程中，菌絲重金屬吸附速率隨時間的增加而迅速增加，之后吸附率的增加較為緩慢，當(dāng)吸附時間為720 min時，吸附速率達(dá)到最大值。其中：lys2015f1菌株對Hg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+最大吸附速率分別是36.01%、18.98%、20.32%、36.38%， lys2015f5菌株對Hg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+最大吸附速率分別是43.32%、22.51%、30.71%、69.16%。吸附效果隨時間變化的規(guī)律表明：在吸附初始階段，重金屬離子濃度較高，吸附過程主要發(fā)生菌體表面吸附位點和官能團對重金屬離子的吸附，該過程可逆、吸附速率快、所用時間短； 隨著吸附的進(jìn)行，重金屬離子濃度降低，菌絲表面大部分吸附位點被占據(jù)，吸附速率變緩(Srivastavaetal., 2006； 李蘭松等， 2013)。下一階段，由于細(xì)胞發(fā)生主動運輸作用，金屬離子慢慢進(jìn)入菌體內(nèi)部，并不斷累積，發(fā)生不可逆的吸附過程，此過程吸附速率增加較為緩慢(黃志鈞等， 2012)。當(dāng)吸附時間為720 min時，吸附過程達(dá)到平衡。

圖5 不同吸附時間下菌株lys2015f1(a)和lys2015f5(b)重金屬吸附速率Fig.5 Effects of time of fungi lys2015f1(a) and lys2015f5(b) on the adsorption rate

2株真菌的重金屬吸附速率比較見圖6，菌株lys2015f5對4種重金屬的吸附速率均顯著高于

lys2015f1，結(jié)合菌株耐性測試結(jié)果可知，菌株lys2015f5對重金屬耐性和吸附性指標(biāo)均高于lys2015f1(Plt;0.05)。就這4種金屬離子而言，2株菌株的最大吸附速率對比排序一致，為Pb2+gt;Hg2+gt;Cu2+gt;Zn2+。

圖6 菌株lys2015f1和lys2015f5重金屬吸附速率Fig.6 The adsorption rate of fungi lys2015f1 and lys2015f5

2.2.3 吸附動力學(xué)模型特征 依據(jù)菌株lys2015f1和lys2015f5吸附Pb2+、Cu2+、Hg2+、Zn2+試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)一級吸附動力學(xué)模型、準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)模型的擬合(表2)。同準(zhǔn)一級動力學(xué)模型對比，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型R2值均大于0.9，最小值為0.93。由此可見，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型對數(shù)據(jù)的擬合程度好于準(zhǔn)一級動力學(xué)模型。

另外，通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)，實際平衡吸附量和準(zhǔn)一級理論平衡吸附量(qe)存在顯著差異，與準(zhǔn)二級理論吸附量差異不顯著(Plt;0.05)(圖7)。由此可知，2株菌株對重金屬的吸附過程，更加吻合二級反應(yīng)規(guī)律。因準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)模型的理論基礎(chǔ)為化學(xué)吸附假設(shè)(Daveetal., 2009)，表明本試驗吸附的限速步驟是由化學(xué)反應(yīng)控制，吸附速率與反應(yīng)液中重金屬離子濃度、吸附劑表面活性位點濃度相關(guān)。

表2 菌株吸附重金屬的準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型相關(guān)參數(shù)①Tab.2 Parameters of the pseudo-first-order and pseudo-second-order kinetic models for the biosorption of heavy metals by fungi

①qe:平衡吸附量擬合值(mg·g-1) The equilibrium absorption capacity(mg·g-1)；k1：準(zhǔn)一級吸附速率常數(shù)(min-1) The pseudo-first-order rate constant(min-1)；k2：準(zhǔn)二級吸附速率常數(shù)(g·mg-1min-1) The pseudo-second-order rate constant(g·mg-1min-1)；R2：線性擬合判定系數(shù)The correlation coefficient.

圖7 菌株lys2015f1(A)和lys2015f5(B)準(zhǔn)一級、二級、實際最大吸附量Fig.7 The peseudo-first-order,pseudo-second-order and the fact maximal adsorption capacity of lys2015f1 (A) and lys2015f5(B)

吸附速率常數(shù)k2，可反應(yīng)吸附過程速率。在相同試驗條件下，2株菌株對以上4種重金屬吸附速率，為Hg2+gt;Cu2+gt;Zn2+gt;Pb2+。lys2015f1菌株吸附重金屬Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+的反應(yīng)速率是lys2015f5菌株的1.78、1.19、1.80、0.48倍。

3 討論

杜愛雪等(2008)篩選出的青霉菌對Zn2+、Cu2+、Pb2+耐性的順序分別為Zn2+gt;Cu2+gt;Pb2+，而本試驗草酸青霉的lys2015f5菌株耐性順序為Pb2+gt;Hg2+gt;Zn2+gt;Cu2+，在Pb2+上略有差異。原因分析可能為試驗所用Pb2+的藥劑不同，本研究所用(CH3COO)2Pb為可溶，而杜愛雪等試驗所用PbCl2為微溶。

對于青霉菌屬真菌在重金屬吸附方面的研究比較多，涉及離子包括Zn2+、Cd2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、Ni2+、Hg2+等。本試驗經(jīng)準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)模擬，計算出Hg2+最大吸附量為47.12 mg·g-1，與Say等(2003)54.8 mg·g-1較為接近； Zn2+吸附試驗結(jié)果為16.50 mg·g-1，略高于前人研究的6.5、6.8、13 mg·g-1； Cu2+的最大吸附量為25.78 mg·g-1，基本符合其他研究數(shù)據(jù)范圍(9～92 mg·g-1)； Pb2+的最大吸附量為201.22 mg·g-1，符合其他研究數(shù)據(jù)范圍(96～298 mg·g-1)，且差異不大(Niuetal., 1993;Tanetal., 2003； Dengetal., 2005； 徐雪芹等, 2008； 王建龍等， 2010)。

木霉屬真菌在自然界中廣泛分布，其生長迅速，適應(yīng)力強，對營養(yǎng)要素要求低，因此具有很高的應(yīng)用潛力，但木霉屬菌用于吸附重金屬方面的研究明顯少于青霉屬菌。本試驗結(jié)果表明，菌株lys2015f1(綠色木霉)對在試驗涉及的幾種重金屬的耐性和吸附性均小于菌株lys2015f5(草酸青霉)。胡亮等(2007)利用在含鋅重金屬廢液中分離、篩選的綠色木霉C-1，進(jìn)行Zn2+吸附試驗，研究相關(guān)因素對吸附速率的影響。結(jié)果顯示，菌絲體經(jīng)酸或堿預(yù)處理后， Zn2+吸附能力得到顯著提升； 當(dāng)溶液Zn2+初始濃度在60 mg·L-1、干菌量為3 g·L-1、pH值為5.5的條件下，常溫吸附60 min后，污水可以達(dá)到2 mg·L-1的相關(guān)排放標(biāo)準(zhǔn)。本試驗表明，綠色木霉對Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+的耐受程度可基本滿足生物修復(fù)的實際需要。此外，綠色木霉還可促進(jìn)植物生長、防治植物病蟲害、降解土壤內(nèi)有機物等作用，可見其在重金屬污染生物修復(fù)方面具有較大的潛力。

我國具有豐富的樹木資源，很多樹種被證實具有很好的重金屬耐受性和吸附性。李庚飛等(2013)對潼關(guān)縣黃金礦區(qū)6種代表性樹木進(jìn)行分析，分別測定枝、根、葉和根際土壤鎘、銅和鋅的濃度含量。結(jié)果顯示，刺槐(Rabiniapseudoacacia)對Zn的轉(zhuǎn)移系數(shù)為1.40，富集系數(shù)為10.61，屬Zn的超富集植物； 構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)對Cu的轉(zhuǎn)移系數(shù)0.87，富集系數(shù)為0.56，在所測樹種中Cu富集能力最強。在對Cd的吸收中，桑(Morusalba)樹的轉(zhuǎn)移系數(shù)可達(dá)到8.90，刺槐為1.44。國內(nèi)應(yīng)用林木修復(fù)重金屬污染土壤的研究起步較晚，但如瑞典、美國等有對鎘、鉛的污染土壤利用柳樹修復(fù)的相關(guān)工程案例(Berndesetal., 2004)。綠色木霉和草酸青霉能分泌有機酸，降低土壤pH，提高重金屬生物活性，增強樹木對重金屬的吸收能力。同時2種微生物可以將難溶性無機磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，提高土壤肥力，并抑制多種植物病害的發(fā)生，有助于增強林木對重金屬污染的修復(fù)作用(Gongetal., 2014)。

本試驗系統(tǒng)分析研究了2株菌株對4種重金屬的耐受性和吸附性，2株菌株的試驗條件一致，相似指標(biāo)具有可比性。本試驗研究為綠色木霉和草酸青霉用于重金屬污染修復(fù)提供了科學(xué)的參考。但因條件所限，本研究還有諸多不足：試驗中只驗證了單一因子變量，沒有對菌種混合修復(fù)、重金屬的復(fù)合污染等方面進(jìn)行研究； 在2株微生物的吸附重金屬機制、促進(jìn)植物修復(fù)重金屬污染機制等領(lǐng)域，也有待進(jìn)一步探尋； 此外，本試驗為實驗室論證階段，沒有進(jìn)行較大規(guī)模室外試驗，對2株微生物在室外復(fù)雜條件下的應(yīng)用效果，還有待研究。

4 結(jié)論

草酸青霉和綠色木霉對重金屬Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+耐受性的變化趨勢可分為2個階段。在金屬離子濃度小于100 mg·L-1時，重金屬離子濃度對菌株生物量影響較小。在此階段，金屬離子會優(yōu)先與微生物表面結(jié)合，對菌株毒害作用相對較?。划?dāng)離子濃度大于200 mg·L-1時，對綠色木霉生物量增長的抑制作用顯著增強；當(dāng)離子濃度大于400 mg·L-1時，對草酸青霉生物量的抑制顯著增強。在此階段，金屬離子通過主動運輸作用進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)部，并不斷積累，對菌株的毒害作用不斷增強。微生物的生長、代謝活動受到抑制，直到裂解死亡。

通過EC50分析草酸青霉和綠色木霉對4種重金屬耐受性。Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+對草酸青霉的EC50值分別為580.47、231.85、572.88、2 284.01 mg·L-1，EC50值較大表示菌株對該種重金屬的耐受能力較強，因此，草酸青霉對4種重金屬的耐性能力排序為Pb2+gt;Hg2+gt;Zn2+gt;Cu2+；Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+對綠色木霉的EC50值對分別為158.07、229.33、464.02、209.59 mg·L-1，綠色木霉對4種重金屬的耐性能力排序為Zn2+gt;Cu2+gt;Pb2+gt;Hg2+。

重金屬吸附試驗結(jié)果顯示，草酸青霉和綠色木霉對4種重金屬最大吸附速率排序一致，均為Pb2+gt;Hg2+gt;Cu2+gt;Zn2+。通過數(shù)據(jù)分析可知，草酸青霉對Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+的吸附速率顯著高于綠色木霉(Plt;0.05)。對2菌株的吸附過程進(jìn)行函數(shù)擬合，可知菌株吸附重金屬的反應(yīng)過程更加符合準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)模型的變化規(guī)律。通過該模型得出草酸青霉對Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+的最大理論吸附量為47.12、25.78、16.50、201.22 mg·g-1，綠色木霉的理論最大吸附量分別是37.12、16.62、14.63、107.31 mg·g-1。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

ToleranceandBiosorptionCharacteristicsofPenicilliumoxalicumandTrichodermaviridetoMercury,Zinc,CopperandLead

Liu Shaowen Jiao Ruzhen Dong Yuhong Liu Caixia Sun Yan

(KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationofStateForestryAdministrationStateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingResearchInstituteofForestry,CAFBeijing100091)

【Objective】The study aims to research biosorption and tolerance of Hg2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+byPenicilliumoxalicumandTrichodermaviride, and hopes to provide a scientific reference for its soil remediation. 【Method】 The heavy metal- tolerance of fungi was evaluated by measuring the growth inhibition rate of the two fungal varieties and the medial lethal concentration (EC50) of heavy metal ions. Firstly, a certain amount of mycelium balls were put into the heavy metal ion solution of known concentration. A few of hours later, the ion concentration was analyzed, and then the heavy metal adsorption efficiency and adsorption quantity were calculated, and the adsorption process was fitted with a function model.【Result】The results showed that biomass of the two strains decreased with increasing concentration of heavy metals, and the process could be divided into two stages. When the metal ions concentration was under 200 mg·L-1, the biomass did not obviously decline or slightly increased. When the concentration was higher than critical value (about 400 mg·L-1), the biomass dropped rapidly. The EC50value of strain lys2015f1 in Hg2+, Zn2+, Cu2+, and Pb2+solution was 158.07, 464.02, 229.33, and 209.59 mg·L-1, and it for strain lys2015f5 was 580.47, 572.88, 231.85, and 2 284.01 mg·L-1. Thus, the tolerance degree of strain lys2015f1 to heavy metals was in the order of: Zn2+gt;Cu2+gt;Pb2+gt;Hg2+, and the tolerance level of strain lys2015f5 was Pb2+gt;Hg2+gt;Zn2+gt;Cu2+. The adsorption process was more fitted to the pseudo-second-order kinetic model. According to the model rate constant k2value, the adsorption rate of two strains was obtained, and the two strains had the same order in adsorption rate for those metal ions of Pb2+gt;Hg2+gt;Cu2+gt;Zn2+. The theoretical value of the maximum adsorptions to (Hg2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+) from this model for lys2015f1 was 37.12, 14.63, 16.62, and 107.31 mg·g-1, and for lys2015f5 was 47.12, 16.50, 25.78, and 201.22 mg·g-1. The rate limiting step of adsorption was controlled by chemical reactions. In the same conditions, the order of two strains for heavy metal adsorption rate was Hg2+gt;Cu2+gt;Zn2+gt;Pb2+.【Conclusion】The two strains have high heavy metal tolerance and adsorption. Combined with the functions of biological control, plant growth, degrading soil organic matter etc, the strains should have high potential abilities in remediation of heavy metals pollution.

Penicilliumoxalicum；Trichodermaviride； heavy metal resistance； biosorption

10.11707/j.1001-7488.20171011

2015-12-25;

2016-04-14

國家林業(yè)局引進(jìn)國際先進(jìn)林業(yè)科學(xué)技術(shù)項目“生化黃腐酸高效發(fā)酵菌種及生產(chǎn)工藝引進(jìn)”(2013-4-54)。

*焦如珍為通訊作者。

S714

A

1001-7488(2017)10-0100-09